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La alfalfa Medicago sativa L. es una planta forrajera con alto valor nutritivo en el sector bovino. En México, este cultivo es afectado por factores bióticos entre las que destacan el pulgón verde Acyrthosiphon pisum Harris, pulgón manchado Therioaphis maculata Buckton, trips Frankliniella spp., gusano soldado Spodoptera exigua Hübner, pudriciones de la base del tallo Rhizoctonia solani Kühn, antracnosis Colletotrichum trifolii Bain & Essary, pudrición texana Phymatotrichopsis omnivora (Duggar) Hennebert, pudrición de la corona (Fusarium spp.), entre otros, los cuales causan pérdidas de producción (Chew, 2000; Lara y Jurado, 2014). Poco se conoce de los problemas ocasionados por nematodos sin embargo, en otras latitudes son considerados como problemas importantes donde destacan los nematodos agalladores del género Meloidogyne (Griffin y Thyr, 1988; Westerdahl, et al., 2006), lesionadores Pratylenchus penetrans (Cobb) Filipjev & Schuurmans Stekhoven (Thies et al., 1992) y el nematodo del tallo Ditylenchus dipsaci (Kühn, 1857) Filipjev 1936 (Wood y Close, 1974; Boelter et al., 1985; Milano de Tomasel y McIntyre, 2001; Perera et al., 2009).
El nematodo del tallo D. dipsaci es considerado como uno de los problemas nematológicos más importantes en la agricultura de climas templados donde destacan los cultivos de papa (Solanum tuberosum L.), ajo (Allium sativum L.), cebolla (A. cepa L.), zanahoria (Daucus carota L.), tulipán (Tulipa spp.), trebol (Trifolium spp.), remolacha (Beta vulgaris L.) y alfalfa (Medicago sativa L.) (EPPO, 2008; Tenuta et al., 2014). Es una especie con endoparasitismo obligado, polífago de partes aéreas y subterráneas de alrededor de 500 especies de plantas entre las que destacan hortalizas, cereales, leguminosas y ornamentales (Caubel y Pedron, 1976; Subbotin y Riley, 2012). Posee alrededor de 30 razas fisiológicas, muchas de ellas probablemente representando un complejo de especies difíciles de diferenciar debido a su gran similitud morfológica, cariotípica y molecular (Sturhan y Brzesky, 1991; Duncan y Moens, 2006).
El análisis del ADN ribosomal ha logrado dilucidar la situación taxonómica de D. dipsaci y se tiene evidencia de que está compuesta por al menos siete especies: 1. D. dipsaci sensu stricto (s. s.) que es la de mayor importancia por el número de cultivos que afecta; 2. D. gigas, conocido como nematodo “gigante” debido a su gran tamaño y afecta Vicia faba; 3. D. weischeri, que afecta Cirsium arvense; 4. Ditylenchus sp. D. que afecta Pilosella spp.; 5. Ditylenchus sp. E. afectando Crepis praemorsa; 6. Ditylenchus sp. F. afectando Leontodon autumnalis y Pilosella officinarum; y 7. Ditylenchus sp G. afectando Plantago maritima (Subbotin et al., 2005; Kerkoud et al., 2007; Marek et al., 2010; Vovlas et al., 2011; Jeszke et al., 2014).
La raza fisiológica es una división infraespecífica que se distingue de otros miembros de la misma especie por la patogenicidad que ocasiona en diferentes hospederos. Las razas de D. dipsaci s. s. coadyuvan en la amplia adaptabilidad de la especie a diversos climas y hospederos por lo que es considerado de importancia cuarentenaria por las agencias regulatorias fitosanitarias internacionales (Tenuta et al., 2014).
