Sclerotium cepivorum, es un hongo que causa la enfermedad conocida como pudrición blanca en el género Allium (cebolla, ajo, puerro) (^{Castillo et al., 2016}). Esta enfermedad afecta a la planta, en cualquier etapa de desarrollo y su infección se incrementa a medida que crece el sistema radical y el bulbo, presenta esclerocios, que son estructuras de resistencia estimulados por compuestos de azufre presentes en los exudados radicales de la planta como aquil cisteína y sulfóxidos; que son persistentes y de fácil diseminación (^{Elshahawy et al., 2017}). En México la enfermedad se encontró por primera vez en Zacatecas en 1990 (^{Reveles-Hernández et al., 2014}). Sclerotium cepivorum ocasiona baja calidad y rendimiento y por ende grandes pérdidas económicas. Se han utilizado diversos productos químicos como tebuconazol, mancozeb y captan para erradicar a este patógeno (^{Hussain et al., 2017}). Sin embargo, por características epidemiológicas del patógeno, los esclerocios una vez establecidos en el suelo pueden permancer hasta 40 años (Reveles-Hernández et al., 2014), además, el inadecuado uso de los fungicidas ha ocasionado un impacto negativo sobre el medio ambiente y su aplicación resulta costosa. Una alternativa para reducir el uso de estos productos y aminorar el impacto ecológico, se han utilizado hongos y bacterias nativas para suprimir la pudricicón blanca, por la capacidad biocontroladora (^{Vega-Celedón et al., 2016}; ^{Kumbhar et al., 2018}) y de biofertilizantes con rizobacterias (^{Moreno et al., 2018}).

Las rizobacterias promotoras de crecimiento vegetal (RPCV) que se encuentran en la rizosfera promueven el crecimiento y reducen la incidencia de las enfermedades (^{Glick, 2012}; ^{Hussain et al., 2017}). Dichas rizobacterias se clasifican de acuerdo a sus mecanismos de acción; unos actúan en el desarrollo de la planta para incrementar la disponibilidad de nutrientes por medio de la producción de ácido indolacético (AIA), actividad de la enzima ácido 1-aminociclopropano-1-carboxilico desaminasa (ACC desaminasa) que regulan los niveles de etileno, mediante la transformación de ACC en α-cetobutirato y amonio, fitohormonas sintetizadoras de auxinas, entre otros (Glick, 2012; ^{Esquivel-Cote et al., 2013}). Otros intervienen en la disminución del efecto nocivo de fitopatógenos a través de la producción de sustancias antagónicas (tetrasulfuros, tioles, tiofenos y dióxido de azufre) y sideróforos que secuestran el hierro presente en el medio y consecuentemente estará limitado para el patógeno (Glick, 2012), este parámetro ha tomado gran interés, debido al potencial que tienen para ser utilizados en el control biológico de fitopatógenos de hongos y bacterias (^{Aguado-Santacruz et al., 2012}). Así mismo, las RPCV son tolerantes a condiciones de salinidad y evitan el estrés causado por factores bióticos y abióticos (^{Datta et al., 2011}; Esquivel-Cote et al., 2013). Debido a lo anterior, el objetivo del estudio fue evaluar el pontencial in vitro de rizobacterias contra Sclerotium cepivorum causante de la pudrición blanca en cebolla.

Se colectaron seis muestras de suelo de la rizosfera de plantas de cebolla del predio ubicado en Santa Anita, municipio de Tlaquepaque, Jalisco, México. Para obtener aislamientos de rizobacterias se tomaron 10 g de suelo adherido a las raíces de la planta, se diluyeron en 90 mL de agua destilada, se realizaron diluciones seriadas (10^-7) y se inoculó 1 mL (tres ultimas diluciones) en cajas Petri con agar nutritivo (AN) y se incubaron a 37 °C por 24 h. Las cepas de RPCV se seleccionaron y purificaron de acuerdo a su morfología típica de las colonias y se conservaron para evaluar su efecto antagónico. Asimismo, el aislamiento de S. cepivorum, se realizó de acuerdo con ^{Vimard et al. (1986}), a partir de esclerocios de cebollas afectadas por pudrición blanca, se inocularon en medio Agar Dextrosa Sabouraud (ADS) y se incubaron a 20 °C. Se observó el desarrollo de micelio y esclerocios diariamente por 12 días (d) (^{Ortega-Aguilar et al., 2011}; ^{Rivera-Méndez et al., 2016}).

