La jamaica (Hibiscus sabdariffa L.) es afectada por virus del género Begomovirus (Geminiviridae), los cuales poseen un genoma circular de DNA, monopartita (DNA-A) o bipartita (DNA-A y DNA-B), infectan una amplia gama de especies vegetales y se transmiten por un complejo de especies crípticas de mosca blanca (Bemisia tabaci) (^{Brown et al., 2015}). Entre las especies de begomovirus asociadas a jamaica se encuentran: Cotton leaf curl Multan virus (CLCuV), Mesta yellow vein mosaic virus (MeYVMV), Hibiscus variegation virus (HiVV, nombre provisional) ( ^{Hernández-Zepeda et al., 2007}; ^{Chatterjee y Ghosh, 2008}; ^{Muhammad et al., 2017}) y Okra yellow mosaic Mexico virus (OYMMV). Este último se reportó recientemente en el estado de Guerrero, México, asociado con el amarillamiento de la jamaica con incidencias del 90 al 100% (^{Velázquez et al., 2016}). Este virus también fue detectado en Abutilon permolle, Corchorus siliquosus y Sida acuta en Yucatán, México (^{Hernández-Zepeda et al., 2007}). Además de infectar especies cultivadas, los begomovirus también pueden infectar malezas. Las malezas son un reservorio potencial de virus económicamente importantes y varias de ellas son cruciales en la epidemiología de los begomovirus (^{Prajapat et al., 2014}); además, varias pueden transmitir virus por semilla (^{Dikova, 2005}; ^{Sharman et al., 2009}). Sweet potato leaf curl virus (SPLCV, un virus de DNA) en camote dulce (Ipomoea batatas) (^{Kim et al., 2015}), Mung bean yellow mosaic virus (MYMV, un virus de DNA) en Vigna mungo (^{Kothandaraman et al., 2016}) y el Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV, un virus de DNA) en tomate (Solanum lycopersicum) (^{Kil et al., 2016}) son transmitidos por semilla. En Guerrero, una alta incidencia de plantas de jamaica con amarillamiento o mosaico estuvo asociada con la infección de OYMMV (^{Velázquez et al., 2016}) y Whitefly-associated begomovirus 3, respectivamente, ambos con genoma bipartita. Asimismo, diferentes malezas asociadas al cultivo presentaban amarillamiento pero se desconoce si son hospedantes de estos begomovirus o si se transmiten por semilla. Por lo anterior, el propósito de este estudio fue determinar si los begomovirus detectados en plantas de jamaica también se encuentran en las malezas asociadas al cultivo y si se transmiten por semilla. En agosto y noviembre de 2016 se recolectaron plantas de tres cultivares de jamaica con síntomas de amarillamiento o mosaico de un cultivo comercial en Guerrero, México. También se recolectaron malezas que se encontraban en el interior o en la periferia del cultivo que mostraban amarillamiento y distorsión foliar. Como testigo también se colectaron plantas asintomáticas de jamaica y malezas; estas últimas se identificaron a especie. Se extrajeron ácidos nucleicos totales de hojas jóvenes de jamaica y malezas con el reactivo Concert ™ Plant RNA Reagent (Cat. 12322-012, Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron los iniciadores universales para begomovirus Av494 (5’-GCCYATRTAYAGRAAGCCMAG-3’) y Ac1048 (5’-GGRTTDGARGCATGHGTAC ATG-3’) para amplificar un fragmento de 550 pb de la cubierta proteica (CP) (^{Wyatt y Brown 1996}). La mezcla de reacción consistió en 2 μL de buffer de reacción (5X Green GoTaq^®), 0.6 μL de MgCl₂ (25 mM), 0.2 μL de dNTPs (10 mM), 0.55 μL (10 μM) de cada iniciador, 0.05 μL (10 μM) de cada iniciador del gen 18s rRNA utilizado como indicador de la efectividad de la PCR que amplifican un fragmento de 844pb (^{Gambino y Gribaudo 2006}), 4.9 μL de agua ultra pura, 0.1 μL de GoTaq^® DNA Polymerase (5U/μL PROMEGA) y 1 μL de ácidos nucleicos totales (20 ng / μL) en un volumen final de 10 μL. La PCR se realizó con las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 95 °C/4 min, seguida de 30 ciclos a 95 °C/1 min, 55 °C/2 min, 72 °C/1 min y una extensión final de 72 °C/10 min. Los productos obtenidos de PCR se secuenciaron (Macrogen