El trigo (Triticum spp.) es el cereal más adaptado a las diferentes condiciones climatológicas en el mundo, junto con el maíz (Zea mays), y el arroz (Oryza sativa) proveen el 75% de los carbohidratos que requiere la alimentación humana. Sin embargo se estima que un 30% de la producción mundial de trigo es afectada por factores bióticos como las plagas y enfermedades que causan graves pérdidas en los rendimiento (^{Bockus et al., 2010}); dentro de sus principales enfermedades se encuentran las causadas por hongos que causan royas, carbones, tizones foliares y pudriciones radiculares (^{Zillinsky, 1984}). Los tizones en trigo son enfermedades foliares que se distribuyen mundialmente y son particularmente agresivos cuando la humedad relativa es alta, la temperatura de 20 °C (^{Zillinsky, 1984}), y una baja fertilidad del suelo (^{Duveiller y García-Altamirano, 2000}).

CIRNO C2008, es la principal variedad de trigo cristalino sembrada en el norte del país debido a su alto rendimiento, el cual ha sido superior en 8% a la variedad comercial Júpare C2001 (^{Figueroa et al., 2010}). Sin embargo, está empezando a ser reemplazada con las variedades Quetchehueca Oro C2013 (^{Fuentes-Dávila et al., 2014}) y Baroyeca Oro C2013 (^{Chávez-Villalba et al., 2015}) debido a su susceptibilidad a la roya de la hoja y a la roya amarilla.

^{Villa-Rodríguez et al. (2016)}, reportaron a B. sorokiniana como agente causal de la mancha borrosa en trigo en el Valle del Yaqui, Sonora. Sin embargo, en otras regiones de México ^{Duveiller y Dubin (2002)}, reportaron asociados a la misma enfermedad a hongos como Alternaria spp. y Pyrenophora tritici-repentis.

La estrategia de control de enfermedades causadas por tizones, incluida la mancha borrosa, se basa en un enfoque integrado, donde la resistencia genética es un elemento importante. La resistencia a estas enfermedades por genotipos de alto rendimiento no es satisfactoria (^{Saari, 1998}), se afirma que el tizón foliar es causado por al menos una especie de hongos del género Alternaria, pero se desconoce que especies están involucradas y si solo se trata de ese género. Por lo que se plantearon los siguientes objetivos: identificar el agente causal de la enfermedad en muestras provenientes del sur de Sonora y determinar la agresividad del o los patógenos en variedades comerciales y líneas avanzadas de trigo en condiciones de invernadero.

En los ciclos otoño-invierno 2014 y 2015, se recolectaron cincuenta muestras de trigo de la var. CIRNO C2008 en espigamiento y con síntomas de tizón foliar en campos agrícolas y experimentales del sur de Sonora, México. Los síntomas que exhibían las muestras recolectadas fueron: lesiones pequeñas y ovales de color marrón oscuro y con el centro color marrón claro, acompañadas de clorosis en etapas avanzadas (^{Dickson, 1956}).

Con un microscopio estereoscópico se buscó la presencia de conidios en el tejido los cuales se transfirieron a cajas Petri con medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA) (Difco^®, Francia).

La extracción de DNA se realizó usando el DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen^®, EE.UU.) mediante la metodología reportada por el fabricante. Para ello, se desprendió cuidadosamente el micelio de una caja Petri con crecimiento de 7 días, el cual se depositó en un mortero estéril y se maceró con nitrógeno líquido. Para la PCR se utilizaron los primers ITS5 e ITS4 (^{White et al., 1990}).

Los cuatro aislados de B. sorokiniana y los cuatro de A. alternata se purificaron e incrementaron y los conidios se recolectaron directamente de las cajas Petri con crecimiento micelial mediante el raspado con una espátula y adición de agua destilada. Esta suspensión de conidios se filtró a través de dos capas de manta de cielo para eliminar fragmentos del hongo y de medio de cultivo, ajustándose a una concentración de 10⁶ conidios mL^-1 usando un hematocitómetro, añadiendo además una gota de Tween 20^® (^{Cardona y González, 2008}).

