El municipio de Los Reyes, Michoacán, México, es el principal productor de zarzamora (Rubus subgénero Eubatus) en el país, aportando más del 80% de la producción nacional anual, la cual asciende a más de 260 mil toneladas (^{SIAP-SAGARPA, 2012-2018}). El cultivo de zarzamora es afectado por diversas especies de hongos fitopatógenos, causando pérdidas en la producción y económicas significativas, hasta un 25% equivalente a 2,540 millones de pesos anuales. Entre las principales enfermedades que afectan al cultivo de zarzamora se han reportado el moho gris (Botrytis cinerea), la roya anaranjada (Arthuriomyces peckianus), la mancha de la hoja (Cercospora sp.), la antracnosis (Colletotrichum gloeosporioides), el mildiú (Peronospora sparsa), y la pudrición de la raíz (Fusarium sp.) (^{Fernández-Pavía et al., 2012}). Sin embargo, las condiciones edafo-climáticas cambiantes, como consecuencia de las prácticas agrícolas intensivas y el cambio climático, han inducido la aparición de diversos fitopatógenos emergentes con impactos negativos en la producción de cultivos agrícolas de interés económico, social y cultural. Por lo tanto, la correcta identificación y caracterización de dichos fitopatógenos emergentes es importante para proponer estrategias de control eficientes.

En 2017, predios comerciales de zarzamora ubicados en los municipios de Los Reyes y Peribán, Michoacán (19° 32’ 3.728’’ N y 102° 31’ 12.503’’ O) mostraron plantas en etapa vegetativa, enfermas con necrosis de hojas, ramas y tallos (con una progresión basipétala), seguido por defoliación y muerte de la planta (Figura 1A). Estos síntomas no habían sido descritos para patógenos comúnmente reportados en el cultivo de zarzamora, por lo que se procedió a la colecta de tejido vegetal afectado, principalmente tallos necróticos de 5 plantas. Las muestras colectadas fueron preservadas en cámaras húmedas a 4 °C para ser transportadas al laboratorio para su análisis inmediato, con el fin de identificar el agente biológico causal de dichos síntomas. Para el aislamiento del patógeno, las muestras se desinfectaron superficialmente con 3 lavados de cloro al 2% y lavados con agua destilada estéril, posteriormente se trituró el tejido en un mortero estéril. Secciones de 0.5 cm fueron sembradas en cajas de Petri con Agar Dextrosa Papa (PDA), para favorecer el crecimiento de hongos. Las cajas de Petri inoculadas se incubaron a 30 °C en obscuridad durante 48 horas. Las colonias fúngicas observadas fueron resembradas bajo las mismas condiciones de cultivo para la purificación de los aislados. Los aislados mostraron un rápido crecimiento micelial (1.5 cm en 6 h) de color blanco (24 h) (Figura 1B), posteriormente tornándose color negro (³48 h) (Figura 1C). Adicionalmente, se realizaron preparaciones, utilizando azul de bromofenol (observadas en un microscopio óptico) para determinar las estructuras de reproducción reportadas para el género Lasiodiplodia, tales como: abundante crecimiento micelial conformado por hifas y conidios septados maduros (Figura 1D y 1E), ovoides a elipsoides con contenido granular y ápice redondo (^{Alves et al., 2008}). Un aislado fúngico monospórico, AB1, fue preservado con el código ZPQ1 en la Colección de Microorganismos Edáficos y Endófitos Nativos-COLMENA (^{de los Santos-Villalobos et al., 2018}).

Figura 1 Aislamiento y caracterización morfológica y de infección del fitopatógeno Lasiodiplodia sp. AB1. A) Tejido de zar zamora necrosado, material del que se obtuvo el aislamiento de Lasiodiplodia sp. AB1. B) Micelio de Lasiodiplodia sp. AB1 a los 5 días de crecimiento. C) Micelio de Lasiodiplodia sp., cepa AB1 a los 10 días de crecimiento. D) Coni dios maduros. E) Porción del micelio de Lasiodiplodia sp., cepa AB1, teñido con azul de bromofenol. F) Plántula de zarzamora var. ‘Tupi’ crecida in vitro. G) Plántula de zarzamora var. ‘Tupi’ infectada con Lasiodiplodia sp., cepa AB1, las flechas indican zonas necróticas. 