La alfalfa es un hospedero que también es afectado por D. dipsaci donde es conocido como el nematodo de la Alfalfa ya que parasitan los brotes, tallos, hojas y pueden ocasionar defoliación y muerte de plántulas (Milano de Tomasel y McIntyre, 2001; Westerdahl, et al., 2006). Al afectar la semilla botánica y vegetativa, representa un riesgo en la diseminación a zonas donde no se encuentra presente (Wood y Close 1974; Gray et al., 1994; Milano de Tomasel y McIntyre, 2001).
Durante 2014, el Programa Nacional de Vigilancia Epidemiológica Fitosanitaria (ProVEF) del SENASICA-SAGARPA en Jalisco, México, realizó un muestreo en el cultivo de alfalfa seleccionando plantas que presentaban crecimiento reducido, acortamiento de entrenudos, deformación y decoloración de brotes y hojas. Estos síntomas son parecidos a los producidos por nematodos foliares en alfalfa (Evans et al., 2008) pero en México no se tenía evidencia de su presencia por lo que se planteó el objetivo de determinar la identidad taxonómica y molecular de los nematodos detectados, así como sus afinidades filogenéticas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Muestreo del material biológico
El muestreo se realizó en el cultivo de alfalfa var. Atoyac con sistema de riego por aspersión de la localidad Cuyacapan, Atoyac, Jalisco entre las coordenadas 19.974489° N - 103.5276407° W. Se colectaron siete muestras al azar de plantas completas con raíces, tallos, brotes y hojas con síntomas asociados a nematodos foliares.
Extracción de nematodos
Raíces y follaje de las muestras fueron disectadas de 1-2 cm separando raíces, hojas+brotes y tallos e incubadas por separado por 4 h en agua destilada estéril a 20±2 °C. Se realizó la inspección de los nematodos extraídos de los tejidos con un microscopio estereoscópico American Optical con aumentos 1-15X.
Identificación taxonómica
La determinación de la identidad de la especie asociada con el síndrome se llevó a cabo mediante taxonomía tradicional. Se realizaron las mediciones de los caracteres de diagnóstico, el cálculo de los Índices De Man y comparados con los valores de referencia de especies del género Ditylenchus mencionados por Hooper, 1972; Decker, 1969 y Sturhan & Brzeski 1991. Hembras y machos fueron anestesiados con calor de mechero de alcohol y posteriormente montados en agua-agar al 2% (Esser, 1986). Se tomaron fotografías con una cámara digital AxioCam ICc1 (Carl Zeiss) adaptada a un microscopio compuesto Axiostar Plus (Carl Zeiss). Las mediciones fueron realizadas con el programa AxioVision Rel 4.8 (Carl Zeiss).
Extracción del ADN
La extracción de ADN se realizó a través del método propuesto por Williams et al., 1992 y Thomas et al., 1997 utilizando los especímenes previamente analizados por taxonomía tradicional. Los nematodos fueron recuperados individualmente del medio de montaje y colocados en 10 µl de solución amortiguadora de lisis (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0.45% Tween 20; 0.05% gelatina) sobre un cubreobjetos limpio. Se maceró el espécimen con la punta de una micropipeta bajo el microscopio estereoscópico. Se transfirió la solución a un tubo de centrifuga de 200 µl y se congeló a -40 °C por 30 min. Se incubó a 65 °C por 1 h dando vortex al menos una vez y 0.1 µl de Proteinasa K (20 µg/ml) fue agregado faltando 10-15 min. Finalmente se incubó a 95°C por 15 min para inactivar la Proteinasa K y se conservó a - 20 °C. Se utilizaron 5 µl del extracto crudo de ADN por cada reacción de PCR.
Amplificación por PCR del ADN ribosomal
Se utilizaron dos marcadores moleculares del ADN ribosomal: 1. La región ITS1-5.8S-ITS2 empleando los iniciadores AB28 (5´ - GTT TCC GTA GGT GAA CCT GC-3´) (Joyce et al., 1994) y TW81 (5´-ATA TGC TTA AGT TCA GCG GGT- 3´) (Howlett et al., 1992). 2. Los segmentos de expansión D2-D3 del gen 28S utilizando los iniciadores D2A (5`-ACA AGT ACC GTG AGG GAA AGT TG-3´) y D3B (5´-TCG GAA GGA ACC AGC TAC TA-3´) (Ellis et al., 1986; Courtright et al., 2000). En ambos marcadores se utilizó ADN de D. dipsaci afectando ajo como control positivo.
