El Aloe vera es un cultivo de gran importancia económica y relevancia para la agricultura y la industria en el mundo. México destaca como principal país productor y exportador de materia prima de sábila (^{Álvarez et al., 2012}). Tamaulipas es considerado el estado con mayor producción en el país y una superficie de siembra que va en aumento; sin embargo, se ha detectado la presencia de microorganismos fitopatógenos (^{Rubio et al., 2020}). Una de las limitantes que aumentan las pérdidas y afectan los rendimientos se deben al ataque de Fusarium spp., Penicillium spp. y Pectobacterium spp. (^{Jiménez, 2015}), de los cuales F. oxysporum se considera uno de los hongos fitopatógenos en Aloe vera, causante de la podredumbre de la base del tallo, amarillamiento, marchitamiento de las hojas y por consiguiente la muerte de la planta. Por otra parte, el género Erwinia se reportan en diferentes partes del mundo como agente causal de la pudrición bacteriana en raíz, tallo y hojas del Aloe spp. (^{Rubio et al., 2020}).

Las enfermedades causadas por fitopatógenos son controladas mediante productos químicos y los ingredientes activos más comunes contra Rhizoctonia solani, Fusarium solani y F. oxysporum son Carbendazim, Mancozeb, Fosetyl-Al, Hymexazol, Chinosol y Metalaxyl-M + Mancozeb (^{Mannai et al., 2018}). Sin embargo, el empleo de agroquímicos, ha generado diversas controversias debido a sus altos costos, toxicidad y daños ambientales (^{Nicolopoulou-Stamati et al., 2016}). Debido a esto se han buscado alternativas de control biológico, puesto que no genera efecto residual y contaminación (^{Pappas et al., 2020}). Existe un grupo importante de microorganismos que presentan efectos antagónicos frente a otros microorganismos fitopatógenos (^{Sánchez-León y Bustos, 2020}), entre los que destacan Bacillus subtilis y Trichoderma spp. que se caracterizan por ser microorganismos que muestran efectos antagónicos (^{Fiorentino et al., 2016}). Por ejemplo, Trichoderma harzianum y T. koningiopsis se han utilizado por poseer mecanismos de acción contra Fusarium solani (^{Miguel-Ferrer et al., 2021}). Además, tiene efecto antagónico frente a bacterias fitopatógenas pectolíticas ya que es capaz de inhibirlas un 32.4% (^{Astorga-Quirós et al., 2014}). Lo cual podría deberse gracias a sus propiedades enzimáticas, ya que secreta proteasas, quitinasas y glucanasa, que dañan la pared celular del hongo fitopatógeno causando una lisis que facilita el micoparasitismo (^{Ribeiro et al., 2019}). Por otro lado, Bacillus spp. es capaz de inducir crecimiento en plantas, aun cuando esta tenga su sistema radicular afectado por Fusarium spp. (^{Castro et al., 2019}). Además, se han reportado antagonismo en la confrontación de B. subtilis frente a Fusarium spp. (^{Solano-Báez et al., 2021}), ya que produce antibióticos y enzimas, así también ayuda a la solubilización de fosfatos y la fijación biológica del nitrógeno (^{Miljaković et al., 2020}). Por lo anterior, el objetivo de esta investigación fue determinar el efecto antagónico de cepas nativas de Bacillus spp., T. asperellum y T. harzianum frente a F. oxysporum y Dickeya chrysanthemi bajo condiciones de in vitro.

Las pruebas se llevaron a cabo en el laboratorio de microbiología de la Central Integral de Laboratorios (CILO), en la Facultad de Ingeniería y Ciencias de la Universidad Autónoma de Tamaulipas en agosto del 2019. Se utilizaron microorganismos nativos previamente identificados, pertenecientes al cepario del laboratorio de microbiología: T. asperellum, T. harzianum, F. oxysporum y D. chrysanthemi que fueron aislados de lotes con plantas de Aloe barbadensis.

