Nota de investigación

 

Evaluación de la toxicidad de sedimento y agua de mar contaminados por el vertido de fuel del Prestige, mediante el uso de bioensayos con las almejas Venerupispullastra, Tappes decussatus y Venerupis rhomboideus y la microalga Skeletonema costatum

 

Assessment of the toxicity of sediment and seawater polluted by the Prestige fuel spill using bioassays with clams (Venerupis pullastra, Tappes decussatus and Venerupis rhomboideus) and the microalga Skeletonema costatum

 

J.C. Mariño-Balsa*, P. Pérez, P. Estévez-Blanco, L. Saco-Álvarez, E. Fernández y R. Beiras

 

Laboratorio de Ecoloxía Mariña (LEM) Facultad de Ciencias Universidad de Vigo, Vigo E36200, Galicia, España. *E-mail: mai@uvigo.es

 

Recibida en enero de 2003;
aceptada en febrero de 2003.

 

Resumen

En este estudio presentamos los primeros resultados obtenidos del control de la contaminación producida por el accidente del petrolero Prestige en la costa de Galicia. Para evaluar la toxicidad del agua y el sedimento expuestos al fuel, se realizaron tres tipos de bioensayos: usando almejas juveniles, embriones de almeja y una microalga. En los primeros, se evaluó el comportamiento de enterramiento de Venerupis pullastra y Tappes decussatus durante las primeras 24 h, en dos muestras de sedimento procedentes de dos playas expuestas, una de ellas contaminada por fuel y la otra aparentemente limpia. No se encontraron diferencias significativas entre los dos tipos de sedimento. En segundo lugar se estudió el éxito en la embriogénesis de Venerupis rhomboideus después de la incubación en agua de mar y lixiviados de sedimento recogidos en las zonas afectadas. En este caso, el agua contaminada con fuel mostró una marcada inhibición de la embriogénesis, siendo moderada en los lixiviados. Al mismo tiempo se realizaron bioensayos, también con agua y sedimento de estas mismas zonas, con la diatomea Skeletonema costatum. La variable respuesta medida fue el máximo rendimiento fotosintético (Φ_po) usando un fluorómetro de repetición rápida de destellos (FRRF, por sus siglas en inglés). En el primer muestreo se observaron diferencias significativas entre el (Φ_po) medido en S. costatum cultivada en lixiviados y en agua control después de 5 h de exposición. Los resultados correspondientes al segundo muestreo proporcionaron valores significativamente más bajos de (Φ_po) en los cultivos en agua de M2 comparados con los del control, lo que indica que la fracción soluble del fuel resultó ser la más tóxica.

Palabras clave: bioensayos, almejas, microalga, fuel, Prestige.

 

Abstract

In this study we present the early monitoring of the pollution caused by the accident of the Prestige tanker off the Galician coast. To evaluate the toxicity of sediment and water exposed to fuel, three kinds of bioassays were carried out using juvenile clams, clam embryos and microalgae. Firstly, the burrowing behaviour of Venerupis pullastra and Tappes decussatus in the sediment collected from two beaches of similar characteristics but different pollution conditions, was studied over 24 h. No significant differences were observed between the two sediments. Secondly, embryogenesis success of Venerupis rhomboideus was recorded after incubation in seawater and elutriates obtained from affected areas. In this case, fuel-polluted seawater showed a marked inhibition of embryogenesis, while sediment elutriates showed moderate toxicity. Parallel bioassays with the diatom Skeletonema costatum were carried out using sediment elutriates and filtered seawater from the sampling sites. The response variable measured was the maximum quantum yield of photosynthesis (Φ_po) using a Fast Repetition Rate Fluorometer (FRRF). In the first sampling, significant differences were found in the response of S. costatum cultured in the elutriates as compared to the control after 5 h exposure. The results corresponding to the second sampling showed statistically significant lower values of (Φ_po) in the culture incubated in M2 water as compared with the control, indicating that the water-accommodated fraction of fuel at this site was the most toxic.

Key words: bioassay, clams, microalgae, fuel, Prestige.

