En México, la jamaica (Hibiscus sabdariffa), es un cultivo de importancia económica, se cultiva para fines de consumo nacional y exportación; el estado de Guerrero es el principal productor con 14,294 hectáreas cultivadas que representan aproximadamente el 70% de la superficie nacional (^{SIAP, 2019}).

En años recientes la enfermedad conocida como manchado de la jamaica causada por el hongo Corynespora cassiicola, es capaz de alcanzar una incidencia del 100% y pérdidas totales del cultivo (^{Ortega-Acosta et al., 2015}; ^{Ortega-Acosta et al., 2019}), con valores de severidad en hojas y cálices superiores al 50%, con estos niveles de severidad el producto comercial (cálices) generalmente son desechados causando así pérdidas económicas a los productores (^{Ortega-Acosta et al., 2019}; ^{Ortega-Acosta et al., 2020a}). Además de la jamaica, C. cassiicola causa enfermedades severas en diversos cultivos como algodón (Gossypium hirsutum), soya (Glycine max), árbol del caucho (Hevea brasiliensis), entre otros y a nivel mundial se ha aislado en más de 530 especies de plantas (^{Nghia et al., 2008}; ^{Dixon et al., 2009}; ^{Fortunato et al., 2015}).

Actualmente el control de C. cassiicola ha sido con agroquímicos convencionales y alternativos (^{Vawdrey et al., 2008}; ^{Ortega-Acosta et al., 2019}; ^{Zhu et al., 2020}); sin embargo, a pesar de su eficacia, el uso frecuente de estas sustancias puede causar serios problemas ambientales y de salud (^{Hahn 2014}; ^{Ghosal y Hati, 2019}; ^{Weber y Hahn, 2019}). Es por ello, una de las alternativas para controlar de manera sustentable las enfermedades en plantas es el control biológico con microorganismos antagónicos, con la finalidad de limitar el desarrollo de los patógenos o reducir la severidad de los daños en el cultivo (^{Blakeman y Fokkema, 1982}; ^{Köhl et al., 2019}).

En estudios previos de control biológico para disminuir los daños de las enfermedades causadas por C. cassicola, se han evaluado bacterias como Pseudomonas flourescens, Bacillus subtilis, B. cereus y B. thuringiensis, en cultivos de pepino, jitomate y árbol de caucho (^{Romeiro et al., 2010}; ^{Rahman et al., 2010}; ^{Manju et al., 2019}, ^{Köhl et al., 2019}). No se encontraron estudios sobre el control biológico de la enfermedad del manchado de la jamaica causada por el hongo. Por lo que, los objetivos fueron determinar la capacidad de cepas bacterianas para inhibir el desarrollo de C. cassiicola in vitro y evaluar su control en hojas y cálices en condiciones de bioespacio.

Se utilizaron 100 cepas bacterianas del biobanco del Laboratorio de Microbiología Molecular y Biotecnología Ambiental de la Universidad Autónoma de Guerrero, aisladas de diversos ambientes; alimentos (20), piel de anfibios (41), jales mineros (22), aire (siete) y rizosfera (10). Para los estudios in vitro se usó la cepa C. cassiicola CCHFR (GenBank: KM207768) reportada por ^{Ortega-Acosta et al. (2015}). Todas las cepas bacterianas se emplearon para las pruebas antagónicas in vitro basadas en confrontaciones duales con el fin de seleccionar solo aquellas capaces de inhibir el crecimiento de la cepa CCHFR, la identificación bacteriana se hizo por morfología micro y macroscópica, usando el sistema automatizado Vitek2^® (^{Vargas et al., 2005}), para su posterior evaluación en ensayos de control biológico del manchado de la jamaica en bioespacio.

El ensayo para determinar el porcentaje de inhibición del desarrollo micelial in vitro, consistió de un fragmento micelial de 1 cm² obtenido de un cultivo de siete días de C. cassiicola (CCHFR), colocado en el centro de una caja de Petri con agar PDA (Agar Papa Dextrosa, Difco^®), enseguida se inocularon las bacterias, impregnando discos de papel filtro estéril de 6 mm con 20 µL de suspensión bacteriana a una densidad de 1×10⁸ UFC mL^-1 y se colocaron en cada punto cardinal a una distancia de 2.5 cm del hongo (^{Petatán-Sagahón et al., 2011}), incubadas a 25±2 °C por 21 días, como control negativo se utilizó discos con agua destilada estéril. Los ensayos por triplicado se aplicaron solo a las cepas con una inhibición >50%. Se fotografió cada ensayo y se utilizó el software ImageJ v.1.8.0 para obtener el área total del desarrollo micelial (^{Cuervo-Parral et al., 2011}).