Para la amplificación del ITS1-5.8S-ITS2, la reacción estuvo compuesta por solución amortiguadora de PCR 1X (Invitrogen), MgCl2 3 mM, Mix dNTP´s 200 μM, iniciadores TW81 y AB28 a 0.4 μM, Taq Polimerasa 2.5 U/μl y 5.0 μl DNA (extracto crudo). Las reacciones de la PCR se realizaron en un volumen total de 50 μl en un termociclador i- Cycler (BioRad) con el siguiente programa de termociclaje: desnaturalización inicial a 95 °C por 3 min, 34 ciclos de desnaturalización a 95 °C por 45 s, anillamiento a 57 ºC por 30 s, extensión a 72 °C por 1.5 min, y finalmente una extensión final a 72 °C por 5 min (Skantar et al., 2007).
Los componentes de amplificación de los segmentos de expansión D2-D3 del gen 28S fueron: solución amortiguadora de PCR 1X (Invitrogen), MgCl2 3 mM, Mix dNTP´s 200 μM, iniciadores D2A y D3B a 0.4 μM, Taq Polimerasa 2.5 U/μl y 5.0 μl ADN considerando un volumen final de 50 μl. Las condiciones de termociclaje fueron: desnaturalización inicial 95 °C por 3 min, 34 ciclos de desnaturalización 95 °C por 45 s, anillamiento 55 °C por 45 s, extensión a 72 °C por 1 min, y una extensión final 72 °C por 5 min (Marek et al., 2010).
Los productos de PCR de ambos marcadores fueron corridos por electroforesis horizontal en gel de agarosa al 1.4% teñido con GelRed (Biotium) y visualizados en un fotodocumentador Gel Doc EZ (BioRad).
PCR-RFLP´s de la región ITS1-5.8S-ITS2
Los productos amplificados fueron digeridos con las enzimas de restricción RsaI y HinfI. El volumen final de reacción fue de 20 µl con los siguientes componentes: 2 µl de solución amortiguadora de digestión, 1 µl de la enzima, 10 µl de producto de PCR y 7 µl de agua destilada estéril grado biología molecular. Se incubaron las muestras a 37 °C por 3 h y se analizaron mediante electroforesis horizontal en gel de agarosa ultrapura-1000 al 2.5% teñidos con GelRed (Biotium) y visualizados en el fotodocumentador Gel Doc EZ (BioRad).
Secuenciación, bioinformatica y análisis filogenético
Los productos amplificados por PCR fueron secuenciados por el método de Sanger en el Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria, SENASICA-SAGARPA. Las secuencias “forward” y “reverse” fueron ensambladas, editadas y las secuencias de iniciadores eliminadas mediante el programa CodonCode Aligner 4.2.7 (CodonCode Co.).
