El nopal (Opuntia spp.) se encuentra ampliamente distribuido en el continente americano, principalmente en la parte central, pertenece a la familia Cactaceae en donde la especie más importante debido a su valor económico es O. ficus-indica, la cual se cultiva tanto para la producción de frutos (tuna), como para consumo de cladodios (nopalitos) (^{Caruso et al., 2010}). Los usos son diversos, en general se utiliza en la industria alimenticia, medicinal y química, presenta un alto valor ecológico y simbólico (^{Márquez-Berber et al., 2012}). A nivel mundial, México es el principal productor de nopal verdura (O. ficus-indica), con una superficie sembrada de 12,799 ha. Las principales entidades productoras son: Morelos con 4,107 ha, Ciudad de México con 2,482, Estado de México con 1,016 y Tamaulipas con 957 ha (^{SIAP, 2019}). Sin embargo, como muchos otros cultivos, la productividad de este es afectada por varios factores, entre los que se encuentran los de índole fitosanitaria. En el municipio de San Juan Ixcaquixtla, Puebla se ha reportado la presencia de cladodios con síntomas de manchas de color café oscuro a negro, las cuales únicamente afectan la parte superficial (cutícula, epidermis y parte del parénquima); al término del ciclo de la enfermedad, las partes afectadas pueden desprenderse dejando ver cicatrices y deformaciones sobre el cladodio; dicha enfermedad se ha denominado como costra negra, la cual causa deformación y reducción del área fotosintética del nopal, con incidencia de alrededor del 60%. Síntomas similares, debidos a necrosis de tejido son causados por diferentes patógenos en nopal entre los que se incluyen a Fusarium sporotrichioides, Lasiodiplodia theobromae, asociados a la necrosis de cladodios (^{Swart y Kriel, 2002}); Pseudocercospora opuntiae, agente causal de la mancha negra del nopal (^{Ayala-Escobar et al., 2006}; ^{Quezada-Salinas et al., 2006}); Fusarium lunatum (^{Flores-Flores et al., 2013}) y Pectobacterium spp. (^{Torres-Bojórquez et al., 2016}). Los síntomas observados en San Juan Ixcaquixtla no coinciden con ninguno de los reportados por lo que el objetivo de esta investigación fue identificar el agente causal de la costra negra del nopal.

En la localidad de Santa Cecilia Clavijero, municipio de San Juan Ixcaquixtla (18° 26’ 25.80” N, 97° 47’ 35.63” O) Puebla, durante 2018-2020 se recolectaron cladodios con diferentes grados de avance de la enfermedad denominada costra negra. De tejido sintomático se cortaron trozos de 1 cm² de la zona de transición tejido enfermo-sano (conjunto cutícula-epidermis-colénquima). Los trozos se desinfestaron con hipoclorito de sodio (NaOCl) a 1% durante 1 min, se lavaron dos veces con agua destilada esterilizada, se secaron sobre papel secante estéril y se sembraron en cámara húmeda y en medio de cultivo papa-dextrosa-agar (PDA) para ser incubados a 25±2 °C durante cinco días. Las colonias de hongos desarrolladas y las estructuras formadas en cámara húmeda se transfirieron a medio papa-dextrosa-agar (natural: papa 200 g, dextrosa 14 g, agar 18 g, agua 1 L) adicionado con ácido láctico (1.5 mL al 10%), y se incubaron bajo luz blanca fluorescente continua a 25±2 °C.

Los hongos se purificaron mediante cultivos monoconidiales en agua-agar al 2% (W/V). La inducción de estructuras reproductivas se llevó a cabo en PDA a 25±2 °C. La identificación y descripción morfológica de los aislamientos se realizó con preparaciones temporales y permanentes que se observaron bajo microscopio compuesto (Virtue-N), la morfología y tamaño de 100 esporas de cada uno de los aislamientos a una magnificación de 40X. Para la determinación de la especie se siguieron claves taxonómicas y comparación con reportes existentes en la literatura científica (^{Boerema, 1993}; ^{Bensch et al., 2010}; ^{Bensch et al., 2012}; ^{Chen et al., 2015}; ^{Nam et al., 2015}; ^{Pan et al., 2018}; ^{Mapook et al., 2020}).