El porcentaje de inhibición del crecimiento micelial se calculó con la siguiente formula:

Inibición de crecimiento %=Dc-DtDcx100

Donde

Dc: Crecimiento micelial de las placas control y Dt: Crecimiento micelial de las cajas de Petri tratadas (^{Durairaj et al., 2018}).

En un ensayo preliminar en bioespacio la cepa CCHFR presentó bajo nivel de patogenicidad (datos no mostrados), por lo anterior se realizó un muestreo en campo en el Pericón, Municipio de Tecoanapa, Guerrero, para lo cual se recolectaron hojas de jamaica con síntomas del manchado durante septiembre de 2019, siguiendo la metodología descrita por ^{Ortega-Acosta et al. (2015}); se aisló e identificó una cepa de C. cassiicola patogénicamente activa denominada CCPER4.

El material vegetal utilizado consistió en plantas de jamaica de la variedad “criolla” con tres meses de desarrollo, la siembra se hizo en macetas de polietileno (15×25 cm), como sustrato se usó una mezcla de suelo y composta (1:1). Para la fertilización se utilizó la fórmula 45-30-20 de NPK, con dos aplicaciones (^{Alejo, 2017}). No se realizaron aplicaciones de productos químicos para el control de plagas y enfermedades. Para evaluar el control biológico de C. cassiicola (CCPER4) se utilizaron únicamente las siete bacterias con inhibición del desarrollo micelial ≥50%, cada cepa fue considerada como un tratamiento con seis repeticiones, cada repetición consistió de cuatro macetas con plantas de jamaica (2 plantas/maceta), alojadas bajo un diseño completamente al azar, la unidad experimental fueron las dos macetas centrales/repetición, para esto se preparó e inoculó por aspersión una suspensión bacteriana de 1×10⁸ UFC mL^-1 sobre planta de tres meses de edad con un atomizador manual a punto de goteo. Después de 24 h se preparó e inoculó una suspensión de 2×10⁵ conidios mL^-1 de C. cassiicola (CCPER4) con un atomizador manual, todas las plantas fueron cubiertas con bolsas de polietileno transparente durante 72 h. Para el testigo positivo se asperjaron plantas de jamaica únicamente con conidios de C. cassiicola (CCPER4).

Las estimaciones de severidad de la enfermedad inducida por C. cassiicola (CCPER4) sobre cada tratamiento se realizaron mediante la estratificación de las plantas en tres niveles (bajo, medio y alto) (^{Villanueva-Couoh et al., 2005}), de donde se evaluaron cuatro hojas o cálices por cada estrato. Las estimaciones de la severidad se realizaron con dos escalas diagramáticas que fueron para hojas: 0=0, 1= (>0-2 a 4), 2=(>4-7 a 12), 3= (>12-19 a 29), 4= (>29-42 a 57) y 5=(>57-70 a ≤100) y para cálices: 0=0, 1=(>0-3 a 5), 2=(>5-10 a 18), 3=(>18-30 a 46), 4=(>46-63 a 77) y 5=(>77-87 a ≤100) (^{Ortega-Acosta et al., 2016}). La estimación de la severidad fue evaluada durante octubre a noviembre para hojas y de noviembre a diciembre para cálices. En hojas y cálices se registraron cuatro evaluaciones a intervalos de seis días, según la etapa fenológica. La temperatura y humedad relativa dentro del bioespacio fue estimada con un higrotermógrafo digital Extech^® RHT10.

Los datos obtenidos a partir de las pruebas de antagonismo in vitro fueron sometidos a un análisis de varianza y separación de medias (Tukey, p=0.01). Con los datos estimados de severidad de hojas y cálices de jamaica, se estimó el Área Bajo la Curva del Progreso de la Enfermedad (ABCPE) por cada tratamiento, con base en el método descrito por ^{Campbell y Madden (1990}), posteriormente se realizó un análisis de varianza y separación de medias (Tukey, p=0.01). Los análisis estadísticos se realizaron con el paquete estadístico SAS v 9.4.