Para obtener aislados de Bacillus se procedió a la recolección de muestras de suelo, se usó el método de cinco de oros, obteniendo cinco muestras de suelo de 1 kg de dos lotes de plantaciones de Aloe vera en la localidad de Padilla, Tamaulipas (23° 59’ 26.1” N, 98° 56’ 39.0” W). De cada muestra se tomaron 10 g de suelo y se resuspendieron en 90 mL de agua destilada estéril, se realizaron diluciones seriadas hasta 1×10^-3 y fue sometida a un tratamiento térmico de 85 °C durante 15 min, posteriormente se extrajeron 100 µL y se inocularon en medio papa dextrosa agar (PDA), se incubaron a 27± 1 °C durante un lapso de 24 a 48 h, transcurrido este tiempo se obtuvieron colonias de bacterias de morfología variada, las cuales fueron seleccionadas por sus características de inhibición.

Cada especie fue descrita macroscópicamente de acuerdo a la morfología de las colonias, forma, borde, elevación, superficie, tamaño, color, consistencia y acompañado de un registro fotográfico; además, se determinó su morfología celular mediante la tinción Gram y el tipo de pared de las especies a las 24 y 48 h de incubación, con el fin de observar la morfología microscópica a 100X (^{Calvo y Zúñiga, 2010}). Una vez que se comprobó la presencia de endosporas bacterianas, se tomó una muestra y se colocó en agar nutritivo (AN) durante 24 h a 27± 1 °C. Se realizaron las pruebas de maltosa, xilosa, manitol, utilización de citrato, hidrólisis de almidón, hidrólisis de gelatina, crecimiento en NaCl al 7% y crecimiento en agar anaerobio con el fin de identificar colonias de B. subtilis según la metodología propuesta por ^{Reinoso et al. (2006}). Para determinar las especies de bacterias de acuerdo con la metodología de ^{Schaad et al. (2001}), las bacterias fueron sometidas a pruebas para ver si eran capaces de hidrolizar gelatina, almidón, así como utilizar azúcares, citrato y alcoholes.

La capacidad antagonista de Bacillus spp. (B4 y B5) frente a F. oxysporum fue evaluada mediante dos tratamientos (B4 y B5) con cinco repeticiones cada uno a dos temperaturas de incubación. Para esto, se utilizó la metodología modificada de ^{Corrales et al. (2011}), que consistió en la siembra de F. oxysporum en el centro de las cajas Petri con medio PDA y AN; para el caso de Bacillus spp. se colocaron en los cuatro puntos cardinales. Para el caso del testigo solo se inóculo F. oxysporum. Enseguida se incubaron a 25± 1 °C y 27± 1 °C. Posteriormente, se midió el crecimiento radial de F. oxysporum cada 24 h, hasta que llenó la caja Petri y con los datos obtenidos se calculó el porcentaje de inhibición del crecimiento radial (PICR) y se empleó la fórmula utilizada por ^{Ávila et al. (2020}) y, según los resultados se estableció la escala propuesta por ^{Corrales et al. (2011)}. Además, se determinó el número de esporas, para ello se tomó un fragmento de medio PDA con F. oxysporum y se colocó en un tubo de ensayo con 1 mL de agua estéril, posteriormente se agitó durante 3 min, se realizó un conteo en una cámara de Neubauer y los resultados fueron sometidos a una comparación de medias.

Para T. asperellum y T. harzianum se colocaron 5 mm de micelio activo a 4 cm de distancia de F. oxysporum. Para los testigos se sembró F. oxysporum en el centro de las cajas Petri y se incubaron a 25± 1 ºC por 10 días y se realizaron mediciones cada 24 h del crecimiento radial de los hongos. El antagonismo de T. asperellum y T. harzianum se evaluó mediante el porcentaje de inhibición empleando la fórmula utilizada por ^{Ávila et al. (2020}). Además, se determinó el nivel de antagonismo de acuerdo a la escala utilizada por ^{Bell et al. (1982}).

