En las regiones tropicales y subtropicales, la alimentación del ganado bovino, ovino y caprino está basada en los pastos y forrajes, debido a la eficiencia con la cual estos animales digieren el material vegetativo y por ser un insumo más económico que los alimentos concentrados. El pasto buffel (Cenchrus cilia ris L.) es un recurso forrajero introducido en el Noreste de México, que cubre aproximadamente 1,000,000 ha (^{Gómez-de la Fuente et al., 2007}). Sin embargo, se ha detectado variabilidad en el contenido proteico y en los valores de digestibilidad de su pared celular, dependiendo de la variedad y del estadío fisiológico en el que se cosecha. Además de bajos valores de contenido nutricional en condiciones de sequía y de latencia invernal (^{Bernal et al., 2009}), afectando el aporte proteico y energético a los animales que lo consumen.

Lo anterior ha llevado a buscar estrategias que mejoren la disposición de componentes para incrementar su valor nutricional. Un ejemplo son las enzimas lignocelulolíticas para desarrollar preparaciones comerciales aplicables en dietas de animales (^{Beauchemin et al., 2003}), contribuyendo a una mejor asimilación, mejorando la producción de leche y la conversión alimenticia.

La producción de estas enzimas se ha limitado a pocas cepas de hongos, a pesar de que se han reportado diferencias en el tipo de enzimas presentes, así como en sus propiedades funcionales y cinéticas, incluso en individuos de la misma especie (^{Baldrian, 2005}). En el presente trabajo se exploró el potencial lignocelulolítico, de carbohidrasas y amilolítico de cepas nativas de Trametes maxima CU1, Pycnoporus sanguineus CS2 y T. hirsuta CS5, para su potencial aplicación en el incremento de la biodisponibilidad de nutrientes del pasto buffel; como referencia se utilizó una cepa de T. versicolor UAMH8272.

Las tres cepas nativas utilizadas para el presente trabajo fueron reportadas previamente como buenas productoras de celulasas, xilanasas y lacasas en medio sólido (^{Gutiérrez-Soto et al., 2015}). Sin embargo, esta fue realizada cualitativamente utilizando una escala de signos en función del crecimiento y área de reacción, lo que no permitió hacer un análisis estadístico de los datos obtenidos. Por lo que en el presente trabajo se propone la estimación de un índice de actividad enzimática (I_ae) que arroje datos que puedan ser analizados estadísticamente, contribuyendo a una mejor comprensión del comportamiento metabólico de los hongos y explorar su aplicación en el mejoramiento de la calidad nutrimental del pasto buffel.

El ensayo se realizó de acuerdo a la metodología de ^{Sin et al. (2002)}, usando un medio base (Peptona 0.1%, Extracto de levadura 0.01% y Agar 1.6%). Como fuente de carbono se utilizaron los sustratos carboximetil celulosa, xilano y almidón (al 2%), para la detección de celulasas, xilanasas y amilasas, respectivamente. Éstas se revelaron al tercer día utilizando una solución de yodo-yoduro de potasio. Se midió el diámetro de crecimiento e hidrólisis para calcular un índice de actividad enzimática (I _ae ). El Iae para la lacasa, se estimó considerando la oxidación de la siringaldazina (0.02%) en el medio base. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. La detección de enzimas modificadoras de lignina (EML) fue realizada en el medio base con el colorante Poly R-478 0.04%, cuya degradación total en menor tiempo fue asociado a un alto potencial lignolítico (^{Hernández-Luna et al., 2008}). Los datos se analizaron con un modelo estadístico no paramétrico (Kruskal-Wallis) al día 3, 5, 7 y 15.