A los dos marcadores ribosomales se realizó un BLAST para determinar homología con secuencias del NCBI. El análisis filogenético se realizó con una alineación múltiple de 36 secuencias de ITS1-5.8S-ITS2, mientras que para los segmentos de expansión D2-D3 del gen 28S el alineamiento múltiple incluyó 28 secuencias de especies cercanamente relacionadas con CLUSTAL W 2.3 (Thompson et al., 1997). Para ambas reconstrucciones se utilizó D. destructor como grupo externo. La búsqueda del mejor modelo de substitución nucleotídica se realizó en Mr Modeltest 2.3 (Nylander, 2004) y PAUP 4 (Swofford, 1998). Para la inferencia bayesiana, se utilizó el programa MrBayes v.3.2 (Huelsenbeck y Ronquist 2001) mediante cuatro cadenas para 1,000,000 generaciones. En las cadenas de Marcov se tomaron muestras a intervalos de 100 generaciones. Por cada análisis se ejecutaron dos corridas utilizando el modelo HKY+G para ambos marcadores. El primer 20% de los árboles muestreados fueron eliminados de todos los análisis y los árboles restantes fueron utilizados para calcular el árbol consenso por la regla de la mayoría del 50% y las probabilidades posteriores fueron calculadas para cada clado. Los árboles fueron visualizados con software FigTree v1.3.1 (Rambaut, 2009).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Todas las plantas presentaron síntomas de reducción del crecimiento, acortamiento de entrenudos, deformación de brotes y hojas (Figura 1A) así como decoloración de foliolos (hojas albinas o “white flagging”) (Figura 1B). Estos síntomas y en particular las hojas albinas son similares a los ocasionados por el nematodo del tallo D. dipsaci los cuales también han sido reportados en las provincias de Alberta y Columbia Británica, Canadá (Vrain y Lalik, 1983), Washington, Nevada, Utah, Alabama y Wyoming, Estados Unidos de Norteamérica (Gray et al., 1994).
Figura 1 Síntomas producidos por el nematodo del tallo D. dipsaci en alfalfa. A) Deformación de hojas brotes y acortamiento entrenudos. B) Decoloración de foliolos (“hojas albinas”)
En la incubación de raíces sólo se aislaron nematodos de vida libre mientras que en los tejidos de hojas, brotes y tallos se obtuvieron especímenes activos del género Ditylenchus. Si bien se detectaron nematodos vivos (~90-100/g de muestra), también se detectaron especímenes en anhidrobiosis (~15-20). Tomando en consideración que esta especie puede sobrevivir de esta forma en residuos de cosecha, semilla botánica y partículas de suelo, los especímenes pueden reactivarse y servir como fuente de inóculo para infecciones futuras o introducirse en zonas donde no se encuentre presente (Wharton y Barrett, 1985).
Identificación taxonómica: Los especímenes detectados presentaron las siguientes características: Hembras: cuerpo delgado (Figura 2A), región cefálica baja ligeramente aplanada, región glandular sin sobreposición marcada o muy ligera, bulbo medio muscular con válvula bien definida. Estilete pequeño y débil con nódulos bien desarrollados (Figura 2B), saco post-uterino con una longitud de ½ de la distancia entre la vulva y el ano (Figura 2D). Machos: cuerpo delgado (Figura 2F), relativamente más pequeños que las hembras; espículas y gubernaculum simple de tamaño moderados y con bursa tipo leptoderan que cubre aproximadamente el 75% de la cola (Figura 2E). Tanto en hembras como en machos se observó un campo lateral con cuatro incisuras (Figura 2C) y cola cónica aguda con terminación en punta de lápiz (Figuras 2A, E y F). Estas características morfológicas corresponden al género Ditylenchus. La morfometría y los Índices De Man obtenidos concuerdan con los valores de referencia reportados por Decker, 1969; Hooper, 1972 y Sturhan & Brzeski 1991 para el nematodo de la alfalfa D. dipsaci (Cuadro 1).
Figura 2 Micrografías de caracteres de diagnóstico para nematodos detectados en alfalfa. A) hembra, B) región anterior y estilete, C) Cuatro campos laterales, D) saco post-uterino, E) cola aguda y bursa leptoderan., y F) macho.
Cuadro 1 Morfometría de especímenes de Ditylenchus detectados en plantas de alfalfa. Todos los valores están dados en mm excepto V y T, los cuales están dados en porcentaje. Promedio ± Desviación estandar, y valores mínimos-máximos.
x L=longitud del cuerpo; a=L/ancho máximo del cuerpo; b=L/longitud esófago; c=L/longitud cola; V = distancia de la región anterior a la vulva/L x 100; T=Distancia desde la cloaca a la parte más alejada del testículo/L x100.