Para evaluar la capacidad antagonista de Bacillus spp. frente a D. chrysanthemi se establecieron dos tratamientos B4 y B5. La metodología consistió en utilizar un sacabocado de 5 mm con la que se hicieron cuatro huecos en las cajas Petri con medio AN, aparte se preparó AN estéril mezclado con las bacterias de los tratamientos (B4 y B5) a una concentración de 1×10⁶ UFC, se realizó el rellenado de los huecos en los cuatro puntos cardinales. Posteriormente, las cajas se incubaron a 25± 1 °C durante 24 h, se preparó una suspensión de D. chrysanthemi a una concentración de 1×10⁶ UFC en un atomizador y se aplicó en cada tratamiento por aspersión. La variable a evaluar fue el halo de inhibición, y se midió el crecimiento cada 24 h durante una semana. Por otro lado, para medir la capacidad antagonista de T. harzianum y T. asperellum (TJ y TP) frente a D. chrysanthemi se utilizó la metodología de ^{Corrales et al. (2011}) con modificaciones, la cual consistió en colocar los aislados de D. chrysanthemi el centro de las cajas Petri y los de Trichoderma spp. en los cuatro puntos cardinales, para el testigo solo se inóculo D. chrysanthemi en el centro de la caja Petri y se incubaron a 25± 1 °C. Se realizaron mediciones del crecimiento radial de las colonias de D. chrysanthemi cada 24 h hasta que llenó la caja Petri. Posteriormente, se empleó la fórmula utilizada por ^{Ávila et al. (2020}) para el cálculo del porcentaje de inhibición y se ubicó la escala de ^{Bell et al. (1982}).

El análisis estadístico de las confrontaciones de antagonismo de Bacillus spp. frente a F. oxysporum; T. asperellum y T. harzianum frente a D. chrysanthemi y F. oxysporum se sometieron a un análisis de covarianza (ANCOVA). En el caso de Bacillus spp. contra D. chrysanthemi se utilizó un análisis de varianza (ANOVA), de igual manera para el conteo de esporas de las confrontaciones de Bacillus spp. frente a F. oxysporum con temperatura de 27± 1 °C con el fin de detectar diferencias entre los tratamientos, se aplicó una comparación de medias de Tukey (P<0.05), con el paquete estadístico SAS (versión 9.0).

Se aislaron 12 colonias de bacterias de morfología variada, de las cuales se seleccionaron dos bacterias (B4 y B5) por sus características de inhibición, las cuales presentaron características macroscópicas del género Bacillus, produciendo colonias blanquecinas, grandes, extendidas e irregulares. Fueron Gram positiva, forma bacilar, con motilidad y la posición de la espora central, la temperatura en la que se desarrollaron fue a 45 °C con un buen crecimiento y nulo a 65 °C; mostraron buen crecimiento a un pH de 5.7, se desarrollaron en NaCl al 7%. En la prueba de metabolismo oxidativo y/o fermentativo de la glucosa no tuvieron un crecimiento aeróbico y si mostraron degradación de la glucosa, los resultados de maltosa, manitol, arabinosa, xilosa, utilización de citrato, hidrólisis almidón, hidrólisis gelatina y oxidasa dieron positivo indicando que la bacteria Bacillus spp. pertenece a la especie subtilis.

Los resultados de las dos cepas de B. subtilis (B4 y B5) frente a F. oxysporum indicaron que no hubo diferencia significativa entre los aislados y ambas disminuyeron el radio de crecimiento (RCA) de F. oxysporum. No obstante, en la temperatura de incubación a 25± 1 °C, B4 presentó 49.6% de inhibición y se extendió alrededor del hongo mostrando competencia por espacio y nutrientes. En cuanto a la escala utilizada mostró la clasificación media. Por el contrario, B5 obtuvo un porcentaje de antagonismo de 39.7 % con una clasificación baja (Cuadro 1), su crecimiento fue lento; sin embargo, F. oxysporum mostró un micelio menos poblado y con una coloración de menor intensidad que en el testigo.