Se plantaron cladodios sanos en macetas con suelo estéril y se conservaron durante seis meses en un invernadero del Colegio de Postgraduados, México; a una temperatura de 24±3 °C y 70% de humedad relativa. Debido a que de manera consistente se aislaron tres hongos: Cladosporium cladosporioides, Aplosporella hesperidica y Didymella glomerata de los mismos trozos sembrados en medio de cultivo, la inoculación se realizó mediante dos métodos: por aspersión e inyección de conidios. Con la cámara de Neubauer se prepararon suspensiones a una concentración de 2×10³, 3×10³ y 6×10³ conidios mL⁻¹ para cada uno de los tres hongos aislados. La aplicación se realizó con aspersores manuales previamente desinfectados con una solución de hipoclorito de sodio al 1.5% y tres lavados con agua destilada estéril; y jeringa hipodérmica estéril, a cladodios previamente lavados con agua destilada estéril por triplicado. Los tratamientos inoculados fueron: C. cladosporioides a 6×10³ conidios mL⁻¹; A. hesperidica 6×10³ conidios mL⁻¹; D. glomerata 6×10³ conidios mL⁻¹; C. cladosporioides 3×10³ conidios mL⁻¹ + A. hesperidica 3×10³ conidios mL⁻¹; C. cladosporioides 3×10³ conidios mL⁻¹ + D. glomerata 3×10³ conidios mL⁻¹; A. hesperidica 3×10³ conidios mL⁻¹ + D. glomerata 3×10³ conidios; C. cladosporioides 2×10³ conidios mL⁻¹ + A. hesperidica 2×10³ conidios mL⁻¹ + D. glomerata 2×10³ conidios mL⁻¹; agua destilada estéril.

El método de inyección consistió en inyectar de manera subepidermal 1 mL de cada tratamiento, mientras que para el método de aspersión se asperjaron 4 mL de inóculo por ambas caras del cladodio. Cada tratamiento consistió de tres repeticiones (tres cladodios) con un diseño completamente al azar. El experimento se realizó por duplicado. Los cladodios inoculados se mantuvieron en invernadero en el Colegio de Postgraduados a una temperatura de 24±3 °C y 70% de humedad relativa hasta el desarrollo de síntomas. Los organismos que indujeron los síntomas de costra negra fueron reaislados para verificar su identidad y cumplir con los Postulados de Koch. De cladodios inoculados con síntomas similares a los observados en campo, se cortaron trozos de tejido de 0.5 cm, se lavaron tres veces con agua destilada esterilizada, se secaron y se sembraron en cajas de Petri con medio PDA natural para ser incubados bajo luz blanca fluorescente continua a 25±2 °C.

En campo, los síntomas causados por la costra negra, se caracterizaron por el desarrollo de manchas de 1 a 4 cm de diámetro, inicialmente de color café claro, las cuales con el tiempo se tornan de color café oscuro a negro, de consistencia húmeda y delimitada por tejido muerto de color claro. Cuando las manchas coalescieron, se desarrollaron áreas de gran tamaño que abarcaron, en algunos casos, hasta el 70% de la superficie de la cara de un cladodio. Las lesiones únicamente afectaron a la cutícula y epidermis sin afectar a los tejidos internos (colénquima, clorénquima, células del parénquima de almacenamiento, sistema vascular y médula). En estados avanzados, la parte afectada se desprende y cae al suelo, esto provoca deformaciones y daños en el área superficial fotosintética.

Del total de aislamientos obtenidos de síntomas de la costra negra, se identificaron y caracterizaron morfológicamente tres especies de hongos: 1) Cladosporium cladosporioides desarrolló colonias de color marrón-olivo por el frente y casi negras por el reverso; micelio inmerso principalmente, pero también aéreo; conidióforos solitarios, cilíndricos, de color pálido a marrón olivo, micronematosos, lisos, ocasionalmente verrugosos, surgiendo terminalmente de hifas ascendentes y no ramificados u ocasionalmente ramificados, uno de los septos superiores ligeramente oscurecido, donde se formaron los ramoconidios; conidios en cadenas largas y ramificadas que se desarticulan fácilmente, en su mayoría aseptados, elípticos a limoniformes, pálidos a marrón olivo y lisos, de 3.0-5.5 × 2.5-3.0 µm, estas características fueron consistentes con las reportadas por ^{Bensch et al. (2010)}, ^{Bensch et al. (2012)} y ^{Nam et al. (2015}). 2) Aplosporella hesperidica formó colonia con micelio ligeramente elevado, con hifas aéreas blancas en la superficie, extendiéndose desde el centro, anverso de la colonia de color blanco. Conidiomata de 398 × 516 µm, semi-inmerso, erumpente, uniloculado, en grupos, globoso, marrón oscuro. Conidióforos reducidos a células conidiogénicas. Células conidiogénicas hialinas, holoblásticas, oblongas o cilíndricas a ampuliformes. Conidios 18×12 µm, de color marrón, aseptados, elipsoides a ovalados. Las características corresponden con las reportadas para esta especie por ^{Mapook et al. (2020}). 3) En Didymella glomerata, las colonias inicialmente fueron de color blanco, posteriormente se tornaron de color verde olivo a marrón oscuro. Conidios, desarrollados en picnidios ostiolados, de forma elipsoide, unicelulares, hialinos, de 5.0×3.0 µm. Picnidios de color café oscuro, de 70×90 μm. Estas características morfológicas coincidieron con lo reportado por ^{Boerema (1993}), ^{Chen et al. (2015}) y ^{Pan et al. (2018}).

