La enfermedad de la mancha de sol causada por el Avocado sunblotch viroid (ASBVd) es una de las infecciones más persistentes en el aguacate producido en México (^{Vallejo-Pérez et al., 2017}). Esta enfermedad causa efectos citopáticos y cambios fisiológicos (^{Di Serio et al., 2013}; ^{Saucedo-Carabez et al., 2014}; ^{Vallejo-Pérez et al., 2014}; ^{Saucedo-Carabez et al., 2015}; ^{Vallejo-Pérez et al., 2015}), que finalmente resultan en frutos de menor tamaño y calidad externa e interna, y con menor rendimiento de fruto. En los frutos, los daños severos incluyen heridas deprimidas en su superficie que varían desde un color amarillo hasta manchas necróticas (^{Desjardins, 1987}). A pesar de su severidad, el ASBVd tiene la particularidad de causar infecciones asintomáticas en los árboles (^{Semancik y Szychowski, 1994}), y con ello un mayor riesgo de diseminación no intencionada, por material vegetal o por semilla. La primera estrategia de control de la enfermedad es la identificación de árboles infectados y esta se puede complementar con la identificación de los mecanismos de defensa que le permiten a un árbol no manifestar los síntomas de la enfermedad.

En la búsqueda de destacar genes regulados durante las respuestas de defensa a patógenos en aguacate se han elaborado estudios de perfiles de expresión que han revelado las bases moleculares de la interacción planta-patógeno, enfocadas principalmente en infecciones causadas por Colletotrichum gloeosporioides (^{Djami-Tchatchou et al., 2012}) y Phytophthora cinnamomi (^{Mahomed y Van Den Berg, 2011}). En aguacate han destacado los genes PR por favorecer un mecanismo inmune inducido de defensa de la planta conocido como resistencia sistémica adquirida. En este trabajo se partió de la hipótesis que la cascada de expresión en respuesta de defensa del aguacate al ASBVd, causante de la enfermedad de la mancha de sol, es diferente en árboles asintomáticos de aquellos que presentan síntomas, posiblemente indicando una capacidad de defenderse del ataque de esta enfermedad. El objetivo de este estudio fue describir los cambios en niveles de expresión de los genes de defensa seleccionados en plantas infectadas con síntomas y asintomáticas de la infección de ASBVd.

Se colectaron hojas maduras y frutos inmaduros de nueve árboles de aguacate (Persea americana Mill.) cv. Hass de un huerto comercial (19º26’6”N 101º52’28”O, 1610 m de elevación). Los árboles fueron previamente identificados como árboles sanos, árboles positivos a ASBVd con síntomas visibles y árboles positivos asintomáticos (^{Vallejo-Pérez et al., 2015}) y sin síntomas de otra enfermedad. Se muestrearon tres hojas y tres frutos por árbol en tres árboles de cada grupo.

Se eligieron cuatro genes relacionados con defensa a patógenos en aguacate: PaNPR1 (^{Backer et al., 2015}), PR-5, PR-6 y EREBP (^{Djami-Tchatchou et al., 2013}). El gen de actina (^{Reeksting et al., 2014}) se usó como gen de referencia. Las secuencias de los iniciadores se tomaron de las referencias mencionadas. Para la detección del ASBVd se emplearon los iniciadores diseñados por ^{Schnell et al. (1997)}.

Para la extracción de RNA total, se usaron en forma conjunta los métodos PureLink^® Plant RNA Reagent (Invitrogen) y Directzol^® RNA MiniPrep (Zymo Research), de acuerdo con los manuales de cada kit, debido al alto contenido de fenoles y polisacáridos en el tejido. La concentración y calidad del RNA se midieron en un Nanodrop 8000 (Thermo Scientific, EUA), y la integridad de cada muestra se verificó en gel desnaturalizante de acuerdo con el protocolo de ^{Aranda et al. (2012)}.