En la temperatura de incubación a 27± 1 °C (Cuadro 1), se observó que B5 mostró un incremento en el grado de inhibición con un 43.0 % y clasificación media según la escala propuesta por ^{Corrales et al. (2011}), esto debido a que la temperatura influyó en la producción de metabolitos, ya que se encontró un líquido con turbidez y olor. Por el contrario, B4 disminuyó su grado de inhibición a 38.7 % con una clasificación baja, produjo metabolitos que le permitieron disminuir el crecimiento del micelio. En este último experimento se observó que B4 y B5 presentaron una disminución de la producción de micelio algodonoso en la parte superior frontal (Figura 1). Dichos resultados fueron por debajo de los obtenidos por ^{Corrales et al. (2011)}, quienes reportaron porcentajes entre el 40 y 70 %, esta variabilidad se atribuye a que cada cepa cuenta con diferente adaptabilidad y quizás la síntesis de metabolitos secundarios sea dependiente de la temperatura de incubación, de tal manera que, dependiendo de la temperatura, se produzcan algunos metabolitos con menor o mayor efecto hacia este patógeno. En dichos resultados Bacillus spp. se comportan diferente, lo cual podría deberse a lo descrito por ^{Sánchez et al. (2015}), quienes mencionaron que existe una amplia diversidad fenotípica, bioquímica, serológica y genética incluso entre los miembros de una misma especie.

Figura 1 Efecto antagónico de cepas de B. subtilis (B4 y B5) frente a F. oxysporum (FLL); A) Aislamiento B4 a una tempe ratura de 25± 1 °C, rodea F. oxysporum mostrando competencia por espacio y nutrientes; B) Testigo de F. oxyspo rum; C) Aislamiento B5 a una temperatura de 27± 1 °C rodeando a F. oxysporum, mostrando producción de meta bolitos. 

De acuerdo a los resultados de la concentración de conidios, se observó diferencia significativa entre los tratamientos y el testigo; ya que el testigo obtuvo un promedio de 12.6 esporas por dilución, a diferencia de los tratamientos B5 obtuvo 1.3 y B4 2.6 esporas, esto prueba que los tratamientos causaron una disminución en la concentración de esporas y el color de F. oxysporum se vio disminuido y más tenue. El efecto del antagonismo de B. subtilis, podría deberse a su producción amplia de compuestos bioactivos, entre los que destacan los lipopéptidos cíclicos (CLP) como la surfactina, iturina y fengycina (^{Cochrane y Vederas 2016}). Además, Bacillus spp. produce antibióticos y enzimas (^{Miljaković et al., 2020}).

Figura 2 A) Trichoderma harzianum (1) rodeando a F. oxysporum (2) manifestando competencia por espacio y nutrientes en medio PDA; (B) T. asperellum (1) rodeando a F. oxysporum (2) mostrando competencia por espacio. 

En el análisis de covarianza de T. asperellum (TJ) y T. harzianum (TP) frente a F. oxysporum no hubo diferencias significativas. La confrontación de TJ presentó un crecimiento de 6.9 cm y un 70.5 % de inhibición (Cuadro 2); no obstante, TP presentó un crecimiento de 6.6 cm y un 69.2 % de inhibición, ambos tratamientos mostraron competencia por espacio y nutrientes; además, se observó que los radios de crecimiento de F. oxysporum disminuyeron conforme el radio de crecimiento de T. asperellum y T. harzianum crecía, por lo que se considera que hay antagonismo. Además, se observó que ambos aislados cubrieron la mitad de la superficie de la caja Petri en el día tres de la evaluación, gracias a su rápido crecimiento, competencia por espacio y nutrientes. Así mismo, se clasifican como clase dos donde Trichodermaspp. crece dos terceras partes de la superficie del medio; es decir, que este hongo cubre el 65 % de la caja Petri (Figura 2). Estos resultados fueron mejores a los reportados por ^{Rodríguez-García y Wang-Wong (2020}), quienes confrontaron cepas nativas de T. asperellum frente a F. oxysporum y reportaron hasta un 67 % de inhibición, siendo su mejor tratamiento ya que las cepas nativas mostraron ser las más agresivas contra el fitopatógeno. Los resultados podrían deberse a lo reportado por ^{Andrade-Hoyos et al. (2019}), quienes mencionaron que Trichoderma sp., cuenta con la facultad de ejercer micoparasitismo. Lo cual podría deberse a la producción de enzimas líticas, proteasas y la capacidad de producir una lisis en las hifas del hongo fitopatógeno penetrándolo, alimentándose de él, ya que las lecitinas que produce van degradando su pared celular. Además, produce quitinasa y las actividades -1, 3-glucanasa (^{Li et al., 2018}), degradando la pared celular fúngica, lo que limita el crecimiento del patógeno (^{Coban, 2020}). Los mecanismos de biocontrol antes mencionados, le permitieron al antagonista aprovechar mejor los nutrientes del medio y privar al patógeno de utilizar los recursos (^{García-Espejo et al., 2016}). Trichoderma sp., puede controlar una amplia gama de hongos fitopatógenos como: R. solani, F. solani, Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium (^{Martínez-Martínez et al., 2020}).