En las plantas de nopal inoculadas, la aparición de síntomas se inició a los 50 d después de la inoculación. Los cladodios que presentaron síntomas fueron únicamente aquellos inoculados mediante el método de inyección de conidios y mediante la combinación de los tres hongos, es decir, C. cladosporioides, A. hesperidica y D. glomerata. Los cladodios inoculados con uno y la combinación de dos hongos, así como el testigo no presentaron síntomas. Los síntomas iniciaron con la aparición de lesiones de color café claro de 2 a 6 mm de diámetro (Figura 1A). Durante las siguientes dos semanas, las lesiones adquirieron un color de café oscuro a negro y delimitadas con tejido muerto de color claro (Figura 1B y C); estos síntomas correspondieron a los observados en campo en el municipio de San Juan Ixcaquixtla, Puebla. Los reaislamientos obtenidos de plantas inoculadas coincidieron con las características culturales y morfológicas de los aislamientos de plantas colectadas en campo, demostrándose así que C. cladosporioides, A. hesperidica y D. glomerata son los agentes causales de la costra negra en cladodios de nopal.

Cladosporium cladosporioides es el agente causal de la necrosis floral, pudrición y caída de frutos juveniles del papayo (Carica papaya) en México (^{Vásquez et al., 2012}); la mancha de hollín en mandarina (Citrus reticulata) en Japón (^{Tashiro et al., 2013}) y la pudrición del fruto en zapote mante (Pouteria campechiana) en México (^{Nabor-Romero et al., 2018}). Por otra parte, A. hesperidica ha sido reportado como saprófito en ramas muertas de Citrus aurantium en India (^{Rao, 1969}) y en tallos muertos de Chromolaena odorata (^{Mapook et al., 2020}); y como patógeno causando la pudrición temprana del tallo de Citrus sinensis en Zimbabue (^{Yang et al., 2017}). Por último, en el caso de D. glomerata, este ha sido reportado como patógeno causando el tizón de la hoja en pistacho (Pistacia vera) en Estados Unidos de Norteamérica (^{Moral et al., 2018}) y la mancha negra en kiwi (Actinidia chinensis) en China (^{Pan et al., 2018}), evidenciándose el impacto de estos patógenos en diferentes especies de importancia económica. A la fecha no se encontraron reportes de la interacción de estos tres hongos en el desarrollo de enfermedad en nopal ni en algún otro hospedante; únicamente se reporta a C. cladosporioides infectando cladodios de nopal en Brasil (^{Souza et al., 2010}). Por lo anterior, de acuerdo a la literatura científica, este es el primer reporte de C. cladosporioides, A. hesperidica y D. glomerata como agentes causales de la costra negra en nopal en México.

Figura 1 Pruebas de patogenicidad de Cladosporium cladosporioides, Aplosporella hesperidica y Didymella glomerata en nopal (Opuntia ficus-indica), en condiciones de invernadero. A) Síntomas iniciales, lesiones de color café claro, B) Desarrollo posterior de síntomas, manchas de color café oscuro a negro y delimitadas con tejido muerto de color claro, C) Cladodio con desarrollo de síntomas, cada lesión pertenece a un punto de inoculación mediante la inyección de conidios. 

Los patógenos que coexisten en un mismo hospedante pueden afectarse entre sí a través del antagonismo o beneficiarse con el sinergismo, en este último se han reportado diferentes interacciones, en Pisum sativum el desarrollo de tizón se incrementa con la coinfección de Mycosphaerella pinodes y Phoma medicaginis var. pinodella (^{Le May et al., 2009}); la mancha foliar del eucalipto es un complejo causado por numerosas especies de hongos del género Teratosphaeria (^{Crous et al., 2009}), en Sudáfrica se presentan dos especies Teratosphaeria juvenalis y T. verrucosa que coexisten en las mismas hojas e incluso en una misma mancha causando infección (^{Crous et al., 2009}). En este estudio los resultados mostraron que la presencia de los tres patógenos en el mismo órgano de la planta y en el mismo tiempo propicia el desarrollo de la enfermedad y su reproducción. Como ya se mencionó anteriormente, los tres hongos son responsables de causar síntomas similares; es decir pudrición y necrosis, síntomas que también son característicos en la enfermedad de la costra negra del nopal. En subsecuentes trabajos se sugiere evaluar el intervalo de tiempo en la inoculación, con el objetivo de determinar si es indispensable la inoculación simultánea o cuales son los intervalos de tiempo en la cual se mantienen el carácter infectivo de los hongos C. cladosporioides, A. hesperidica y D. glomerata. Debido a que la costra negra representa una amenaza potencial para la producción de fruta y nopal verdura es necesario evaluar diferentes estrategias de control que permitan el desarrollo de planes de manejo. Asimismo, cabe señalar que es de importancia realizar estudios moleculares complementarios para corroborar la identidad de los agentes causales descritos en esta investigación.