Para las pruebas de patogenicidad se sembraron 19 variedades de trigo bajo un diseño experimental completamente al azar, y se tomó la segunda hoja en estado de plántula como base para la evaluación, dentro de las cuales fueron: 13 variedades de trigo harinero y 6 variedades de trigo cristalino. Por cada variedad se sembraron 5 semillas en sustrato esterilizado para evaluar 5 plántulas; se sembraron 8 repeticiones por cada clasificación (harineros y cristalinos) y 3 repeticiones por cada uno de los aislados fúngicos. El experimento se repitió dos veces bajo condiciones de invernadero.

La inoculación se realizó por aspersión de acuerdo a lo descrito por ^{Singh et al. (1996)} y fue en volúmenes iguales de suspensión de conidios de 15 mL por aislado directo a cada charola de germinación, las cuales posteriormente se trasladaron a una cámara de incubación con ambiente controlado con humedad relativa de 100% con ayuda de un humificador ultrasónico HU-820A (Samsung Electronic^®, Corea) y temperatura media de 19 a 21 °C por 48 h. Después se trasladaron al invernadero donde se mantuvieron hasta la aparición de síntomas y signos a una temperatura que osciló de 21 a 30 °C por 15 días.

Las evaluaciones se iniciaron cinco días después de la inoculación, para lo cual se utilizó la escala de severidad propuesta por ^{Perelló et al. (1998)} donde: 1 = libre de infección a mínimas manchas; 2 = 1 a 5%; 3 = 5 a 12%; 4 = 12 a 20%; 5 = 20 a35%; 6 = 35 a 45%; 7 = 45 a 60%; 8 = 60 a 80%; 9 = más del 80% del área foliar afectada con necrosis y clorosis generalizada. Los datos se transformaron a porcentaje y se les realizó análisis de varianza ANOVA con el programa SAS 9.1.3 (SAS Institute^®, EUA). Para estratificar los resultados se hizo comparación de medias de las variedades y aislados mediante la prueba de Fisher (LSD) (p≤0.05).

En el tejido foliar se aislaron hongos anamorficos de los géneros Bipolaris y Alternaria debido a la forma de los conidios característicos que tiene cada uno de ellos y al tipo de germinación para el caso de Bipolaris.

^{Zillinsky (1984)}, ^{Duveiller y García-Altamirano (2000)}, ^{Sharma y Duveiller (2004)}, y ^{Mehta (2014)}) coincidieron con que el único agente causal de la enfermedad conocida como “Spot blotch” es Bipolaris sorokiniana, sin embargo, en este estudio se detectó la presencia de A. alternata, que puede participar como saprófito o potenciador del daño. ^{Singh et al. (1996)} consideraron sólo a Alternaria triticina como el hongo patogénico asociado al tizón foliar. Mientras que ^{Mehta (2014)} afirmó que A. alternata se asocia a B. sorokiniana para provocar el síntoma de punta negra en el grano de trigo, el cual ocasiona el ennegrecimiento del embrión.

De los aislados obtenidos en este estudio, cuatro se identificaron como B. sorokiniana y cuatro como A. alternata de acuerdo al análisis de las secuencias ITS del DNA ribosomal. La comparación en el BLASTn de las secuencias obtenidas con números de acceso MF036007-MF036010, mostraron de 99 a 100% de identidad con otras secuencias ITS de B. sorokiniana depositadas en la base de datos del GenBank. Entretanto, las secuencias ITS con número de acceso MF036011-MF036014 presentaron 100% de identidad con las secuencias depositadas en el GenBank, lo que confirmó el resultado de la identificación morfológica de los aislados fúngicos.

Los síntomas se observaron claramente en las plántulas inoculadas con los aislados de B. sorokiniana, donde la enfermedad alcanzó niveles de severidad del 100% en algunos genotipos a los 13 días después de la inoculación. Con esto, se estandarizaron las temperaturas para la inoculación y desarrollo del proceso de infección de B. sorokiniana y A. alternata en invernadero, las cuales fueron de 19 a 21 °C y humedad de 100% por 48 h.

En 2013, la precipitación pluvial en el sur de Sonora fue de baja a escasa por lo que la región es caracterizada como un clima seco y la enfermedad era considerada secundaria (^{INIFAP, 2016}). En 2014 y 2015, la humedad relativa de la región fue alta (60 a 100%), por lo que la enfermedad se presentó de manera contundente (^{Villa-Rodríguez et al., 2016}). Por su parte, ^{Dubin y Bimb (1994)} señalaron que en las regiones donde el trigo se cultiva en condiciones de poca lluvia, C. sativus (anamorf: B. sorokiniana) no solo puede causar pudrición de la raíz, sino que también se transmite por semilla, enfermedad que es conocida como punta negra de los cereales. Por lo que el hongo muestra una gran capacidad de adaptación a las condiciones presentes en el sur de Sonora.