Posteriormente se realizó el antagonismo de rizobacterias sobre S. cepivorum. El hongo se cultivó en ADS y se extrajo un disco de micelio de 5 mm de diámetro que se colocó en el centro de la caja Petri del mismo medio y se incubaron a 20 °C por 3 d. A continuación, se inocularon cuatro repeticiones en cada caja mediante una estría de la misma rizobacteria alrededor del disco micelial perteneciente al patógeno y se incubaron a 20 °C. El testigo fue la inoculación del hongo en ausencia de rizobacterias y el experimento se concluyó cuando el hongo testigo cubrió el total de la caja Petri (^{Sarti y Miyazaki, 2013}). La prueba se realizó por duplicado; se midieron los halos de inhibición de las rizobacterias en S. cepivorum, adicionalmente se calculó el porcentaje de inhibición considerando el testigo como el crecimiento radial del hongo al 100 % .

Por otro lado, de las rizobacterias que presentaron mayor inhibición sobre el hongo, se procedió a caracterizarlas en función de sus propiedades promotoras del crecimiento vegetal. Lo cual consistió en la identificación mediante la morfología colonial, tintorial y metabolismo (con la tarjeta del sistema VITEX 2 (bioMérieux^MR), siguiendo las especificaciones del proveedor). Se caracterizarón las funciones de RPCV, con la evaluación de la presencia de la actividad del ACC desaminasa, sideróforos, tolerancia a NaCl y producción de AIA. La actividad enzimática se determinó inoculando las bacterias en un medio mínimo de sales (MM), suplementado con 0.3 g L^-1 de ACC, se incubaron a 37 °C por 24 h (^{Luna et al., 2013}), en AN se determinó la tolerancia a salinidad a diferentes concentraciones de NaCl (1.5 hasta 12%). La actividad ACC desaminasa, y tolerancia a NaCl (^{Sánchez et al., 2016}), se registró como positiva en aquellas bacterias que crecieron en estos medios.

Para determinar la producción de AIA se realizó mediante una reacción colorimétrica utilizando el reactivo de Salkowski (^{Glickmann y Dessaux, 1995}). Las pruebas se realizaron por triplicado de cada uno de los aislados selecionados; los datos se correlacionaron con una curva estándar de AIA (de 0 a 30 ppm) y se cuantificó la concentración de AIA de las muestras. Para la producción de sideróforos por las RPCV se determinó utilizando el medio cromo azurol S (CAS) de acuerdo a la metodología de Schwyn y Neilands (^{Louden et al., 2011}). Así mismo, se procedio a realizar la prueba de sensibilidad a antibióticos, por medio del método de Kirby Bauer (^{Bernal y Gúzman, 1984}). Se prepararon suspensiones bacterianas a una concentración de 1.5 × 10⁷ UFC mL^-1 y se inocularon en cajas Petri con agar Mueller Hinton; posteriormente se colocó un multidisco^® (Bio-Rad) con doce antimicrobianos y se incubaron a 37 °C por 24 h. Se registró el diámetro de la zona de inhibición y se determinaron los perfiles de resistencia y sensibilidad a los mismos.