En el análisis de varianza de la evaluación de B. subtilis frente a D. chrysanthemi no se encontraron diferencias significativas. Se observó que B4 obtuvo un halo de 4.4 mm de ancho y B5 4.3 mm, causado por los metabolitos que produce la bacteria para inhibir D. chrysanthemi, mostrando antagonismo. Además, B. subtilis comenzó a colonizar y expandirse mostrando competencia por espacio y nutrientes sobrecreciendo a D. chrysanthemi (Figura 3). Resultados contrarios a los de ^{Sneha y Anuradha (2017}), evaluaron B. subtilis frente Pectobacterium carotovorum, y no encontraron la formación de halos de inhibición. Sin embargo, los resultados obtenidos en este experimento quedaron muy por debajo de los resultados reportado por ^{Gerayeli et al. (2018}), al evaluar Bacillus spp. frente a P. carotovorum reportaron halos de 10 mm. En dichos resultados Bacillus spp. se comporta diferente, este podría deberse a lo descrito por ^{Sánchez et al. (2015}) quienes mencionaron que en los miembros de una misma especie puede existir una amplia diversidad fenotípica, bioquímica, serológica y genética. Por otra parte, ^{Sneha y Anuradha (2017)} demostraron que Bacillus spp. tienen efecto antagónico frente a las bacterias pectolíticas como P. carotovorum.

Figura 3 A) Halo de inhibición del crecimiento de D. chrysanthemi por efecto del aislamiento B4; B) Aislamiento B4 sob recrece a la bacteria D. chrysanthemi mostrando competencia por espacio y nutrientes. 

En cuanto al análisis de covarianza de Trichoderma spp. frente a D. chrysanthemi se observó que no hay diferencia significativa entre tratamientos. El TJ mostró un porcentaje del 41.9 % y TP un 40.2 % y ambos rodearon D. chrysanthemi, los cuales presentaron competencia por espacio y nutrientes. Inicialmente, la bacteria era de apariencia cremosa, pero con el paso del tiempo se tornó con apariencia seca, su crecimiento se detuvo e incluso se observó un ligero crecimiento de micelio hasta el día de la evaluación. De acuerdo con la escala de ^{Corrales et al. (2011}), ambos tratamientos cuentan con una clasificación de antagonismo media. Dichos resultados fueron superiores a los reportados por ^{Astorga-Quirós et al. (2014}), quienes obtuvieron un 32.3 % de antagonismo al evaluar Trichoderma spp. frente a Pseudomonas marginalis, bacteria pectolítica que causan podredumbres blandas.

Las cepas nativas de T. asperellum y T. harzianum, resultaron antagonistas con inhibición de 39.7 a 49.6 % contra F. oxysporum y en la confrontación con D. chrysanthemi se obtuvo porcentajes de inhibición de 40.2 a 41.9 %. Para el caso de B. subtilis alcanzó un nivel medio de antagonismo frente a F. oxysporum a pesar de ser una bacteria confrontada frente a un hongo, y obtuvo un halo de inhibición de 4.4 mm frente a D. chrysanthemi.