Se presentaron diferencias significativas entre los aislados evaluados. El aislado 3 de B. sorokiniana fue el más agresivo en comparación con el aislado 4. Mientras que los aislados 1 y 2 fueron similares entre sí (Cuadro 1). Lo anterior concuerda con lo obtenido en los estudios de ^{Zhong y Steffenson (2001)}, ^{Chand et al. (2003)}, ^{Ghazvini y Tekauz (2007)}, donde indicaron la variabilidad de aislados de B. sorokiniana al no mostrar patrones de virulencia claros. Esto nos permite suponer que las poblaciones naturales podrían ser el resultado de intercambio genético a través de la recombinación parasexual en la población de hongos (^{Maraite et al., 1998}; ^{Duveiller y García-Altamirano, 2000}).

^{Oliveira et al. (2002)} y ^{Gyawali et al. (2012)} encontraron variabilidad genética alta entre los aislados de B. sorokiniana en estudios usando la amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD, por sus siglas en inglés) con lo que se explica la diferencia entre los aislados 3 y 4, observándose que el aislado 3 causó mayores porcentajes de severidad, sin embargo, hubo una gran diferencia entre ellos, ya que mostraron una media de severidad de 75% en el aislado 3, y de 40% en el aislado 4. En contraste, ^{Mann et al. (2014)} reportaron una variabilidad baja entre los aislados que evaluaron y concluyeron que no hay cambios genéticos en la población del patógeno durante los últimos 15 años. Esto podría explicar el comportamiento de los aislados 1 y 2, los cuales mostraron menor agresividad con una media de 51 y 53%, respectivamente.

Los cuatro aislados de B. sorokiniana resultaron ser patogénicos para las 19 variedades de trigo, además que mostraron diferencias estadísticamente significativas (P=0.0001) en cuanto a agresividad. Asimismo, bajo condiciones de invernadero se pudo diferenciar y seleccionar a los genotipos como: altamente susceptibles, susceptibles, moderadamente susceptibles y moderadamente resistentes. Sin embargo, las plantas inoculadas con A. alternata no mostraron diferencias estadísticas significativas, de tal forma que no se pudo caracterizar la severidad de la enfermedad en las distintas variedades de trigo evaluadas.

La evaluación en la presente investigación se realizó tomando como patrón los síntomas característicos de la enfermedad, los cuales son lesiones pequeñas marrón oscuro, de 1-2 mm de longitud, sin un margen clorótico. En los genotipos susceptibles, estas lesiones se extendieron rápidamente para formar manchas ovales alargadas de color marrón claro y oscuro que alcanzaron varios centímetros de longitud antes de la coalescencia resultando en la muerte del tejido. Se apreció una abundante producción de conidios en las lesiones viejas acompañadas de clorosis que se difunde desde el borde de la lesión, esto pudo deberse a la producción de toxinas como lo afirmó ^{Mercado-Vergnes et al. (2006)}. Este tipo de síntomas se producen dependiendo del tipo de hospedante, pero llegan a coalescer de la misma forma, independientemente del genotipo (^{Mercado-Vergnes et al., 2006}).

Todas las variedades mostraron diferencias significativas a la susceptibilidad a B. sorokiniana, sin embargo, se observó que el aislado 3 fue el más agresivo. Las variedades resistentes al aislado 3 podrían ser consideradas posteriormente en un experimento de selección para resistencia. Entretanto los aislados 1, 2 y 4 tuvieron diferencias significativas de severidad en comparación con el aislado 3.

Con base en la escala de ^{Fetch y Steffenson (1999)}, se considera a las variedades altamente susceptibles al tener un porcentaje mayor al 90%, estableciendo en este rango a las variedades de trigo harinero Bárcenas S2002, Morocco, Bacanora T88, Luminaria F2012, la línea avanzada C, Villa Juárez F2009, Maya S2007, Urbina S2007, PBW343 y Nana F2007 (Cuadro 1).

