La familia Orchidaceae constituye uno de los grupos de plantas más diversos. En su aprovechamiento sobresale el uso ornamental, aromatizante, medicinal, artesanal y comestible. En el proceso de cultivo in vitro se presentan microorganismos endófitos, contaminantes del medio de cultivo. Estos se encuentran comúnmente de forma natural en el interior de las plantas, induciendo efectos diversos, como estimulación en la germinación de las semillas y/o en el crecimiento de la planta (^{Tsavkelova, 2011}; ^{Wilkinson et al., 1989}) pero pueden ser devastadores cuando los tejidos vegetales se cultivan in vitro. La búsqueda de nuevas alternativas para la prevención y/o erradicación de los contaminantes resulta una labor importante (^{Cruz et al., 2006}).

Los explantes de tejido vegetal pueden llevar contaminantes en su superficie y/o en su interior. Aquellos que los llevan sobre su superficie se pueden eliminar mediante la desinfestación, pero los que se encuentran dentro del tejido son difíciles de erradicar, lo que impide cumplir con uno de los requisitos básicos para el éxito de la micropropagación de cualquier especie vegetal, que es mantener los cultivos libres de microorganismos contaminantes (^{Ramírez-Villalobos et al., 2000}). No obstante, los microorganismos pudieran jugar un papel importante como antagonistas de agentes fitopatógenos (^{Ocegeda-Reyes et al., 2020}), aunque no necesariamente los resultados de los ensayos in vitro reflejan lo que sucede in vivo (^{Whitaker and Bakker, 2019}).

La presencia de microorganismos durante el cultivo in vitro de tejidos vegetales ocurre sobre todo cuando la planta donante crece directamente en el campo y está expuesta a plagas, enfermedades, polvo y otros agentes (^{Ramírez-Villalobos y Salazar 1997}). También este fenómeno ocurre debido a las características anatómicas propias de la especie, tales como la presencia de tricomas en las hojas y tallos, que impiden la penetración de los desinfestantes. La eliminación de estos microorganismos puede deberse al empleo de técnicas inadecuadas de asepsia en el laboratorio (^{Alvarado, 1998}).

Las bacterias endófitas son a menudo difíciles de detectar porque permanecen dentro del tejido del hospedante, y por no ser fitopatógenas pueden permanecer inadvertidas, con reducidas tasas de multiplicación y enraizamiento de las plantas, pudiendo inclusive morir. La presencia de microorganismos en el medio de cultivo se debe también a la deficiente desinfestación o esterilización, que puede mejorarse con la manipulación apropiada de los equipos (^{Red y Tanprasert, 1995}). Con base en lo anterior, el presente trabajo tuvo como objetivos identificar bacterias endófitas presentes en Prosthechea citrina y evaluar antibióticos para su eliminación.

Se colectaron plantas jóvenes de Prosthechea citrina, antes de floración, en dos localidades de un bosque de pino-encino con coordenadas 17° 20’ 012” N, 96° 30’ 654” O y 17° 19’ 890” N, 96° 30’ 774” O, para los sitios 1 y 2, respectivamente, a 2104 m, en Ixtlán de Juárez, sierra norte de Oaxaca. La desinfestación se inició con un enjuague con agua destilada. A los bulbos se les retiraron las brácteas membranosas, y bajo condiciones asépticas, se realizó un enjuague con alcohol al 70% durante un minuto, seguido de tres enjuagues con agua destilada estéril. Finalmente se sumergieron en una solución de hipoclorito de sodio al 1.5% durante 30 min y se volvieron a enjuagar tres veces con agua destilada estéril.

Despues de la desinfestación, se diseccionó a cada planta en pseudobulbo, base, parte media y ápice de las hojas, a fin de identificar posible especificidad de órgano de la planta en donde se pudieran encontrar los microorganismos. Para su aislamiento se frotó un asa bacteriológica en el tejido vegetal interno y se sembró, por estría cruzada, sobre placas con medio LB, Luria Bertani: (peptona de caseína 10 g L^-1, extracto de levadura 5 g L^-1, NaCl 10 g L^-1 y agar bacteriológico 15 g L^-1) (^{Bertani, 1951}) y se incubaron a 37 °C durante 48 h. Después de este período se procedió a la purificación de las colonias bacterianas resultantes.