Para la retrotranscripción y amplificación, en un volumen final de 10 μL por reacción se mezclaron: 1X de Reaction Mix buffer (0.2 mM de cada dNTP y 1.6 mM de MgSO₄), 0.2 μM de iniciador sentido, 0.2 mM de iniciador antisentido, 0.4 μL de SuperScript^® III RT/Platinum^® TaqMix (Invitrogen), 100 ng de RNA total, y se completó el volumen con agua tratada con DEPC. Las reacciones se corrieron en un termociclador (Applied Biosystems 2720, EUA) con las siguientes condiciones: síntesis de cDNA 1 ciclo de 32 min a 50 °C; 1 ciclo de 2 min a 94 °C; seguido de 40 ciclos de 15 s a 94 °C, 15 s con la temperatura de alineamiento calculada (TA) para cada iniciador (Cuadro 1), 15 s a 68 °C. Por último, se programó un paso de elongación final por 5 min a 68 °C. Los productos obtenidos de la RT-PCR se separaron por electroforesis en gel de agarosa al 2%/TAE a 80 V por 60 min. Los geles fueron expuestos a luz UV en el fotodocumentador (Vilber Lourmat Infinity-1000/26MX, Francia) para obtener imágenes de los productos finales. La prueba de detección del patógeno se ejecutó con RT-PCR dúplex en un solo paso empleando los iniciadores del ASBVd y de actina. La mezcla utilizada para un volumen final de 10 μL de reacción fue: 1X Reaction Mix buffer, 0.2 μM de ambos iniciadores, sentido y antisentido; 0.4 μL de SuperScript^® III RT/Platinum^® TaqMix; 100 ng de RNA total, y se completó el volumen con agua tratada con DEPC. Las condiciones en el termociclador son iguales a las ya mencionadas. En los análisis de los genes de defensa y detección de ASBVd, se analizaron tres muestras de hoja madura y tres muestras de fruto inmaduro por grupo de árboles sanos, con síntomas y asintomáticos. Nueve bandas del viroide obtenidas de tejido de hoja, cuatro de árboles con síntomas y cinco de árboles asintomáticos, fueron secuenciadas (Macrogen Inc, Seul, Corea) y comparadas con BLASTn del NCBI.

Con el programa de análisis de imágenes ImageJ^® se comparó la densidad de bandas en gel de agarosa (^{Schneider et al., 2012}). Los valores de densidades de las bandas fueron normalizados por transformación de datos √(x+1) y comparados con los valores de densidad de actina y después graficados. Las gráficas resultantes indican un perfil de intensidad relativa media, tomada de una región de interés constante. Las diferencias entre los tejidos y los árboles se analizaron por la prueba t de Student. La significancia estadística se consideró con p ≤ 0.05.

La prueba de detección del ASBVd indica que el tejido de árboles infectados amplificó una banda de aproximadamente 250 pb, que coincide con el tamaño esperado del patógeno en cuestión, banda que no se presenta en árboles sanos (Figura 1). La amplificación del gen de actina indica que la reacción se llevó a cabo en todas las muestras analizadas. Las secuencias analizadas mostraron alta coincidencia con tres aislamientos del ASBVd (KF562705.1, KF562706.1 y KF562704.1, Identidad>92%; valor E<7x10-67, datos no mostrados) reportados en las zonas productoras de aguacate (^{Beltrán et al., 2014}).

Figura 1 Detección del Avocado sunblotch viroid (ASBVd) en aguacate. Productos amplificados por RT-PCR dúplex de un solo paso. Los tejidos positivos para la infección con ASBVd muestran dos productos, el que pertenece al viroide de 250 pb y el de la amplificación del gen de actina de 103 pb. Carril 1: marcador de 100 pb; Carriles 2 y 3: tejido foliar, y Carril 6 fruto de árboles sanos; Carriles 4 y 7: hoja y fruto de árboles asintomáticos; Carriles 5 y 8: hoja y fruto de árboles con síntomas visibles. La banda correspondiente al viroide se expresa sólo en árboles infectados. 

Los productos de la amplificación separados por electroforesis se presentan en la Figura 2. Los tejidos de árboles sanos muestran expresión basal de los genes evaluados, por lo que las comparaciones del efecto de la infección del ASBVd se realizaron entre árboles con síntomas y árboles asintomáticos, con respecto al sano. Los datos de área y porcentaje calculados por ImageJ^® se usaron para obtener densidades relativas de cada banda y se ajustó al nivel de expresión del gen de actina usado como referencia (Figura 3).

Figura 2 Productos de la amplificación de genes de defensa. Los primeros tres carriles corresponden a tejido foliar, los tres restantes a tejido de frutos. H, sano; S, sintomático; A, asintomático. 

Figura 3 Análisis cuantitativo de las intensidades de los productos de la RT-PCR de los genes relacionados con defensa. Se muestran los promedios de las densidades relativas ajustadas, los cambios en la intensidad son negativos o positivos a partir del valor de la expresión basal asignada como 1. La línea vertical sobre cada barra representa el error estándar (n=3). S, tejido de árbol con síntomas; A, tejido de árbol sin síntomas; *, diferencia significativa con respecto al tejido sano; †, diferencia significativa entre sintomático y asintomático. 

