El género Heterodera pertenece al grupo de los nematodos formadores de quistes (NFQ), se caracterizan por tener hembras obesas citriformes, que retienen los huevos dentro de su cuerpo, tras la muerte, su cutícula sufre cambios y se engrosa formando el quiste, que protege a los huevos de condiciones ambientales adversas, éste puede persistir viable en el suelo hasta 30 años (^{Siddiqi, 2000}; ^{Subbotin et al., 2010}; ^{Manzanilla-López y Marbán-Mendoza, 2012}). Este nematodo es de importancia económica para la agricultura debido a que ocasiona pérdidas en el rendimiento de los cultivos, estas pérdidas se deben a que induce sitios de alimentación conocidos como sincitios que alteran el sistema radicular de las plantas, esto limita la absorción de agua y nutrientes (^{Sharma, 1998}; ^{Subbotin et al., 2010}; ^{Subbotin y Franco, 2012}). ^{Tovar-Soto et al. (2009}, ²⁰¹⁰⁾ encontraron un NFQ del género Heterodera asociado al cultivo de zanahoria (Daucus carota) en la zona agrícola del Valle de Tepeaca, Puebla, conformada por varios municipios productores (^{Lugo-Morín et al., 2010}). Para el 2014 Puebla ocupó el segundo lugar a nivel nacional como productor de zanahoria, con una cosecha de 27, 109 ton (^{SAGARPA, 2016}). Aunque se ha detectado este nematodo en la zona, aún se desconoce la distribución que guarda en algunos municipios productores de zanahoria, también se desconoce su ciclo de vida y las alteraciones histológicas que induce en las raíces, datos indispensables para poder establecer tácticas de control. El objetivo consistió en estimar la distribución que tiene el NFQ Heterodera sp. en algunos municipios productores de zanahoria del Valle de Tepeaca; así como, determinar el tiempo de desarrollo de las diferentes fases del ciclo de vida y describir las alteraciones histológicas que induce en las raíces de esta hortaliza. Durante 2008-2016 se muestrearon 28 parcelas con zanahoria en los municipios de Acatzingo, Los Reyes de Juárez, Quecholac, San Nicolás Buenos Aires, San Salvador el Seco y Tepeaca. En cada parcela seleccionada se tomó aleatoriamente una muestra, conformada por 10 submuestras de suelo (200-250 g) y plantas (3-6) en diferente etapa fenológica, esto conformó la muestra representativa (2-2.5 kg de suelo y 30-60 plantas) (^{De la Jara-Alcocer et al., 1994}). De cada muestra, las plantas se separaron del suelo, las raíces se lavaron con agua, luego se pesaron 5 g y se colocaron en una caja Petri, en donde se observaron en un microscopio estereoscópico Motic para localizar hembras blancas adheridas a éstas. Los quistes se obtuvieron a partir de 200 cm³ de suelo previamente secado de cada muestra, utilizando la técnica de flotación de Fenwick (^{De la Jara-Alcocer et al., 1994}). Los quistes separados en cada muestra se caracterizaron para observar forma, color y presencia de cono vulvar (n=20), luego se realizaron cortes para reconocer el tipo de fenestración (^{Subbotin et al., 2010}). Para determinar el tiempo de desarrollo de cada una de las fases del ciclo del nematodo en la raíz, se montó en invernadero un experimento con 36 bolsas de plástico de tres kg con suelo naturalmente infestado, procedente de un campo de zanahoria del municipio de Acatzingo. En cada bolsa se sembraron 10 semillas de zanahoria cv. Mexicana, mismas que se mantuvieron a 20-25 °C. Diez días posteriores a la germinación (DPG), se sacaron las plantas de tres bolsas, sus raíces se lavaron con agua y se tiñeron con fucsina ácida-lactoglicerol, posteriormente se colocaron en una caja Petri para observar las fases del nematodo con ayuda de un microscopio estereoscópico Motic. Cada siete días durante 12 semanas se siguió el mismo procedimiento con las bolsas restantes (^{Byrd et al., 1983}).Para el estudio histopatológico, se pusieron seis macetas de unicel con 1 kg de suelo tindalizado, en cada una se sembraron 10 semillas de zanahoria cv. Mexicana. Tres de las macetas se inocularon con huevos y juveniles del segundo estadio (J2) del nematodo, las otras tres se dejaron sin inocular (testigos). Las macetas se dejaron durante 60 días en el invernadero a 20-25 °C; después de ese tiempo, las plantas fueron sacadas de las macetas, sus raíces se lavaron, luego, se fijaron con una mezcla de etanol-formol-ácido acético (FAA) en donde se dejaron por 48 h. En seguida se cortaron en trozos de 1-3 mm, se deshidrataron en etanol a diferentes concentraciones (70, 80, 90, 96 y 100 %), en donde se dejaron 15 min para cada concentración. Luego, se transparentaron con etanol absoluto-xilol y xilol 15 min en cada uno. Posteriormente se incluyeron en parafinas con diferentes puntos de fusión (52-54, 54-56 y 56-58 °C) (^{Carvajal-Sandoval, 1996}). Una vez incluido el material, se realizaron cortes seriados de 10 μm de espesor en el plano longitudinal y transversal con ayuda de un micrótomo de rotación marca Reichert. Los cortes se montaron en portaobjetos mediante un baño de flotación en una mezcla con agua y gelatina. Por último, los cortes se desparafinaron con xilol y etanol absoluto-xilol por 5 min en cada uno y después se pasaron a etanol a diferentes concentraciones (100, 96 y 70 %) 15 min cada uno. Finalmente se enjuagaron por 10 min en agua destilada, se tiñeron con fucsina-verde rápido, se deshidrataron con dos cambios de etanol absoluto y etanol absoluto-xilol durante 15 min cada uno y se montaron con resina sintética para su análisis (^{Carvajal-Sandoval, 1996}).