 

Introducción

El 13 de noviembre de 2002, el petrolero Prestige comenzó a derramar fuel pesado muy cerca de la costa de Galicia, dando lugar a lo que, teniendo en cuenta los kilómetros de costa afectados, puede ser uno de los mayores accidentes de este tipo de la historia. Esta región es conocida por su riqueza marisquera y pesquera, con una gran dependencia económica del mar. Entre los bivalvos, tan sólo las almejas (Venerupis pullastra, Tappes decussatus, Venerupis rhomboideus) suman una producción anual de 3162 t. (38 x 10⁶ Euros) (SIP, 2002).

Los bioensayos de laboratorio son una importante herramienta para evaluar la toxicidad de un contaminante en el sedimento. En estos bioensayos se exponen los organismos a muestras de sedimento recogidas en el campo y, tras un tiempo de incubación, se mide su respuesta biológica, que debe ser sensible, ecológicamente relevante y fácil de estandarizar (Stebbing et al., 1980).

La velocidad y el comportamiento de enterramiento de las almejas son respuestas ampliamente empleadas para evaluar la toxicidad del sedimento (DelValls et al., 1998). Por ejemplo, Olla et al. (1983) estudiaron el efecto de un sedimento contaminado sobre el comportamiento de enterramiento de Mercenaria mercenaria. Por otra parte, el estudio del comportamiento de enterramiento de almejas juveniles en playas afectadas por el vertido proporciona una valiosa información para la regeneración y gestión de las áreas dañadas.

El desarrollo embrionario de bivalvos proporciona una respuesta rápida y sensible a la contaminación marina por hidrocarburos, con valores de EC₅₀ alrededor de 1 mg L^-1 (His et al. 1999).

Respecto a los bioensayos con microalgas, el efecto tóxico de los contaminates provoca una reducción significativa, o la inhibición de la fotosíntesis y el crecimiento algal. Este efecto se ve reflejado en variables como el máximo rendimiento foto-sintético (Φ_po), que refleja la eficiencia en la conversión de la energía lumínica en energía química y su posterior uso por los productores primarios. Esta variable proporciona información sobre el estado fisiológico de las algas y además da una respuesta sensible y relevante a la contaminación (Juneau et al. 2002).

El objetivo del presente estudio, todavía en curso, es evaluar la toxicidad del agua y sedimento contaminados por fuel sobre organismos representativos del bentos y del plancton.

 

Material y métodos

Recogida de muestras

Los puntos de muestreo (M1, M2 y M3) fueron elegidos en la costa oeste de Galicia, entre la Ría de Muros y la Ría de Arousa (tabla 1). El 29 de noviembre se hizo un muestreo en M1 y M2. M1 estaba afectada por la primera llegada de fuel desde hacía once días, y M2 estaba todavía limpia. En el segundo muestreo, realizado el 17 de diciembre, los tres puntos de muestreo estaban ya afectados. Las muestras recogidas se conservaron refrigeradas en botellas (agua) y en bolsas de plástico (sedimento). En cada estación de muestreo se cogieron tres muestras de sedimento (tomando los primeros 4 cm del sedimento con una paleta de madera). En la estación M3, sita en un roquedo, sólo se tomaron muestras de agua. Todos los experimentos se realizaron dentro de la semana siguiente a los muestreos, para evitar cualquier cambio en las propiedades químicas de las muestras. Los lixiviados de sedimento se realizaron mezclando sedimento con agua de mar control (1:6 v/v) en botes de plástico cerrados sin aire según Beiras et al. (en prensa). El agua de mar control se recogió en un lugar no contaminado, y fue filtrada a través de un filtro de fibra de vidrio Millipore APFF. Después de 30 minutos de mezcla rotatoria, los botes se mantuvieron en oscuridad a 18°C durante toda la noche, para permitir la deposición de toda la materia particulada. La tabla 1 muestra los parámetros físico-químicos medidos en el momento del muestreo. Los análisis químicos del fuel fueron realizados en el Instituto Oceanográfico Español de Vigo (tabla 1).