♀ = Hembras, ♂ = Machos
y- = No aplica, * = Valor no disponible en literatura.
Identificación molecular: La amplificación de la región ITS1-5.8S-ITS2 y segmentos de expansión D2-D3 del gen 28S del DNA ribosomal produjeron un fragmento de aproximadamente 750 pb (Figura 3) y 800 pb, respectivamente (Figura 4), el cual coincide con el reportado por Subbotin et al., 2005. Estas secuencias fueron depositadas en la base de datos del NCBI con los números de acceso KY348762, KY348763 y KY348764 para ITS1- 5.8S-ITS2 y KY348765 para D2-D3 del gen 28S.
Digestión enzimática PCR-RFLPs: La digestión del producto de PCR de la región ITS1-5.8S-ITS2 con la enzima RsaI se produjeron 4 fragmentos: 335, 280, 200 y 132 pb (Figura 5) y con HinfI se obtuvieron dos fragmentos: 400 y 300 pb (Figura 6). El patrón de digestión coincide con el presentado por el nematodo de los bulbos D. dipsaci en ajo para ambas enzimas (Subbotin et al., 2003; Vovlas et al., 2011) sin embargo, el patrón de digestión del nematodo D. dipsaci detectado en alfalfa con la enzima RsaI mostró un fragmento adicional de 200 pb (Figura 5). Este fragmento de 200 pb indicó la diferenciación de la población del nematodo detectado en alfalfa respecto a la población que afecta ajo.
Identificación molecular: La amplificación de la región ITS1-5.8S-ITS2 y segmentos de expansión D2-D3 del gen 28S del DNA ribosomal produjeron un fragmento de aproximadamente 750 pb (Figura 3) y 800 pb, respectivamente (Figura 4), el cual coincide con el reportado por Subbotin et al., 2005. Estas secuencias fueron depositadas en la base de datos del NCBI con los números de acceso KY348762, KY348763 y KY348764 para ITS1-5.8S-ITS2 y KY348765 para D2-D3 del gen 28S.
Digestión enzimática PCR-RFLPs: La digestión del producto de PCR de la región ITS1-5.8S-ITS2 con la enzima RsaI se produjeron 4 fragmentos: 335, 280, 200 y 132 pb (Figura 5) y con HinfI se obtuvieron dos fragmentos: 400 y 300 pb (Figura 6). El patrón de digestión coincide con el presentado por el nematodo de los bulbos D. dipsaci en ajo para ambas enzimas (Subbotin et al., 2003; Vovlas et al., 2011) sin embargo, el patrón de digestión del nematodo D. dipsaci detectado en alfalfa con la enzima RsaI mostró un fragmento adicional de 200 pb (Figura 5). Este fragmento de 200 pb indicó la diferenciación de la población del nematodo detectado en alfalfa respecto a la población que afecta ajo.
Análisis filogenético. La búsqueda de homología por BLAST de las secuencias mexicanas de D. dipsaci detectadas en alfalfa con secuencias del NBCI de ambos marcadores del rDNA previamente depositadas en el GenBank mostraron un 99% de homología (E=0.0) con secuencias de D. dipsaci de diferentes hospederos y regiones.
La topología del árbol filogenético obtenido con el marcador ITS1-5.8S-ITS2, posicionó a D. dipsaci en dos grandes grupos basados en diferencias cariotipicas: el diploide y el poliploide. La población mexicana de D. dipsaci en alfalfa, se agrupó en el clado sensu stricto diploide de D. dipsaci (Figura 7) donde se observa una baja diversidad haplotípica y poca variación intraespecífica. Si bien las poblaciones mexicanas se agrupan en un clado bien definido, es evidente la presencia de haplotipos diferentes de D. dipsaci en alfalfa. En este clado se ubican casi todas las razas fisiológicas de D. dipsaci basadas en los hospedantes que afecta. Un agrupamiento parecido fue observado con el marcador D2-D3 del gen 28S en ambos marcadores (Figura 8). Esta topología es similar a la reportada para miembros de la familia Anguinidae utilizando diferentes marcadores del rDNA (Subbotin et al., 2003; Subbotin et al., 2005; Castillo et al., 2007; Jeszke et al., 2014; Qiao et al., 2016).