Las raíces de zanahoria de 17 parcelas muestreadas (61 %) mostraron hembras blancas adheridas, aperladas citriformes, con presencia de cono vulvar y una matriz gelatinosa prominente en donde retienen parte de los huevos, lo que indica que la zanahoria es un buen hospedante en donde completa su ciclo de vida (Figura 1A y D). También en raíces se encontraron quistes jóvenes adheridos, un alto porcentaje mostró la matriz gelatinosa antes referida en hembras; éstos también fueron citriformes y con cono vulvar. Además, se obtuvieron quistes a partir de suelo en el 93 % de las parcelas estudiadas, cuya densidad poblacional osciló de 3 a 1391 quistes en 200 cm³ de suelo (Cuadro 1) (Figura 1A, B y D). Al efectuar cortes a nivel del cono vulvar, aparece un puente con ambifenestras (Figura 1C), con estos criterios se confirmó que la población encontrada en las parcelas muestreadas con zanahoria en la zona de estudio corresponde al género Heterodera (^{Sharma, 1998}; ^{Subbotin et al., 2010}).

Figura 1. Quistes y hembras blancas de Heterodera sp. A) Hembras y quistes con masas de huevos. B) Quistes de diferente tamaño. Las flechas señalan las masas de huevos. C) Corte de un quiste a nivel del cono vulvar donde se observa la ambifenestra y el puente. D) Raíces de zanahoria con hembras y quistes adheridos con masas de huevos. H= Hembra, Q= Quiste, MH= Masa de huevos, P= Puente. 

Cuadro 1. Número de quistes de Heterodera sp. por 200 cm³ de suelo de parcelas en la zona de estudio y presencia o ausencia de hembras blancas adheridas a las raíces de zanahoria. 

*Los datos de georreferenciación no fueron tomados.

En el ciclo de vida, los J2 aparecieron dentro de las raíces laterales 10 DPG; así mismo, a los 24 y 38 DPG aparecieron los estadios J3 y J4, respectivamente (Figura 2). Por su parte, los machos se observaron en las raíces dentro de una exuvia a los 52 y hasta los 59 DPG; las hembras adultas se observaron adheridas a las raíces a partir del día 59 y hasta el día 66. Los primeros quistes adheridos a las raíces se identificaron por su color café claro, a los 73 y hasta los 94 DPG (Figura 2).

Figura 2. Fases de desarrollo del ciclo de vida del nematodo formador de quistes Heterodera sp. en las raíces de zanahoria cv. Mexicana bajo condiciones de invernadero. Véase las diferentes fases y los tiempos en que aparecieron en la raíz. 

El estudio histopatológico mostró en los cortes trasversales de raíces infectadas sitios de alimentación conocidos como sincitios ubicados principalmente en el cilindro vascular, ocasionando desplazamiento de los vasos del xilema y del floema (Figura 3C, D y F), en donde se observó engrosamiento y disolución de paredes celulares, con citoplasma denso, granuloso y vacuolado (Figura 3C, D y F). También hubo hiperplasia, y presencia de núcleos hipertrofiados (Figura 3E). Además fue notoria la presencia de zonas lignificadas (Figura 3C, E y F).Estos cambios celulares los induce el nematodo para poder alimentarse (^{Endo, 1971}). Todos estos cambios han sido documentados en diferentes especies del género Heterodera en diferentes cultivos (^{Endo, 1971}; ^{Sasanelli y Vovlas, 2013}; ^{Barrot, 2016}). Esto contrasta con los cortes de raíces de tejido sano (testigos) en el plano longitudinal y trasversal en donde no se observaron alteraciones (Figura 3A y B).

Figura 3. Cortes al micrótomo en los planos trasversal y longitudinal de las raíces de zanahoria sanas e infectadas con el nematodo formador de quistes Heterodera sp., teñidas con fucsina-verde rápido. A) Corte trasversal de raíz sana (testigo). B) Corte longitudinal de raíz sana (testigo). C-D) Cortes trasversales de la raíz infectada por el nematodo. E- F) Cortes longitudinales de la raíz parasitada con el nematodo. C= Corteza, CV= Cilindro vascular, E= epidermis, L= Lignificación, N= Nematodo, Nu= Núcleo, PC= Pared celular, S= Sincitio.