Por otro lado, se realizó la cinética bacteriana de cada aislado seleccionado en condiciones axénicas, para este propósito se inoculó 1 mL de pre-inóculo de la bacteria a una concentración de 1×10⁸ UFC mL^-1 en 50 mL de infusión de papa considerado como tiempo inicial (tiempo 0). Posteriormente se incubaron a 30 °C por un periodo de 32 h, durante este tiempo cada 2 h se determinó la absorbancia a 595 nm en espectrofotómetro (modelo 7305 Jenway). Adicionalmente, en cada tiempo se tomaron dos alícuotas; una se utilizó para determinar la tasa de crecimiento bacteriano (UFC), colocando 1 mL del inóculo en cajas AN, se incubaron a 30 °C y se cuantificaron UFC cada 4 h, la otra alícuota se usó para la obtención de Extractos Libres de Células (ELC). Para la obtención de los ELC se centrifugaron a 11,000 rpm por 10 min se filtró a través de una membrana de nitrocelulosa de 0.22 µm. El efecto antagónico de los extractos se evaluó por el método de excavación en cajas Petri con medio ADS de acuerdo con Mitidieri (1998) mecionado por ^{Ariza y Sánchez (2012}). Esta prueba se realizó por triplicado de cada uno de los aislados en un tiempo especifico obtenido y un testigo (pozos con PDA en ausencia de ELC). Por último, se determinó la sobrevivencia de las rizobacterias a diferentes porcentajes de humedad y temperaturas. Se formaron tres tratamientos con diferentes porcentajes de humedad (50, 75 y 100%) en 10 g de suelo previamente esterilizado por autoclave por triplicado, cada tratamiento se inoculó con las cepas Bacillus y se sometieron por separado a dos temperaturas, a 24 y 37 °C para ver el efecto de sobrevivencia de las rizobacterias a las dos temperaturas y se incubaron por 15 d (^{Arribalzaga, 2007}).

Se aislaron 656 rizobacterias y el hongo Sclerotium cepivorum de plantas de cebolla. El hongo se aisló e identificó mediante sus caracteres morfológicos descritos en las claves taxonómicas de ^{Sarmiento y Velandía (2013}). De la diversidad bacteriana aislada, solo 23 aislados mostraron actividad antagónica y solo tres de estos fueron mayores a 20 mm y los porcentajes de inhibición de las rizobacterias contra S. cepivorum fueron entre 21 y 24% (Cuadro 1). De los tres aislados seleccionados, se confirmaron como bacilos positivos formadores de esporas, mediante el sistema VITEX 2 con la tarjeta reactiva, las pruebas bioquímicas confirmaron ser dos cepas Bacillus subtilis (1 y 2) y la tercera como B. amyloliquefaciens, con una confiabilidad del 95%. Estas características han sido reportadas por otros autores para el género Bacillus (^{Calvo y Zuniga, 2010}).

El efecto antagónico de los aislados de Bacillus sobre S. cepivorum, puede deberse a la posible producción de moléculas antimicrobianas como lipopéptidos que han sido reportadas en rizobacterias (^{Sarti y Miyazaki, 2013}; ^{Villarreal-Delgado et al., 2018}). El Comité de Acción de Fungicidas Resistentes (FRAC por sus siglas en inglés), en el año 2018 enlistó a Bacillus subtilis y B. amyloliquefaciens como productoras de sustancias antifúngicas clasificadas en el grupo F, estas actúan en el transporte o síntesis de lípidos afectando la función e integridad de la membrana celular de los patógenos (^{FRAC, 2018}). Por otra parte, ^{Sánchez et al. (2016}), reportaron que son capaces de producir iturinas y fengicinas que causan desequilibrios osmótico en las esporas y actividad antifúngica contra hongos filamentosos, además de surfactina que inhiben la germinación de las esporas, excreción de enzimas antimicrobianas como β-glucosidasas y proteasas de hongos causantes de enfermedades foliares y de raíces (^{Da Silva et al., 2018}). Algunos autores han demostrado el potencial biocontrolador de B. subtilis, en el control del géneros Fusarium (^{Mejía-Bautista et al., 2016}), Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Sclerotium rolfsii (^{Paredes-Escalente et al., 2009}), entre otros. En el caso de B. amyloliquefaciens tiene capacidad antimicrobiana e induce a una respuesta de defensa en plantas (^{Soto et al., 2018}).