No se observaron variedades de trigo harinero resistentes a los aislados evaluados de B. sorokiniana, sin embargo, las variedades Vicam S70 y Kronstad F2004, se comportaron como moderadamente resistentes. El resto de las variedades de trigo harinero fueron moderadamente susceptibles y susceptibles. Los resultados obtenidos se fundamentan con lo mencionado por ^{Da Luz y Bergstrom (1986)} y ^{Duveiller y Dubin (2002)} quienes observaron variaciones de la agresividad del patógeno y que estas no tienen relación con el genotipo evaluado.

En cuanto a los trigos cristalinos, las variedades altamente susceptibles fueron Local Red, Noio y la línea avanzada JC, mientras que Río Bravo C2016 se consideró como moderadamente resistente. De acuerdo a la escala de ^{Fetch y Steffenson (1999)}, la variedad CIRNO C2008 se comportó como moderadamente susceptible a B. sorokiniana.

Las variedades Bárcenas S2002 y Morocco alcanzaron el 100% de severidad a Bipolaris sorokiniana. La variedad Borlaug 100 F2014 posee resistencia a roya de la hoja y roya amarilla, además de tener una moderada resistencia al carbón parcial y a la punta negra dentro de las cuales se incluye a B. sorokiniana y Alternaria spp. (^{Mehta, 2014}). Según ^{Valenzuela-Herrera et al. (2012)}, la variedad Villa Juárez F2009 presenta la misma resistencia de Borlaug 100 F2014, y es considerada moderadamente susceptible a la punta negra del grano. Sin embargo, dentro de esta investigación ambas variedades fueron susceptibles mostrando niveles de infección máximos de 94 y 86% respectivamente a la infección por B. sorokiniana.

^{Solís-Moya et al. (2014)} observaron que las variedades Luminaria F2012, Maya S2007 y Urbina S2007 son resistentes a la roya lineal amarilla y moderadamente resistentes a la roya de la hoja, pero no mencionaron la resistencia a tizones, aunque, en este estudio esas variedades se comportaron como susceptibles a B. sorokiniana.

La variedad PBW343 se reporta como moderadamente resistente a la roya de la hoja y roya amarilla, pero susceptible a la roya del tallo raza Ug99 y resistente a la raza RTR de roya del tallo en México (Huerta-Espino y Singh, 2000), pero en esta investigación se comportó como altamente susceptible a B. sorokiniana.

La variedad Vicam S70 es considerada como resistente a la mancha borrosa, pero susceptible a la roya amarilla y roya de la hoja, lo cual coincide con los resultados obtenidos en este experimento, ya que su reacción fue de moderada resistencia a B. sorokiniana. Local red es considerada como susceptible a royas del trigo y es utilizado como progenitor en los programas de mejoramiento genético de trigo (^{Bárcenas-Santana et al., 2016}); Sustentando con esto a los resultados obtenidos y clasificando a Local Red como altamente susceptible a B. sorokiniana, asimismo, la variedad de trigo duro Noio utilizada experimentalmente como como susceptible a la roya del tallo, pero resistente a la roya de la hoja y roya amarilla en esta investigación se comportó susceptible a B. sorokiniana.

Dentro de la resistencia a B. sorokiniana en los trigos cristalinos se observó que la línea avanzada JC es altamente susceptible y Conasist C2015 moderadamente resistente.

Por otra parte, para el caso de los aislados de A. alternata, no se realizó un análisis de varianza debido a que la mayoría de estas tuvieron un porcentaje de severidad bajo según la escala utilizada, los cuales estuvieron entre 1 y 5%, considerándose como no significativos.

^{Villa-Rodríguez et al. (2016)} afirmaron que temperaturas variables con incrementos de +1 °C de la temperatura media y humedad relativa del 60 al 100% que se presentaron en 2014 y 2015, fueron probablemente las principales fuerzas impulsoras de la epidemia de mancha borrosa en trigo en el sur de Sonora.

Con el presente estudio se encontró que el principal agente causante de la mancha borrosa del trigo en el sur de Sonora fue Bipolaris sorokiniana. Además, Alternaria alternata es un hongo secundario asociado al desarrollo de la enfermedad causada por B. sorokiniana, de igual forma se observaron diferencias cuantitativas en la agresividad de los cuatro aislados de Bipolaris sorokiniana evaluados en este estudio.