Inc., Corea), las secuencias fueron editadas con el programa DNA baser (http://www.dnabaser.com/index.html) y se compararon con las de la base de datos del GenBank^®. Las muestras de jamaica y malezas positivas a begomovirus por PCR se sometieron a un segundo análisis con iniciadores específicos para WfaBV3 y OYMMV utilizando la secuencia de la CP de cada virus (KT099127.1 y HM035059.1). Con el programa Primer-blast tool del NCBI se diseñaron los iniciadores específicos VEM-3-F 5’-AGTCCTACGAGCAACGTCAC-3’/VEM-3-R 5’-TCTCGTACTTCGCAGCTTCC-3’ y OYMMV-F 5’-AAAGGTGAGCCGCAATGC TA-3’/ OYMMV-R 5’- GTCGCGTAGGTCGTTCT TCA-3’, que amplifican un fragmento de 438 y 463 pb, respectivamente. La mezcla de reacción consistió en 2 μL de buffer de reacción (5X Green GoTaq^®), 0.6 μL de MgCl₂ (25 mM), 0.2 μL de dNTPs (10 mM), 0.6 μL (10 μM) de cada iniciador, 4.9 μL de agua ultra pura, 0.1 μL de GoTaq® DNA Polymerase (5U/μL PROMEGA) y 1 μL de DNA (20 ng/μL) en un volumen final de 10 μL. El programa de PCR para ambos virus fue el siguiente: desnaturalización inicial a 95 °C/5 min, seguida de 40 ciclos a 95 °C/30 s, 57 °C/30 s, 72 °C /30 s y un ciclo de extensión final de 72 °C/5 min. Tres muestras de jamaica positivas al OYMMV y tres positivas al WfaBV3, así como cinco malezas positivas al OYMMV fueron secuenciadas (Macrogen Inc., Corea). Para corroborar la especificidad de los iniciadores diseñados, plantas de tomate infectadas con el Tomato severe leaf curl virus y plantas de chile infectadas con el Pepper golden mosaic virus o Pepper huasteco yellow vein virus respectivamente, se analizaron mediante PCR con VEM-3-F/VEM-3-R y OYMMV-F/OYMMV-R. Se recolectaron y analizaron semillas de cada uno de los tres cultivares de jamaica y de cinco especies de malezas positivas a begomovirus de la siguiente manera: a) Se extrajeron ácidos nucleicos totales de 10 muestras de semillas de cada cultivar de jamaica (10 semillas por muestra) y cuatro muestras de semillas de cada maleza (10 semillas por muestra) y se analizaron por PCR con los iniciadores universales para begomovirus como se describió anteriormente. Asimismo, la semilla de maleza se analizó por PCR con iniciadores específicos para OYMMV. b) Se sembraron 100 semillas de cada cultivar de jamaica y 40 semillas de cada una de las cinco malezas en charolas que contenían suelo estéril. Para evitar la contaminación de algún virus presente en la testa, las semillas se desinfestaron superficialmente con hipoclorito de sodio al 10% y se enjuagaron con agua destilada (^{Kim et al., 2015}). Las charolas se mantuvieron a 27 °C con un fotoperiodo de16 h (^{Albrechtsen 2006}). Como testigo, se sembraron 200 semillas de cada cultivar de jamaica colectadas de plantas sanas. Tres meses después de la siembra, se recolectaron hojas jóvenes de 10 plántulas de cada cultivar de jamaica y se extrajeron ácidos nucleicos totales. En el caso de las malezas, se colectaron hojas jóvenes de diez plántulas seleccionadas al azar de cada una de las cinco especies 40 días después de la siembra. Las plántulas de jamaica y de malezas se analizaron mediante PCR con iniciadores universales para begomovirus como se describió anteriormente. Además, las hojas jóvenes de plántulas de malezas se analizaron con iniciadores específicos para OYMMV. La extracción de ácidos nucleicos totales de semillas y plántulas se realizó de acuerdo con ^{Dellaporta et al. (1983}), con algunas modificaciones. Los productos se secuenciaron, editaron y compararon con los de la base de datos del GenBank^® de la manera antes indicada. Los ácidos nucleicos totales de las hojas jóvenes de las plántulas de jamaica se sometieron a amplificación por círculo rodante con el kit TempliPhi 100 Amplification^® (Amersham Biosciences) siguiendo las instrucciones del fabricante con el fin de enriquecer el DNA circular que pudiera estar presente y se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0.8%.