Bioensayos con almejas

El primer experimento se realizó con V. pullastra (10 mm de longitud) y el segundo con T. decussatus (de 5-6 mm) procedentes del Instituto Galego de Formación en Acuicultura (I.GA.F.A.) y del criadero de moluscos Punta Quilma. Los embriones empleados eran de V. rhomboideus. El comportamiento de enterramiento fue estudiado por duplicado en vasos de precipitado de 1 L, 4 cm de sedimento y 400 ml de agua de mar filtrada (6:4 sedimento:agua en volumen). Todos los vasos se airearon suavemente y se mantuvieron a una temperatura de 20 ± 1°C. En cada vaso se colocaron 10 almejas. Las almejas enterradas fueron registradas a diferentes tiempos de exposición. Una almeja se consideraba enterrada cuando ninguna parte de su concha era visible.

Se calculó el tiempo medio de enterramiento (ET₅₀) con una regresión no lineal siguiendo el modelo de Michaelis-Menten: Y = 100t / (ET₅₀ + t), donde Y era el porcentaje de almejas enterradas y t el tiempo en minutos. Se empleó un Modelo Lineal General (MLG) para medidas repetidas que ofrece análisis de varianza cuando se realiza la misma medida varias veces, en nuestro caso, el enterramiento de las almejas en cada vaso a distintos tiempos (test de Bonferroni, P < 0.05).

Bioensayos con embriones

La obtención de gametos tuvo lugar de forma natural como en Beiras y His (1994). Los adultos fueron colocados en tanques de acondicionamiento y, una vez comenzado el desove, se trasladaron a vasos de precipitados individuales; los gametos se observaron al microscopio para seleccionar los huevos de una sola hembra y se usó el esperma de un solo macho para la fecundación, en un probeta y con agitación suave. Después de la fecundación y antes de producirse la primera división, los huevos se introdujeron en viales de polipropileno de 20 mL a una densidad de 20 por mL. En cada experimento se ensayaron cinco réplicas por tratamiento. Los tratamientos consistieron en agua de mar sin diluir, y dos diluciones con agua de mar control: ½ y ¼.

Después de 48 h de incubación a 20°C en una cámara isotérmica, los viales se fijaron con unas gotas de formol al 40% y se observaron en un microscopio invertido. La respuesta final registrada fue el porcentaje de larvas D normales, observando una muestra de 100 individuos por vial. Una larva se consideró normal cuando la concha tenía una forma D marcada y el manto no sobresalía de la misma. Por otra parte, los demás individuos se clasificaron en tres clases: larvas-D anormales (sobresale el manto pero tienen forma D); larvas anormales (presentan concha pero no alcanzaron la forma D) y embriones (todavía sin presentar concha).

Se realizó el análisis estadístico con el porcentaje de la variable de larvas normales después de una transformación angular. Se observaron diferencias significativas (P < 0.05) entre tratamientos utilizando un test de Tuckey.

Bioensayos con microalgas

Los lixiviados y el agua recogida se filtraron utilizando filtros Millipore APFF de fibra de vidrio para retirar el microfitobentos y el fitoplancton de las muestras.

Todas las réplicas se inocularon con un cultivo de la diatomea S. costatum en crecimiento exponencial, para alcanzar una densidad final de 5000 células mL^-1. Las incubaciones se realizaron en Erlenmeyers de 2 L a 18°C bajo un ciclo de luz:oscuridad de 12:12 h. Todos los matraces se airearon con aire filtrado y se les añadieron los nutrientes correspondientes a 1/10 del medio de cultivo f/2 de Guillard. Para medir la variable Φ_po se utilizó un fluorómetro de repetición rápida de destellos (Fast Repetition Rate Fluorometer, Chelsea Instruments FAST^tracka titanium FRRF), con la cámara clara activada, en la que se midieron las muestras en oscuridad utilizando una cubeta de cristal óptico. Se midieron tres subréplicas de cada matraz tras ser adaptadas a oscuridad durante 30 minutos con el fin de permitir la relajación de la fluorescencia variable (F_v) (la diferencia entre la fluorescencia máxima, F_m, y la fluorescencia mínima F₀). Se calculó para cada subréplica el valor de Φ_po = F_v /F_m para, a continuación, calcular la media para cada matraz. Finalmente se estimó un valor medio por tratamiento a los distintos tiempos de exposición: 1, 5 y 24 horas.