De todas las 100 cepas evaluadas, siete se seleccionaron por obtener ≥50% de inhibición de C. cassiicola (CCHFR). De éstas, la cepa Serratia marcescens (M13ACD) mostró un 100% de inhibición (Figura 1, Cuadro 1), y las cepas de Acinetobacter lwoffii (A5), Klebsiella pneumoniae (M10-1 y M10-10), Sphingomonas paucimobilis (NF21), Serratia liquefaciens (M8ACD) y Acinetobacter sp. (5H2), mostraron diferencias estadísticas respecto al control; estas cepas fueron seleccionadas para realizar los ensayos de control en condiciones de bioespacio (Cuadro 1).

Figura 1. Actividad antagónica en medio PDA después de 21 días de cultivo a 27±2 °C. A= cepa Serratia marcescens (M13ACD) sobre C. cassiicola. B= Tratamiento control (C. cassiicola- CCHFR). 

La cepa CCPER4 mostró micelio denso y compacto, de color negro grisáceo, con conidios rectos a curvos, con pseudoseptos, cortos, de coloración marrón claro, con dimensiones de 57.0-308.2 x 10-20 µm (largo x ancho, respectivamente), características distintivas de C. cassiicola (^{Qi et al., 2011}; ^{Ortega-Acosta et al., 2020b}).

Con la inoculación artificial de C. cassiicola (CCPER4) se logró inducir la enfermedad del machado de la jamaica en condiciones de bioespacio. Los valores de severidad estimados del ABCPE del manchado en hojas y cálices de jamaica, permitieron determinar un efecto en la disminución de la enfermedad en todos los tratamientos bacterianos evaluados con respecto al tratamiento control.

Sin embargo, el efecto fue diferencial en hojas según la especie de bacteria inoculada (p=0.01), en cambio en cálices, todas mostraron el mismo efecto en la reducción de la severidad comparado con el tratamiento control (p=0.01). Así, por ejemplo, en hojas, los tratamientos inoculados con las cepas M10-1 y M10-10 (K. pneumoniae) mostraron los menores valores de severidad con 9.5 y 12.6 de ABCPE; mientras que las cepas de NF21 (S. paucimobilis), A5 (A. lwoffii), 5H2 (Acinetobacter sp.), M13ACD (S. marcescens) y M8ACD (S. liquefaciens), mostraron una disminución de la severidad de ABCPE con valores de 14.5 a 30.9 y, el tratamiento control registró la mayor severidad con 42.1 de ABCPE (Cuadro 1).

Por otra parte, en cálices, todas las cepas bacterianas mostraron una disminución significativa de la severidad con valores entre 8.6 a 17.1 de ABPCE y fueron estadísticamente similares, pero diferentes con respecto al control con 42.1 de ABCPE (Cuadro 1). Las condiciones de Temperatura y humedad relativa durante las evaluaciones fueron de 28 °C y 67% de humedad respectivamente.

A partir de la evaluación de las 100 cepas bacterianas, siete ejercieron un efecto en inhibir in vitro el desarrollo de C. cassiicola (CCHFR), las mismas que lograron reducir significativamente la severidad del manchado de la jamaica en condiciones de bioespacio. Los resultados indican que las bacterias estudiadas presentan potencial para ser evaluadas en trabajos posteriores como agentes de control biológico de la enfermedad del manchado de la jamaica bajo condiciones de campo y presión natural de inóculo.

En condiciones in vitro, S. liquefaciens (M8ACD) inhibió a C. cassiicola (CCHFR) en un 68%, S. marcescens (M13ACD) con un 100%, siendo la mejor en condiciones in vitro (Cuadro 1), la inhibición posiblemente puede ser causada por la producción de biosurfactantes (tipo serrawatina) que las cepas puedan producir (^{Shekhar et al., 2015}).

En cuanto a la severidad en hojas S. marcescens (M13ACD) y S. liquefaciens (M8ACD) tuvieron un 30.7 y 30.9 de ABCPE, respectivamente, estos resultados sugieren que las cepas de Serratia spp., muestran un mejor efecto in vitro similar a lo reportado por ^{Sabu et al. (2017}) quienes describen al género mencionado capaz de controlar in vitro a Pythium myriotylum y otros patógenos en el cultivo de jengibre (Zingiber officinale); sin embargo, el efecto ejercido en condiciones de invernadero fue significativamente menor en comparación con el resto de cepas utilizadas (^{Mustafa et al., 2019}).