En total se recolectaron 34 plantas de jamaica con amarillamiento o mosaico y 10 asintomáticas así como seis malezas con amarillamiento y distorsión foliar (Figura 1) y seis sin síntomas. Todas las plantas de jamaica con síntomas amplificaron el fragmento esperado (550 pb) para begomovirus y 26 de ellas tuvieron una similitud de 97-98% con el Whitefly-associated begomovirus 3 (WfaBV3) (números de acceso MF632074, MF632075, MF632076 y MF632077). Estas 26 plantas de jamaica con síntomas se analizaron también por PCR con los iniciadores VEM-3-F/VEM-3-R y todas amplificaron el producto esperado de 438 pb. La secuencia de este último (número de acceso MH090700) tuvo una similitud del 98% con el Whitefly-associated begomovirus 3. ^{Rosario et al. (2015}) reportaron este begomovirus en Bemisia tabaci y lo denominaron VEM-begomovirus 3 ya que no se había detectado previamente en plantas, sin embargo, el nombre de esta especie actualmente aceptado por el ICTV es Whitefly-associated begomovirus 3. Las ocho plantas restantes mostraron una similitud del 93-94% con el OYMMV (número de acceso MF315084, MF315085, MF315086 y MF315087). Estas ocho plantas de jamaica se analizaron mediante PCR con los iniciadores OYMMV-F / OYMMV-R y todas amplificaron el producto esperado de 463 pb. La secuencia de este último (número de acceso MH090684) tuvo una similitud de 92% con OYMMV, un virus reportado previamente por Velázquez et al. (2016) en el cultivo de jamaica en la misma zona de estudio. En el caso de los begomovirus, se ha establecido que la secuencia de una especie con una similitud ≥91% con todo el genoma o parte del componente DNA-A, significa que se trata de la especie en cuestión, mientras que si se tiene una similitud <91%, entonces debe considerarse una especie nueva (^{Brown et al., 2015}). El gen de la CP es el mejor conservado de la familia Geminiviridae (^{Wyatt y Brown 1996}) y permite discriminar efectivamente variantes, especies y otras categorías taxonómicas de begomovirus, por lo que ha sido aceptada por el ICTV como una referencia confiable para identificar un virus cuando no se dispone de la secuencia completa de su genoma (^{Brown et al., 2001}). No hubo amplificación con los iniciadores VEM-3-F/VEM-3R y OYMMV-F/OYMMV-R en plantas de tomate infectadas con el Tomato severe leaf curl virus ni en plantas de chile infectadas con el Pepper golden mosaic virus y Pepper huasteco yellow vein virus, respectivamente. Las plantas de jamaica positivas a OYMMV inicialmente mostraron clorosis en la nervadura y luego un mosaico amarillo que cubrió toda la hoja. En el caso de las plantas de jamaica positivas a WfaBV3, siempre se observó un mosaico que se hizo más evidente con el tiempo. Se identificaron seis especies de malezas asociadas a jamaica pertenecientes a dos familias, siendo la familia Malvaceae la que tuvo el mayor número de especies: Sida aggregata K., S. collina S., S. haenkeana (C.) Presl., S. acuta Burm. f., Malachra fasciata Jacq. y Euphorbia heterophylla L. Estos resultados son similares a los reportados en otros estudios en los que se han encontrado diferentes begomovirus asociados con malezas que pertenecen a la familia Malvaceae (^{Hernández-Zepeda et al., 2007}; ^{Nascimento et al., 2016}). El fragmento esperado para begomovirus (550 pb) se obtuvo en todas las muestras de malezas con síntomas, así como el del fragmento del gen 18s rRNA (844 pb) utilizado como control interno; este último es esencial para la detección de falsos negativos, degradación del DNA o presencia de inhibidores de la PCR. (^{Gambino y Gribaudo 2006}). En Sida aggregata, S. collina, S. haenkeana, S. acuta y Malachra fasciata se obtuvo el producto esperado de PCR de 463 pb con los iniciadores OYMMV-3-F / OYMMV-3-R (datos no mostrados) y sus secuencias tuvieron de 93 a 95% de similitud con el OYMMV. En Euphorbia heterophylla se detectó al begomovirus Euphorbia mosaic virus. De las malezas positivas al OYMMV, solo Sida acuta se había reportado previamente como hospedante de este virus (^{Hernandez-Zepeda et al., 2007}), mientras que