Se compararon los valores de Φ_po obtenidos de los distintos puntos de muestreo utilizando un ANOVA, una vez comprobada la normalidad de los datos (test de Saphiro-Wilk) y la homocedasticidad (test de Levene) con el paquete estadístico SPSS. En el caso de encontrar diferencias significativas entre grupos, cada tratamiento se comparó con el control utilizando el test post hoc de Dunnett.

 

Resultados y discusión

Bioensayos con almejas

Las tasas de enterramiento de las almejas se muestran en la tabla 2. No se encontraron diferencias significativas en esta variable entre los tratamientos M1 y M2. Sin embargo, en el segundo experimento, las almejas expuestas al sedimento muestreado en M2 (una playa menos afectada por el vertido que M1) presentaron una ligera tendencia a enterrarse más rápido que las expuestas al otro sedimento. La ET₅₀ (en minutos) fue, para M1, 13.34 (8.64; 18.04), y para M2, 8.05 (-1.56; 17.66). Intervalo de confianza del 95% entre paréntesis. Estos valores son similares a los encontrados por DelValls et al., 2002, para sedimentos limpios o moderadamente contaminados. Las diferencias encontradas en la tasa de enterramiento entre experimentos, comparando los porcentajes de almejas enterradas después de 15 minutos de exposición, pueden ser debidas a las diferentes especies o tallas empleadas en ellos.

Respecto a los bioensayos con embriones, se detectó un efecto inhibitorio en el agua procedente de M3, una zona altamente afectada (fig. 1a). El porcentaje de larvas normales después de 48 h de incubación aumentó con el grado de dilución del agua de M3 con agua de mar control.

Por el contrario, el lixiviado obtenido con sedimento procedente de M1 (playa altamente afectada) resultó moderadamente tóxico, y únicamente una de las réplicas redujo la embriogénesis de forma significativa (P < 0.05, test de Tuckey) (fig. 1b).

Bioensayos con microalga

Los resultados obtenidos del muestreo del 29 de noviembre de 2002 se presentan en la figura 2a, b y c. No se encontraron diferencias significativas (P = 0.76) en Φ_po tras una hora de exposición. Sin embargo, después de 5 horas, los valores de Φ_po correspondientes a M1 y M2 fueron significativamente menores que en el control (P = 0.001; test de Dunnett, control vs. M1-M2: P < 0.001). Las diferencias entre tratamientos desaparecen después de 24 horas (P = 0.222).

En la figura 2d, e y f se representan los resultados correspondientes al segundo muestreo. En este caso se detectaron diferencias significativas en el matraz con agua procedente de M2 (M2a) después de 1 hora de exposición (P < 0,001; test de Dunnett). Esta diferencia se mantuvo a lo largo de todo el experimento, no detectándose actividad fotosintética después de 5 horas. Tras una comprobación del estado del cultivo al microscopio, no se encontró ninguna célula en M2a, mientras M1a y M3a presentaban una densidad celular media de 40,000 células mL^-1 después de 5 días de incubación.

En el momento del primer muestreo, M1 ya estaba afectada por la marea negra, mientras que M2 parecía aparentemente limpia. Después de 5 horas de exposición, los valores de Φ_po medidos en ambos lixiviados eran significativamente menores que los registrados en el control (fig. 2b), lo que puede sugerir que M2 también estaba afectada. Esta diferencia también puede atribuirse al hecho de que la microalga se cultivó en lixiviados, donde la concentración de sustancias disueltas y bacterias es mayor que en el agua usada como control. Esta posibilidad es consistente con la ausencia de diferencias significativas en Φ_po entre M1 y M2, pero no concuerda con los resultados obtenidos en el segundo muestreo (fig. 2d, e y f), donde no se encontraron diferencias significativas entre el control y los lixiviados a lo largo del experimento. En este caso, todos los puntos de muestreo estaban afectados por el vertido de fuel y las playas habían sido objeto de limpieza manual.

Respecto al agua de mar recogida, Φ_po medido en las muestras tomadas en M2 (M2a) tras 1 h, fue significativamente menor que en los otros tratamientos, y no se registró actividad fotosintética después de 5 h de exposición (fig. 2e) Este hecho se debe a la muerte del cultivo, puesto que tras 5 días de incubación no se encontró ninguna célula mediante la observación al microscopio. Estos efectos no se encontraron en el lixiviado correspondiente a este punto, lo que nos puede indicar que el agente tóxico del fuel para las microalgas radica en la fracción soluble.