Para la identificación no molecular se realizaron pruebas bioquímicas con base en la guía de ^{Schaad et al. (2001}). Con la finalidad de separar a las bacterias Gram positivas y Gram negativas se realizó la prueba Ryu (Schaad et al., 2001). En un portaobjetos se colocó una gota de hidróxido de potasio al 3% y se mezcló con una colonia bacteriana, si la mezcla formaba hilo correspondían a bacterias Gram negativas, y si la mezcla no formaba hilo eran Gram positivas. Respecto a la morfología celular, se colocó en un portaobjetos una gota de agua destilada estéril y se mezcló con una pequeña cantidad de bacterias, se fijó la bacteria flameando el portaobjetos y una vez evaporada el agua se le añadió una gota de cristal violeta al 0.1 N y se observó al microscopio óptico a diferentes amplificaciones. Para determinar movilidad, después de mezclar una muestra de bacterias en una gota de agua, se colocó cuidadosamente el cubreobjetos, para ser observados al microscopio óptico. Para determinar la producción de endosporas, en un tubo de ensayo con agua destilada estéril se suspendió una colonia bacteriana y se puso en baño maría durante 30 min. Posteriormente, se tomó una alícuota de la suspensión y fue sembrada en una caja de Petri con medio LB, con la finalidad de detectar si la bacteria formaba endosporas. Para determinar si las bacterias tenían un metabolismo aeróbico estricto o aeróbico facultativo se utilizó el medio de ^{Hugh y Leifson (1953}). La bacteria se inoculó por picadura con un asa de siembra, y se incubo en condiciones de aerobiosis (sin aceite mineral estéril) y de anaerobiosis (con aceite mineral estéril). Para la prueba de oxidasa, se expuso a las bacterias al reactivo N,n,n,n-tetrametil-p-fenilendiamina (o TMFD) o N,N-Dimetil-p-fenilendiamina (o DMFD), cuya coloración cambia, lo que indica que la bacteria es aeróbica, o transparente si es anaeróbica. También se hizo la prueba de la catalasa, mezclando una suspensión de bacterias con peróxido de hidrógeno para ver si la catalasa lo rompía. De ser así, se forman burbujas de oxígeno, lo que indica que la bacteria es aeróbica.

La identificación molecular se inició con la secuenciación del ADN ribosomal 16 S, que se obtuvo siguiendo lo reportado por ^{Chye et al. (2013}). La extracción del ADN bacteriano se llevó a cabo de acuerdo a las indicaciones del juego de extracción mini ADN easy plants, de Qiagen^®, Hilden, Alemania, La cuantificación del ADN se realizó partiendo del supuesto que una unidad de absorbancia a 260 nm es igual a 50 ng µL^-1 de ADN de doble cadena (Rickwood y Hames, 1990). La calidad del ADN fue inferida mediante el cálculo de la relación espectrofotométrica A260/A280 (Genesys 10 UV Scanning, Thermo scientific, Waltham, Massachusetts). El programa de PCR fue: predesnaturalización a 94 °C por 1 min, desnaturalización a 94 °C por 30 s, alineación de 40 ciclos de 10 s a 95 °C, 30 s a 55 °C, y 30 s a 72 °C y el periodo de terminación 72 °C por 10 min (Matson et al., 2015). Los productos de PCR se secuenciaron en el laboratorio MacroGen^® (10F, 254 Beotkkot-ro, Geumcheon-gu, Seopul 08511 República de Corea del Sur). Las secuencias obtenidas de la región del gen 16S del ARN ribosomal en este estudio se compararon con secuencias de organismos de referencia, a través de la base de datos BLAST del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Estados Unidos). A las secuencias resultantes se les obtuvo la complementaria con el programa CHROMAS. Posteriormente, con el programa DNASTAR se obtuvo la secuencia consenso y finalmente las secuencias fueron corridas en el algoritmo BLASTN del NCBI, para determinar el grado de homología que guardaban con respecto a las secuencias depositadas en la base de datos publicada en el GenBank.

Con el fin de identificar algún antibiótico que pudiera controlar las cepas bacterianas aisladas, se evaluaron cuatro antibióticos: rifampicina (20 µg mL^-1), oxitetraciclina (10 µg mL^-1), ampicilina (100 µg mL^-1) y tetraciclina (10 µg mL^-1), por el metodo de disco-placa, Se cuantifico el diametro de los halos de inhibicion bacteiana a las 24 y 48 h de crecimiento. Estos datos fueron tratados mediante una analisis de varianza de medias en un diseño completamente al azar de los cuatro tratamientos con igual número de repeticiones, considerándose como unidad experimental a un disco-placa (ANAVA, SAS). Los testigos, sin antibiótico, no se consideraron para el análisis estadístico porque fungieron únicamente como marcos de referencia de los crecimientos, al no presentar halos de inhibición en ninguno de los dos períodos de incubación.