Los tres aislados presentaron actividad de ACC desaminasa que favorece el crecimiento de las plantas por su capacidad de convertir ACC en α-cetobutirato y amonio (^{Glick, 2014}), además de actuar contra patógenos (^{Latif et al., 2016}) y tolerar niveles de estrés bióticos y abióticos (^{Vurukonda et al., 2016}), tolerando concentraciones de NaCl hasta de 7.5% (1280 mM) (Cuadro 1). Esto indica su adaptación al estrés causado por salinidad (^{Mahmood et al., 2014}), además que estas cepas de Bacillus favorece la eficiencia del uso del agua (^{Esquivel-Cote et al., 2013}) ya que pueden influir en la reducción de estrés y regulación la biosíntesis del etileno (Glick, 2014) mediante la escisión enzimática del ACC (^{Jayakumar et al., 2018}).

Figura 1. Producción de AIA (ppm) con adición de triptófano por parte de aislados de Bacillus. Valores en promedio de tres repeticiones ± desviación estándar. Letras diferentes representan diferencia estadística (ANDEVA de una via p≤0.05). 

Para el caso de la producción de AIA, el Bacillus subtilis-1 fue significativamente mayor (Figura 1). ^{Luna et al., 2013} reportaron producción de índoles entre 2.3 a 6.8 mg L^-1 en cuatro cepas de Bacillus, esta variación depende del tipo de hospedante y ^{Kumar et al. (2015}) mencionan que el genero Bacillus spp. es productor de AIA y sideróforos. Los tres aislados de Bacillus produjeron sideróforos (Cuadro 1), la producción de estos, se ha documentado ampliamente en Bacillus subtilis y B. amyloliquefaciens (^{Villarreal-Delgado et al., 2018}). Estos metabolitos forman un complejo de hierro donde receptores proteicos reconocen específicamente a cada especie bacteriana; esto disminuye la disponibilidad del mineral en el suelo y se establecen una competencia por el hierro lo que es letal para bacterias patógenas (^{Glick, 2012}), esto se asocia a un mecanismo de defensa de la planta contra fitopatógenos (^{Ahemad y Kibret, 2013}), como fue demostrado en las cepas evaluadas contra S. cepivorum en el estudio. Los sideróforos antimicrobianos se sintetizan por lipopéptidos de los grupos de surfactina, fengicina e iturina, a través de la enzima péptido sintetasa no ribosomal. La unión de estos lipopéptidos a la membrana provoca despolarización, translocación y ataque a los componentes intracelulares; induciendo resistencia contra el patógeno (^{Jayakumar et al., 2018}). Estas rizobacterias, aumentan el hierro disponible en el hábitat natural (Tejera-Hernández et al., 2011) y permite la absorción de este mineral por la planta para constituir un mecanismo de promoción de crecimiento (^{Gouda et al., 2018}).

Con respecto a la prueba de sensibilidad, los tres aislados del género Bacillus mostraron un perfil de sensibilidad a 30 µg de los antibióticos de cefalotina, amikacina, clorafenicol, ceftriaxona, y resistentes a penicilina (10 U). Esta prueba de sensibilidad representa la actividad metabólica de cada una de las bacterias afectada por diferentes factores, que influyen en la promoción de crecimiento y actividad antifúngica. Esta capacidad de transferir el material genético de la bacteria, propicia mecanismos adicionales de resistencia natural contra ciertas enfermedades (^{Gutiérrez et al., 2017}); actualmente se aplican antibioticos en la producción de cultivos que pueden repercutir negativamente en el crecimiento de las bacterias, formación de biopelículas, producción de índoles y la supervivencia de las bacterias en la planta (^{Klein et al., 2017}).

