El Cucumber mosaic virus (CMV, Cucumovirus, Bromoviridae) es uno de los virus con mayor gama de hospedantes, incluyendo cucurbitáceas, solanáceas, cereales, leguminosas y ornamentales. Entre los síntomas que puede causar están: mosaico, clorosis, necrosis, malformaciones foliares y enanismo, entre otros. También es posible que las plantas infectadas sean asintomáticas (^{Palukaitis et al., 1992}). El CMV ha sido modelo de estudio de los diferentes mecanismos de interacción planta-patógeno, y es uno de los diez virus fitopatógenos de mayor importancia económica en el mundo (^{Rybicki, 2015}).

La virosis por CMV es una limitante en la producción de cultivos en más de 18 estados de la República Mexicana y en algunos casos se reportan pérdidas superiores al 80% (^{Robles et al., 2010}).

En el estado de Colima, el CMV se detectó en los cultivares de melón cantaloupe, ‘Durango’ y ‘Primo’ en el municipio de Tecomán (^{Orozco et al., 1994}). Desde entonces se desconoce la existencia de otros hospedantes o subgrupos del virus, así como su asociación con RNAs satélite (satRNA) en esta entidad federativa, por lo que el objetivo de este trabajo fue identificar aislamientos del CMV y su satRNA en plantas del estado de Colima, México.

Se recolectó tejido foliar de plantas cultivadas y malas hierbas con síntomas asociados al CMV (i.e. mosaico, moteado, filiformidad y deformación foliar, así como enanismo, o su mezcla) en los municipios de Armería, Tecomán y Cuauhtémoc (Figuras A y B). En el laboratorio, las muestras se lavaron con agua desionizada para eliminar las impurezas que pudieran estar presentes, y posteriormente se almacenaron a -80 °C hasta su procesamiento.

La extracción de RNA total se realizó a partir de 100 mg de tejido utilizando el Plant RNA Purification Reagent (Invitrogen, EE.UU.), siguiendo las recomendaciones del fabricante. El precipitado con el ácido ribonucleico se disolvió en 32 µL de agua tratada con 0.01% (v/v) de dietilpirocarbonato. La concentración de ácidos nucleicos se cuantificó con un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, EE.UU.) y se almacenó a -20 °C.

Posteriormente, se realizaron reacciones de transcripción inversa acoplada a reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) de punto final en un solo paso para detectar: a) un fragmento del gen endógeno 18S de aproximadamente 300 pb como indicativo de una adecuada calidad de los extractos con los oligonucleótidos descritos por ^{Zamboni et al. (2008}), b) un segmento del gen de la proteína de la cápside (CP) del CMV de ~500 pb con los oligonucleótidos reportados por ^{Wylie et al. (1993}), y c) satRNA con los oligonucleótidos reportados por ^{Chen et al. (2011}) que amplifican un fragmento de ~390 pb. Todas las reacciones de RT-PCR se llevaron a cabo en volúmenes de 5 µL y consistieron de una mezcla del amortiguador de reacción 1X (0.2 mM de dNTPs y 1.2 mM de MgSO₄), 0.5 µM de los oligonucleótidos correspondientes (sentido y antisentido), 0.6% (v/v) de polivinilpirrolidona 40 (PVP₄₀), 0.2 µL de la solución madre de las enzimas contenidas en el kit de la SuperScript^™ III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq ^® High Fidelity (Invitrogen, EE.UU.) y una concentración promedio de 32 ng de cada extracto de RNA.

Cada RT-PCR se llevó a cabo en un termociclador VeritiFast (Applied Biosystems, EE.UU.) con el siguiente programa: un ciclo de 32 min a 50 °C, un ciclo de 2 min a 94 °C, seguido de 40 ciclos de 15 s a 94 °C, 15 s a 55 °C (para 18 S), 60 °C (para CP del CMV) y 53 °C (para satRNA) y 15 s a 68 °C; y un ciclo final de 5 min a 68 °C.

Como control positivo para los diferentes ensayos, se empleó un extracto de RNA bicatenario obtenido de tejido foliar de Nicotiana glauca positivo a CMV y satRNA por RT-PCR y secuenciación. Por su parte, agua grado PCR y un extracto de RNA de tejido foliar de Catharanthus roseus, negativo a CMV y satRNA por RT-PCR, sirvieron como controles negativos.

Los productos de las RT-PCR se analizaron por electroforesis horizontal en geles de agarosa 1.5% (p/v) en amortiguador TAE 1X (tris-acetato 40 mM, Na₂EDTA•2H₂O 2 mM) a 80 V. El gel se tiñó con bromuro de etidio (0.5 µg/mL) y se expuso en luz UV, y la imagen resultante se obtuvo con un fotodocumentador (MF-ChemiBIS-DNR Bio-Imaging Systems, Jerusalén, Israel).

Los amplicones correspondientes a la CP del CMV y satRNA de los distintos aislamientos obtenidos se purificaron con el Kit Wizard^® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante, y su secuenciación se realizó por el método de Sanger en el Instituto de Neurobiología-Laboratorio de Proteogenómica de la Universidad Nacional Autónoma de México, Campus Juriquilla, Querétaro (http://www.inb.unam.mx/unidades/molecularyanalitica/bios.html).