Para la identificación molecular de AB1, se partió de la extracción del ácido desoxirribonucleico (ADN) a partir del micelio del hongo (1 mg), el cual se colocó en 0.2 mL de buffer TES, mezclando vigorosamente la suspensión; posteriormente se adicionaron 5 mg mL^-1 de proteinasa K, acetato de amonio y se realizó el lavado con etanol al 70% e isopropanol en frio. Finalmente, el etanol residual se evaporó de la pastilla y el ADN se resuspendió en agua desionizada. La calidad y concentración del ADN extraído fue verificada mediante un gel de agarosa-TAE al 1% y un espectrofotómetro NanoDrop 2000c de la marca Thermo Scientific. El ADN fúngico extraído se utilizó para la amplificación del gen 18S RNA ribosomal usando los oligonucleótidos universales NS1 (GTAGTCATATGCTTGTCTC) y NS8 (TCCGCAGGTTCACCTACGGA); así como, la región intergénica (ITS) con los oligos ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) e ITS5 (TCCTCCGCTTATTGATATGC) (^{Toju et al., 2012}). Los amplicones resultantes fueron analizados por electroforesis en un gel de agarosa-TAE al 1%; posteriormente fueron purificados usando el kit The Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System de Promega, para ser secuenciados por una compañía comercial (Macrogen, Korea). Las secuencias de ADN obtenidas fueron analizadas mediante BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) para obtener la identidad/afiliación taxonómica del aislado fúngico. La secuencia del gen 18S RNAr del aislado AB1 obtenida fue de 1,050 pares de bases (pb) (No. de acceso NCBI: MG757345.1), dicha secuencia mostró una alta cobertura (100%) y similitud (99.52%) con Lasiodiplodia theobromae y Lasiodiplodia parva. La secuencia ITS tuvo una longitud de 539 pb (No. de acceso NCBI: MK841036.1), exhibiendo una identidad del 99.81% con múltiples aislados de Lasiodiplodia theobromae y Lasiodiplodia parva (Cuadro 1). Lasiodiplodia es un género fúngico que comprende, al menos, 30 especies (^{Rodríguez-Gálvez et al., 2017}), las cuales han sido asociadas a diversas enfermedades de cultivos agrícolas de importancia económica, en donde dicho agente causal se encuentra como un endófito latente. Con base en la identificación molecular del gen 18S RNAr y la región ITS ADNr, el aislado AB1 ha sido afiliado al género Lasiodiplodia sp., hasta realizar más estudios para clasificar este aislado a nivel de especie.

Adicionalmente, se realizaron ensayos de patogenicidad del aislado AB1 para corroborar su papel como agente causal de los síntomas observados en las plantas de zarzamora. Para confirmar los postulados de Koch, se realizó un ensayo de infección in vitro, en el cual, se micropropagaron plántulas de zarzamora de la variedad “Tupi”, colocando tres plantas por frasco, a las que posteriormente se les inocularon 1x10⁶ esporas del aislado AB1 (plantas control fueron asperjadas con agua destilada estéril). Las plantas se incubaron por 5 días en una cámara de crecimiento Percival AR66L, bajo una temperatura constante de 22 °C y un fotoperiodo de 16 horas luz y 8 horas obscuridad. Posterior al tiempo de inoculación del aislado AB1, todas las plantas inoculadas mostraron síntomas similares a los observados en los predios comerciales, clorosis, así como zonas con necrosis en hoja y tallo. Además, la cepa AB1 fue re-aislada y caracterizada de dichas plantas sintomáticas. Lo anterior demuestra que Lasiodiplodia sp., cepa AB1, tiene la capacidad de infectar plantas de zarzamora var. “Tupi”, cultivo del que fue aislado (Figura 1F y 1G). Estudios adicionales están en proceso para determinar la patogenicidad en plantas de mayor edad en invernadero y su biocontrol con bacterias antagonistas.

En conclusión, con base en observaciones morfológicas, la caracterización molecular y el cumplimiento de los postulados de Koch, se identificó por primera vez en México -hasta donde sabemos-, según la revisión de literatura técnica, que el aislado AB1 perteneciente al género Lasiodiplodia es el agente causal de los síntomas observados en plantas de zarzamora en predios comerciales ubicados en el municipio de Los Reyes, Michoacán. Dicha identificación proveerá información de importancia para el manejo integrado de esta enfermedad, con el fin de evitar posibles brotes epidemiologicos en el cultivo y pérdidas económicas.