Es conveniente la realización de más experimentos para confirmar lo encontrado en estos primeros estudios. Se está llevando a cabo un seguimiento de la contaminación cada 15 días, con el mismo esquema de muestreo utilizado el 17 de diciembre de 2002 pero aumentando la replicación.

 

Conclusión

Los resultados muestran que los sedimentos procedentes de playas moderadamente afectadas no inhiben la actividad de enterramiento en almejas juveniles. Este resultado conlleva implicaciones interesantes desde el punto de vista de la gestión de la repoblación en estas zonas, debido a que se podría considerar la siembra de las playas afectadas con juveniles de almejas. De todos modos, se deben realizar previamente experimentos de crecimiento a largo plazo.

Aunque se encontraron abundantes bolas de chapapote en estas zonas, los lixiviados no presentaron alta toxicidad. Esto indica que la toxicidad aguda del fuel envejecido, rico en compuestos de alto peso molecular, es relativamente baja para los organismos empleados en los bioensayos. Por el contrario, el agua recogida en una zona afectada (M3, con elevado hidrodinamismo) si mostró toxicidad importante en los embriones. Estos resultados deben de ser contrastados con estudios ecotoxicológicos futuros, prestando especial atención a la fracción soluble del fuel. También se debe completar con una batería de tests de toxicidad de sedimento y agua de mar.

 

Agradecimientos

Los autores de este trabajo quisieran agradecer a Iván Alonso y Verónica Benítez su ayuda en la toma de muestras, y a Sandra Ares, María Espiñeira, Kostka Fernández y Marcos Íñigo Pérez su ayuda técnica en el laboratorio. Las almejas fueron proporcionadas desinteresadamente por el criadero de Punta Quilma y el Instituto Galego de Formación en Acuicultura (I.GA.F.A.)

 

Referencias

Beiras, R. and His, E. (1994). Effects of dissolved mercury on embryogenesis survival, growth and metamorphosis of Crassostrea gigas oyster larvae. Mar. Ecol. Prog. Ser., 113: 95-103.

Beiras, R., Fernández, N., Bellas, J., Besada, V., González-Quijano, A. and Nunes, T. (2003). Integrative assessment of marine pollution in Galician estuaries using sediment chemistry, mussel bioaccumulation, and embryo-larval toxicity bioassays. Chemosphere (in press).

Byrne, P.A. and O'Halloran, J. (1999) Aspects of assaying sediment toxicity in Irish estuarine ecosystems. Mar. Pollut. Bull., 39 (1-12): 97-105.

DelValls, T.A., Forja, J.M. and Gómez-Parra, A. (1998). Integrative assessment of sediment quality in two littoral ecosystems from the Gulf of Cádiz, Spain. Environ. Toxicol. Chem., 17(6): 1073-1084.

DelValls, T., Forja, J.M. and Gómez-Parra, A. (2002). Seasonality of contamination, toxicity, and quality values in sediments from littoral ecosystems in the Gulf of Cádiz (SW Spain). Chemosphere, 46: 1033-1043.

His, E., Beiras, R. and Seaman, M.N.L. (1999). The assessment of marine pollution: Bioassays with bivalve embryos and larvae. A.I. Southerward, P.A. Tyler and C.M. Young (eds.), Advances in Marine Biology. Vol. 37. Academic Press, London, 178 pp.

Juneau, P., El Berdey, A. and Popovic, R. (2002). PAM fluorometry in the determination of the sensitivity of Chlorella vulgaris, Selenastrum capricornutum and Chlamydomonas reinhardtii to copper. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 42: 155-164.

Olla, B.L., Bejda, A.J. and Pearson, W.H. (1983). Effects of oiled sediment on the burrowing behavior of the hard clam, Mercenaria mercenaria. Mar. Environ. Res., 9: 183-193.

Stebbing, A.R.D., Akesson, B., Calabresse, A., Gentile, J.H., Jensen, A. and Lloyd, R. (1980). The role of bioassays in marine pollution monitoring. Bioassay Panel Rep., Rapp. P.-V. Reun. Cons. Int. Explor. Mer, 179: 322-332.