Se obtuvieron aislamientos de diferentes partes de la planta con el fin de identificar posibles especificidades de tejido de colonización. Se encontraron siete tipos coloniales de bacterias, que se identificaron preliminarmente con letras (Cuadro 1), que fueron sometidas a las pruebas bioquimicas y a la secuenciación del gen ARNr 16S (Cuadro 2). Las pruebas bioquímicas no arrojaron diferencias entre los aislamientos incluidos en los cuadros; todas fueron Gram negativas, bacilos con movimiento, sin producción de endosporas y positivos para las pruebas de fermentación, oxidación y catalasa (datos no incluidos) por lo que aparentemente todos corresponderían a una misma especie. No obstante, las colonias de los aislamientos A, B, C, D y E, presentaron una coloración café amarillenta, convexas, brillantes y superficie lisa, con un olor fétido, diferente a los otros dos aislamientos (F y G), lo que condujo a identificar a las primeras como Aeromonas hydrophila. Las colonias de los aislamientos F y G mostraron una coloración beige, convexa, opaca y borde ondulado sin olor, que se identificó como del género Enterobacter (^{Hugh y Leifson, 1953}; ^{Ramos et al., 2007}; ^{Schaad et al., 2001}). Lo anterior se respalda con la comparación de la homología de secuencias de ARNr 16S con la base de datos del GenBank, pues indicó que los aislamientos A, B, C, D y E correspondieron a la especie de Aeromonas hydrophila y las colonias F y G a Enterobacter sp (Cuadro 2). Una vez confirmada la identificación molecular, se observó la especificidad de tejido de colonización, pues los dos géneros y la mayoría de los aislamientos se obtuvieron del bulbo y de la base de la hoja, mientras que Enterobacter no se aisló de las partes medias y apicales de las plantas (Cuadro 1). La identificación se ajusta con las formas de las colonias. Esto es, que los crecimientos de los cultivos A, B, C, D y E son similares entre sí, correspondiendo a A. hydrophyla, pero diferentes a F y G, que también son similares entre ellos y que corresponden a Enterobacter.

Respecto a la acción de los antibióticos, la oxitetraciclina indujo la media más alta de inhibición en A. hydrophila, estadísticamente diferente a los demás tratamientos, seguido de tetraciclina, tanto a las 24 como a las 48 h de exposición. La rifampicina y la ampicilina ejercieron inhibición limitada al crecimiento de A. hydrophila. En general, resalta que para los cuatro antibióticos se observó una reducción en los halos de inhibición de las 24 a las 48 h. Esto es, las colonias continuaron su crecimiento a pesar de la presencia de los antibióticos. Para Enterobacter sp., las medias más altas de inhibición se obtuvieron con la ampicilina, significativamente diferente a los demás, seguido de la tetraciclina, oxitetraciclina y en último lugar a la rifampicina. De igual manera que con A. hydrophila, los halos de inhibición redujeron de diámetro de las 24 a las 48 h (Cuadro 3).

Son limitados los reportes de Aeromonas hydrophila como bacterias endófitas de las plantas (^{Aytac y Gorris, 1994}; ^{Chye et al., 2013}; ^{Ginestrea et al., 2005}; ^{Pérez-Cordero et al., 2014}). En la presente investigación se reporta por primera vez a A. hydrophila asociada a la orquídea silvestre Prosthechea citrina, sin ser patógena, pues se aisló de tejido firme, sin lesiones ni descomposición. Esta asociación se ha explicado como una relación en donde A. hydrophila tiene la capacidad de solubilizar fosfatos (^{Muleta et al., 2013}) y/o ejercer control biológico contra fitopatógenos (^{Gohel et al., 2006}). El género Enterobacter ya ha sido reportado como asociado a las orquídeas y al igual que en este estudio, con especificidad de tejidos (^{Fernándes et al., 2011}; ^{Ramos et al., 2007}). Se concluye que se encontraron dos especies de bacterias endófitas con especificidad de tejidos y que se pueden controlar con antibióticos.