En el caso de la cinética bacteriana de cada aislado evaluado mostraron comportamientos similares en su desarrollo bacteriano; una fase de latencia constante hasta las 4 h, incrementó su desarrollo logarítmico hasta las 15 h; finalmente, la fase estacionaria se presentó hasta las 24 h; este comportamiento depende de la cepa bacteriana. Los metabolitos generados en la fase estacionaria mostraron un efecto inhibitorio contra el hongo, el ELC de tiempo 16 horas generó una inhibición del 25% y los extractos de 20 y 24 horas mostraron mayor efecto hasta el 35%. Esto puede estar relacionado a lo reportado en el género Bacillus, que como parte de su metabolismo libera productos tóxicos y forma metabolitos activos fúngicos como gramidicina, que fueron efectivos in vitro en el control de 23 diferentes fitopatógenos (^{Rodríguez et al., 2017}). Algunos autores han demostrado que los ELC de Bacillus presentaron antagonismo sobre Xanthomonas campestris pv. campestris (^{Da Silva et al., 2018}) y Fusarium oxysporum (Rodríguez et al., 2017). Tanto los aislados y sus ELC de las rizobacterias en estudio, están relacionados con su efecto antagónico, de acuerdo a las características metabólicas evaluadas y con sus metabolitos producidos activos contra el hongo en estudio.

Finalmente, en el caso del estudio de la sobrevencia de las rizobacterias a diferentes condiciones, mostraron que la temperatura de 24 °C con una humedad del 50%, B. subtilis presentó el mayor porcentaje de sobrevivencia con 57.5% y el menor B. amyloliquefaciens con el 42.9% (Figura 2). Las tres rizobacterias mostraron que en la mayoría de las condiciones evaluadas no existen diferencias significativas en los índices de sobrevivencia con respecto a temperatura y humedad.

Figura 2 Sobrevivencia de rizobacterias a diferentes porcentajes de humedad (50, 75 y 100 %) y temperaturas de 24 y 37 °C. Valores en promedio de tres repeticiones ± desviación estándar. Letras diferentes en la misma condición de temperatura y humedad representan diferencia estadística (Kruskal-Wallis p≤0.05). 

Estos resultados sugieren una buena adaptación de estas rizobacterias a las condiciones de temperatura de cultivo in vitro del hongo. Algunos autores mencionan que existe una gran diversidad de bacterias capaces de vivir en diversos ambientes. La temperatura puede afectar a la célula en la estructura, procesos vitales de los microorganismos, velocidad de crecimiento, composición química y la actividad enzimática (^{Calvo y Zúñiga, 2010}); sin embargo, en las condiciones evaluadas en la presente investigación se observó un comportamiento similar en el género Bacillus, esto se relaciona a las características proporcionadas por las endoesporas, estructuras de resistencia, que sobreviven a ciertas condiciones de humedad y temperatura, además promueven factores de trascripción involucrados en el proceso de esporulación, lo que favoreció el proceso de adaptación y la capacidad de antagonismo microbiano (^{Gouda et al., 2018}; ^{Soto et al., 2018}).

En conclusión las rizobacterias del genero Bacillus de este estudio y los compuestos generados en la fase estacionaria demostraron in vitro actividad antifungica contra S. cepivorum, además de las características funcionales y metabolicas de RPCV como actividad ACC, tolerancia a NaCl (hasta 7.5%), cinética bacteriana y sobrevivencia. Muestran cepas biológicamente activas que tienen efecto en el control de patógenos y capacidad de producir sustancias promotoras de desarrollo vegetal. De acuerdo con lo anterior, son una alternativa sustentable para reducir el impacto por los efectos negativos al uso de agroquímicos, evitando altos costos de producción, la degradación de los suelos y la contaminación del ambiente. Así mismo, biofertilizantes en el control de S. cepivorum en cultivos de cebolla.