Figura 3 Amplificación de la región ITS1-5.8S-ITS2 del rDNA de D. dipsaci detectado en alfalfa. M: marcador molecular de 100 pb; 1-6: amplificado a partir de extracción individual de DNA de D. dipsaci; 7 y 8: controles negativos (agua estéril grado biología molecular); 9 y 10: controles positivos de D. dipsaci (ajo) amplificando en un fragmento de 750 pb.
Figura 4 Amplificación de segmentos de expansión D2 y D3 del gen 28S del rDNA. M: marcador molecular de 100 pb; 1-6: amplificado a partir de extracción individual de DNA de D. dipsaci; 7 y 8: controles negativos (agua estéril grado biología molecular); 9 y 10: controles positivos de D. dipsaci (ajo) amplificando en un fragmento de 800 pb.
Figura 5 Digestión enzimática de la región ITS1-5.8S-ITS2 del rDNA con la enzima RsaI. M: marcador molecular de 50 pb; 1 y 12: Producto de PCR sin digerir; 2-4, 6-8: Patrón de restricción 335, 280, 200 y 132 pb, de D. dipsaci en alfalfa. 5, 10 y 11: Control positivo de D. dipsaci (ajo) patrón de restricción 335, 280 y 132 pb: 9: marcador molecular 100 pb.
Figura 6 Digestión enzimática de la región ITS1-5.8S-ITS2 del rDNA con la enzima HinfI. M: marcador molecular de 50 pb; 1 y 12: Producto PCR sin digerir; 2-8: Patrón de restricción 400 y 300 pb, 9: marcador molecular 100 pb. 10 y 11: Patrón de restricción de D. dipsaci s.s. (ajo) de 400 y 300 pb.
Figura 7 Reconstrucción filogenética bayesiana de secuencias de la región ITS1-5.8S-ITS2 de la población mexicana de D. dipsaci detectado en alfalfa. Árbol consenso de probabilidades superiores al 50% generados a partir del modelo complejo: HKY + G, con otras secuencias de anguinidos depositadas en el GenBank. Valores de soporte son indicados en cada una de los clados
Figura 8 Reconstrucción filogenética bayesiana de secuencias de los segmentos de expansión D2-D3 del gen 28S de la población mexicana de D. dipsaci detectado en alfalfa. Árbol consenso de probabilidades superiores al 50% generados a partir del modelo complejo: HKY + G, con otras secuencias de anguinidos depositadas en el GenBank. Valores de soporte son indicados en cada una de los clados.
CONCLUSIONES
En México, D. dipsaci afecta ajo y cebolla en las principales zonas productoras de estas aliaceas (Tenente, 1996; SENASICA, 2013). Estudios realizados con hospederos diferenciales para la determinación de razas, afirman que tales poblaciones corresponden a la “raza ajo” (Aguilera, 1994). Es conocida la gran variabilidad patogénica de D. dipsaci manifestada en varias razas en base al hospedero que afecta por ello, con base al hospedante y al patrón de restricción PCR-RFLP obtenido con la endonucleasa RsaI se puede indicar que el nematodo foliar D. dipsaci detectado en este hospedante podría tratarse de la “raza alfalfa” debido a que esta raza únicamente afecta y se reproduce en plantas de Medicago sativa (Webster, 1967; Sturhan y Brzesky, 1991; Riggs, 1991). Es necesario realizar estudios de hospedantes diferenciales de la población que afecta alfalfa y hacer uso de herramientas genómicas como tecnologías de secuenciación de masiva (Next Generation Sequencing) para obtener marcadores moleculares que sean de utilidad para la diferenciación de las razas de D. dipsaci presentes en nuestro país.