S. aggregata, S. collina, S. hankeana y Malacra fasciata se reportan por primera vez como hospedantes. La mayoría de las malezas tienen una alta adaptabilidad al ambiente y varias de ellas se han reportado como hospedantes de un gran número de begomovirus por lo que se consideran un factor importante en estudios epidemiológicos (^{Prajapat et al., 2014}). Además, conocer la gama de hospedantes alternos de virus es esencial para diseñar estrategias efectivas de manejo (^{Kai-Shu et al., 2011}). La transmisión del OYMMV por semilla de malezas favorece su permanencia en campo y las plántulas que se originan de ellas son un reservorio potencial para colonias de moscas blancas virulíferas en las primeras etapas del cultivo. Ninguna de las especies de malezas analizadas en el presente estudio fue positiva a WfaBV3 a pesar de que este virus se detectó en plantas de jamaica con mosaico. Es posible que WfaBV3 esté limitado al género Hibiscus, como en el caso de SPLCV que se encontró únicamente en plantas del género Ipomoea de un total de 111 especies pertenecientes a 30 familias (^{Kai-Shu et al., 2011}). WfaBV3 y OYMMV no se detectaron por PCR en semilla y plántulas de los diferentes cultivares de jamaica y sólo se obtuvo la amplificación del segmento del gen 18s rRNA, por lo que se descarta la posibilidad de falsos negativos o la presencia de inhibidores de PCR. No se obtuvo ninguna amplificación a partir de ACR, lo que respalda los resultados anteriores de la no transmisión de estos begomovirus por semilla de jamaica. Estos resultados difieren de los obtenidos para los begomovirus Sweet potato leaf curl virus y Mung bean yellow mosaic virus que se detectaron por PCR en plántulas asintomáticas; sin embargo, en campo, éstas pueden ser permisivas y actuar como una fuente de inóculo para la infección de plántulas sanas (^{Kim et al., 2015}; ^{Kothandaraman et al., 2016}). El OYMMV fue detectado en semilla de Sida aggregata (número de acceso MF632078, MH090690), S. collina (número de acceso MF632079, MH090691), S. haenkeana (número de acceso MF632080, MH090692), Sida acuta (número de acceso MF632081, MH090693) y Malachra fasciata (número de acceso MF632082, MH090694) con iniciadores universales para begomovirus y específicos para OYMMV. El OYMMV se detectó por PCR con los iniciadores OYMMV-3-F/OYMMV-3-R en plántulas de las cinco especies de malezas en diferentes tasas relativas (plántulas positivas/plántulas analizadas; número de acceso): Sida aggregata (3/10; MH090695) S. collina (2/10; MH090696), S. haenkeana (1/10; MH090697), Sida acuta (5/10; MH090698) y Malachra fasciata (1/10; MH090699) y no se observaron síntomas en ellas. De manera similar, las plántulas asintomáticas de Ipomoea batatas y Vigna mungo fueron positivas para Sweet potato leaf curl virus y Mung bean yellow mosaic virus, respectivamente (Kim et al., 2015; Kothandaraman et al., 2016). La detección de OYMMV en semillas y plántulas de cinco especies de malezas sugiere que este virus está dentro de la semilla y puede transmitirse de una generación a otra a través del embrión (Kim et al., 2015). Se sabe que muchos virus transmitidos por semilla lo hacen solo en ciertas especies de plantas y no en otras, como el TYLCV que se transmite por semilla de Solanum lycopersicum (^{Kil et al., 2016}) pero no de Nicotiana benthamiana (^{Rosas- Díaz et al., 2017}). Lo anterior podría explicar la detección de OYMMV en semillas de malezas pero no en semillas de jamaica.

Figura 1 Síntomas de malezas asociadas al cultivo de jamaica. A) Sida acuta, B) S. haenkeana, C) S. collina, D) S. aggregata, E, F) Malachra fasciata. 

WfaBV3 se detectó en plantas de jamaica con mosaico, mientras que OYMMV se asoció con plantas que mostraban mosaicos amarillos. Se identificaron cinco especies de Malvaceae consideradas como malezas infectadas por OYMMV y éste se transmitió por semilla en todas ellas. WfaBV3 no se detectó en malezas y no hubo transmisión de este virus ni del OYMMV en semilla ni plántulas de jamaica. Este es el primer reporte de cuatro nuevas malezas hospedantes de OYMMV y de su transmisión por semilla.