En cuanto a las cepas de K. pneumoniae (M10-1 y M10-10) fueron las especies con mayor capacidad para reducir la severidad en hojas (Cuadro 1); sin embargo, en cálices el efecto fue similar al resto de los aislamientos bacterianos. Al respecto, ^{Dey et al. (2019}) evaluaron el efecto de una cepa de Klebsiella sp. para el control in vitro e in vivo de la enfermedad de pudrición de raíz en cultivos de frijol negro (Vigna mungo), ellos determinaron un buen control de la enfermedad, por lo que recomiendan su uso como agente de biocontrol.

Por otra parte, A. lwoffii (A5) inhibió el 62.7% del crecimiento de C. cassiicola in vitro, el cual resultó en un efecto similar al ejercido por las cepas de K. pneumoniae. Sin embargo, A. lwoffii ejerció una reducción sobre la severidad de la enfermedad en hojas al registrar una ABCPE de 18.8, siendo estadísticamente similar al efecto ejercido por las cepas de K. pneumoniae (M10-1 y M10-10), S. marcescens (M13ACD) y S. liquefaciens (M8ACD). En cálices A. lwoffii mostró una severidad de 9.1 de ABCPE, similar al resto de tratamientos bacterianos (Cuadro 1). En este sentido, ^{Trotel-Aziz et al. (2008}), mencionan que este género bacteriano es capaz de inducir resistencia en plantas de vid (Vitis vinifera), de esta manera evita la colonización de Botrytis cinerea y por consiguiente la disminución del daño. S. paucimobilis (NF21) mostró en condiciones in vitro una inhibición de 80.9%. En cuanto a la severidad en hojas y cálices fue de 14.5 y 13.1 de ABCPE, respectivamente. ^{Medina-De la Rosa et al. (2016}) describieron esta especie con efecto antagónico sobre Fusarium sp.

La cepa Acinetobacter sp. (5H2) logró una inhibición de C. cassiicola en un 69.4% y registró una severidad en hojas de 26.9 de ABCPE la cual fue similar a S. liquefaciens (M8ACD), y una severidad en cálices de 13.6 de ABCPE, estadísticamente similar al resto de tratamientos bacterianos. Estos resultados coinciden con lo reportado por otros autores, quienes mencionan que el uso de bacterias ejerce control de enfermedades causadas por C. cassiicola (^{Romeiro et al. 2010}; ^{Manju et al., 2019}).

No se encontraron reportes de las especies bacterianas evaluadas como agentes de control biológico de C. cassiicola, por lo que la presente investigación presenta las primeras evidencias de control biológico de C. cassiicola causante del manchado de la jamaica en Guerrero, mediante el uso y aplicación de especies bacterianas como K. pneumoniae, A. lwoffii, S. paucimobilis, S. marcescens y S. liquefaciens aisladas de diversos ambientes. Por lo que trabajos posteriores, podrían enfocarse en la evaluación de dichas bacterias bajo presión natural de inoculo de la enfermedad del manchado, además de integrar otras estrategias sustentables de control como la eliminación de malezas reservorios de C. cassiicola (^{Hernández-Morales et al., 2018}), rotación con sustancias químicas alternativas (^{Ortega-Acosta et al., 2019}), entre otras, a fin de disminuir el impacto del daño ocasionado por el patógeno en dicho cultivo.

Se obtuvieron siete bacterias aisladas de aire, jales mineros y piel de anfibio con potencial antagónico in vitro frente a C. cassiicola causante del manchado de la jamaica. Las cepas M13ACD (S. marcescens) y NF21 (S. paucimobilis) fueron las más efectivas para inhibir el desarrollo de C. cassiicola in vitro con 100 y 80.9% de inhibición, respectivamente. En bioespacio, M10-1 y M10-10 (K. pneumoniae), resultaron más efectivas en reducir la severidad del manchado en hojas al registrar valores de 9.5 y 12.6 de ABCPE, comparadas con el tratamiento control (45.7 de ABCPE). En cálices las siete cepas redujeron los niveles de severidad de la enfermedad con valores de 8.6 a 17.1 de ABCPE, el tratamiento control registró los mayores niveles de severidad con 42.1 de ABCPE.