Las secuencias obtenidas en este estudio y otras correspondientes a la CP de diferentes subgrupos del CMV (IA: U32859, U2281, D10538, Y18137, U43888, D00385, AJ276481 y AJ131623, IB: D42079, D28780, U20219 y X89652 y II: Y18138, U22822, Z12818, AB006813, AJ131620, AJ131621, L15336 y D00463) y satRNA (con dominio necrogénico: D84389, D10039, U31660, D28559, DQ839133, X86421, X86425, D00542 y D10038 y sin dominio necrogénico: J02061, D10037, D42081, D42082, X86409, X86424, X54065 y X69136) reportados a nivel mundial, además de las secuencias de la CP del Brome mosaic virus (BMV) (X58458) y RNA satélite del Peanut stunt virus (PSV) (NC_003855.1), las cuales se usaron como grupos externos, se descargaron del GenBank-NCBI en formato fasta txt y se alinearon con Clustal W. La construcción de los árboles filogenéticos se realizó con MEGA6.0 (^{Tamura et al., 2013}) usando el criterio óptimo de máxima verosimilitud con el modelo de sustitución T92, el cual se ajustó mejor a las secuencias, con 1,000 repeticiones de bootstrap.

En total se recolectaron 30 muestras, 11 de malas hierbas: 2 de empanadilla (Commelina sp.), 2 de Cucurbita sp., 2 de amargosilla (Parthenium sp.), 2 de trébol (Trifolium sp.), 1 de malva silvestre (Malva sp.) y 2 de monacillo blanco (Herissantia sp.); 5 de plantas ornamentales: 3 de vinca (Catharanthus roseus) y 2 de azucena (Hippeastrum sp.); y 14 de plantas cultivadas: 3 de papayo (Carica papaya ‘CW-3’), 3 de tomate (Solanum lycopersicum Saladet ‘Río Grande’), 3 de melón (Cucumis melo cantaloupe), 2 de chile (Capsicum annuum ‘Jalapeño’) y 2 de pepino (Cucumis sativus). De las 30 muestras, en 4 se amplificó la banda esperada de aproximadamente 500 pb, correspondiente a un segmento de la CP del CMV (Figura C). Dos aislamientos se obtuvieron de Tecomán: uno de melón (CMV-Mel) que mostraba mosaico en la localidad Caleras (19° 02’ 40” N, 103° 54’ 04.9” O) y el otro de vinca (CMV-Vin) (18° 54’ 52” N, 103° 52’ 45.7” O) a partir de plantas con mosaico y deformación foliar (Figuras 1A y 1B). Un tercer aislamiento se identificó de chile (CMV-Chi) en el municipio de Armería (18° 55’ 36” N, 103° 58’ 32.5’’ O) en tejido foliar con amarillamiento, mosaico y deformación. El cuarto aislamiento se detectó en tomate (CMV-Tom) procedente de Cuauhtémoc (19° 19’ 42” N, 103° 36’ 08.1” O), en plantas que mostraban mosaico y distorsión foliar.

Figura 1 (A) Tejido foliar de melón cantaloupe y (B) vinca infectados con CMV y RNA satélite (en el caso de vinca) mostran do mosaico y deformación foliar. (C) Producto amplificado de la CP del CMV y (D) RNA satélite por RT-PCR pun to final en un solo paso. Carril 1: marcador de masa molecular de 100 pb (Promega®); Carril 2: control positivo (extracto de RNA bicatenario de Nicotiana glauca infectada con CMV y RNA satélite); Carril 3: control negativo (extracto de RNA de tejido foliar de Catharanthus roseus negativo a CMV y RNA satélite); Carril 4: control negati vo (agua grado PCR); Carril 5: muestra de tomate (CMV-Tom); Carril 6: muestra de vinca (CMV-Vin); Carril 7: muestra de chile (CMV-Chi); Carril 8: muestra de melón (CMV-Mel). Análisis filogenético de (E) aislamientos de CMV y (F) RNA satélite obtenidos en Colima en comparación con secuencias nucleotídicas obtenidas de GenBank- NCBI. 

El tamaño de los productos de la secuenciación de la CP de los cuatro aislamientos del CMV obtenidos en este estudio osciló de 455 a 479 pb, con porcentajes de identidad nucleotídica entre 94% y 97% con otros aislamientos reportados en la base de datos del GenBank de este mismo virus.

Tres de los cuatro aislamientos de CMV del presente estudio mostraron poca variabilidad entre sí, pero fueron diferentes del aislamiento de tomate (CMV-Tom); es posible que se observe mayor variabilidad entre aislamientos si se incrementa el número de especies vegetales analizadas. De acuerdo al análisis filogenético, el CMV-Tom agrupó con aislamientos del subgrupo IA y más cercanamente con un aislamiento de banano procedente de Colombia (U32859). CMV-Vin, CMV-Chi y CMV-Mel agruparon con el subgrupo IB (Figura E). Los aislamientos del subgrupo I se encuentran principalmente en zonas tropicales y subtropicales mientras que los del subgrupo II son prevalentes en zonas templadas (^{Palukaitis et al., 1992}).

Sólo en el aislamiento CMV-Vin se detectó un RNA satélite (Figura D), con un tamaño estimado en 381 pb por secuenciación y con 91% de identidad nucleotídica con otros aislamientos del mundo. Este satélite agrupó con otros aislamientos sin dominio necrogénico (X86424, X54065, X69136 y X86409) (Figura F). Este resultado muestra la necesidad de estudiar el comportamiento biológico del satRNA, particularmente la sintomatología que se observa en su presencia, así como su posible efecto en la transmisión del CMV por áfidos, entre otros aspectos.

A pesar del bajo número de aislamientos del CMV obtenidos y caracterizados en este estudio, los resultados confirman la presencia de CMV en el estado de Colima y sugieren diversidad entre los mismos. El presente estudio sienta las bases para continuar con el análisis de un mayor número de muestras con la finalidad de profundizar sobre esta observación.

En conclusión, se reportan en el estado de Colima, tres nuevos aislamientos de CMV en chile, tomate y vinca, éste último con un RNA satélite sin dominio necrogénico. A su vez, se confirma la presencia del CMV en melón cantaloupe en el municipio de Tecomán.