Los genes PaNPR1 y EREBP no mostraron diferencias significativas en la expresión diferencial entre los árboles infectados, con síntomas y asintomáticos, ni con respecto a la expresión basal en los tejidos sanos (Figuras 3A y 3B). La expresión de PR-5 en el fruto de árbol asintomático está sobreregulada y es significativamente diferente a la de fruto de árbol con síntomas y a la expresión basal, mientras que en los frutos de árbol con síntomas no se encontraron diferencias con la expresión basal (Figura 3C). En las hojas no se encontraron diferencias en la expresión entre árboles sintomáticos y asintomáticos, ni con respecto a la expresión basal. La expresión de PR-6 en frutos infectados con ASBVd tuvo regulación positiva, y, a pesar de su incremento en frutos asintomáticos, no se observó diferencia con los frutos de árboles con síntomas (Figura 3D). En el caso del tejido foliar se observó una regulación negativa significativa en los árboles asintomáticos.

La expresión de genes NPR1 pueden inducir la expresión de PR-5 (^{Shah et al., 2001}). Sin embargo, los resultados siguieren que los cambios de expresión de PR-5 en tejidos infectados por ASBVd no fueron inducidos por PaNPR1, debido a que los niveles de expresión de éste no muestran diferencias significativas con respecto a la expresión basal. ^{Backer et al. (2015)} reportaron que la expresión constitutiva basal de PaNPR1 fue más alta en hojas que en frutos inmaduros; además, y a diferencia del conocimiento que se tiene donde el ácido salicílico es activador de NPR1, los autores encontraron una regulación negativa de PaNPR1 en el tratamiento con ácido salicílico a las 12h después de la aplicación, lo que sugiere una función alternativa en las respuestas de defensa.

Por otro lado, se sabe que los viroides pueden inactivar algunos factores de transcripción, incluyendo EREBP, generalmente al suprimir las vías de regulación de los mRNA asociados a ellos (^{Matoušek et al., 2015}; ^{Katsarou et al., 2016}). En esta investigación no hubo diferencias en la expresión de EREBP. A pesar de que el etileno es una hormona muy común que puede simular el ataque de patógenos y promover la expresión de algunas proteínas PR, éste tiene limitada participación en el desarrollo de síntomas inducido por viroides (^{Hu et al., 2011}), lo cual es consistente con los resultados obtenidos.

Con respecto a la inducción de los genes PR-5 y PR-6, los resultados obtenidos permiten suponer que el mecanismo que activa la expresión de genes PR funciona como un conjunto de genes coordinado, no específico, que varía en magnitud y puede llegar a detener la infección primaria (^{Fister et al., 2016}). La expresión de PR-5 en frutos de árboles asintomáticos fue elevada en comparación con la de los otros tejidos, lo cual sugiere una respuesta de defensa más activa en este órgano. La expresión de los genes PR-5 puede ocurrir por la acción de ácido abscísico, etileno, salicilato, metil jasmonato o algunos otros elicitores (^{Velazhahan et al., 1999}). Consecuentemente, es posible que la inducción de PR-5 en frutos de árboles asintomáticos se deba a la activación por la señalización de otro mensajero diferente al etileno, lo cual explicaría también porqué el factor de transcripción EREBP no cambió sus niveles de expresión (Figura 3B). Sin embargo, la expresión de PR-5 depende del tipo de patógeno, ya que la infección de Colletotrichum gloeosporioides no modificó su nivel de expresión (^{Djami-Tchatchou et al., 2013}).

La expresión de PR-6 tuvo una regulación positiva en los frutos, similar a lo que ocurrió con PR-5. Las proteínas PR-6 pertenecen al grupo de inhibidores de proteasas reportadas en una gran variedad de plantas respondiendo a diversos estímulos externos incluyendo heridas, alimentación por insectos e infecciones microbiales (^{Habib y Fazili, 2007}; ^{Turra y Lorito, 2011}). La expresión de PR-6 puede ser regulada por etileno y activada en hojas durante la maduración de frutos (^{Margossian et al., 1988}); también puede ser inducida por aplicaciones exógenas de metil jasmonato y ácido abscísico (^{Wang et al., 2003}). Debido a la escasa expresión de EREBP en los frutos de árboles asintomáticos, la expresión de PR-6 en éstos parece relacionada con la inducción por ácido jasmónico o a través de una ruta alterna (^{Koiwa et al., 1997}).

Este estudio establece las bases para plantear diversas rutas de defensa del aguacate que son inducidas por la infección del ASBVd. Los cuatro genes estudiados presentaron expresión diferencial, tanto en tejido foliar como en tejido de fruto de árboles sanos como infectados con ASBVd. Los cambios más significativos en la expresión se dieron en frutos de árboles asintomáticos en los genes PR-5 y PR-6. En cambio, en tejido foliar únicamente se modificó la expresión basal de PR-6 en árboles asintomáticos.