Posteriormente se prepararon 8 bloques de 300 g de pasto buffel, con un tamaño de partícula de 1 cm, el sustrato se colocó en bolsas de polipropileno. Se esterilizaron en dos ocasiones a 121 oC, por 60 minutos, se dejaron enfriar y se inocularon con 5 mL de un cultivo de cinco días de crecimiento (homogenizado en cuatro ciclos de 25 segundos), de cada uno de los aislados; se consideró un tratamiento control sin inóculo. Se tomaron muestras de 10 g de cada bloque por tratamiento a la cuarta semana de biotransformación para determinar las fracciones de fibra (celulosa, hemicelulosa, lignina), contenido de materia seca (MS) y proteína. El contenido de NDF (Fibra detergente neutro) y ADF (Fibra detergente ácido) se determinó utilizando el analizador de fibra ANKOM²⁰⁰⁰ (Ankom Technology, EUA) con la técnica propuesta por ^{Van Soest et al. (1991)}. Por medio de un análisis de varianza (ANOVA) se compararon los resultados de I_ae, contenido de MS, NDF, ADF, celulosa, hemicelulosa, lignina y proteína.

En paralelo se cuantificaron los títulos de las carbohidrasas CMCasas, Avicelasas, β-D-glicosidasas y xilanasas (^{Miller, 1959}), así como de lacasa (^{Abadulla et al., 2000}) presentes en los bloques al día 8 al 30.

En la Tabla 1 se muestran los resultado de la producción de celulasas, xilanasas, y lacasas de las cepas nativas y de la cepa de referencia Trametes versicolor en medio sólido. En la producción de celulasas, las tres cepas nativas mostraron diferencias significativas con respecto a la cepa de referencia. Pycnoporus sangui neus CS2 y T. maxima CU1 fueron las mejores productoras de celulasas, seguidas por T. hirsuta CS5. En la producción de xilanasas T. hirsuta CS5 fue la de mejor desempeño (p<0.05). Todas las cepas produjeron lacasa, sin embargo T. maxima CU1 fue la mejor productora, así como la de mayor potencial lignolítico.

Tabla 1 Índice de reacción (I_ae *) de celulasas, xilanasas y lacasas en placa. 

Los valores se analizaron con un ANOVA. *Indice de actividad enzimática (Iae)= diámetro de reacción (cm)/diámetro de crecimiento (cm). & Reacción revelada con solución de yodo al tercer día de crecimiento. ç Reacción evidenciada por la oxidación de siringaldazina en el medio, al tercer día.

La producción de enzimas modificadoras de lignina (EML) se detectó a partir de 3 días en T. maxima CU1 y a partir de los 5 días en los otros dos basidiomicetos nativos (Tabla 2).

Tabla 2 Producción de enzimas modificadores de lignina (EML) en placa. 

Índice de Decoloración (ID): La producción de EML se estimó por la decoloración del Poly R-478. Donde el mayor ID corresponde a la presencia de decoloración en un menor tiempo. El análisis de los datos se realizó con el modelo no paramétrico de Kruskal-Wallis. *Decoloración parcial.

En los bloques de sustrato biotransformados, las tres cepas produjeron CMCasas, avicelasas, β-D-glicosidasa, xilanasas y lacasas. Si bien, todas se detectan a partir del cuarto día, los títulos más altos en general se detectaron del día 8 al 15 de producción (datos no mostrados). Para las tres cepas de basidiomicetos los títulos más altos de actividad enzimática fueron de β-D-glicosidasas (Tabla 3). En tanto que la mejor cepa productora de xilansas fue T. hirsuta CS5 (113 U/l). T. maxima CU1 presentó los títulos más altos de lacasa (8 U/l) bajo estas condiciones de cultivo (Tabla 3).

Tabla 3 Lignocelulasas presentes en los bloques de pasto buffel (Cenchrus ciliaris) inoculado con basidiomicetos nativos. 

*La cuatificación de la lacasa se realizó por el método reportado por ^{Abadulla et al. (2000)}. Todas las mediciones se realizaron por triplicado (p<0.05) al día 15 de cultivo.

En la Tabla 4 se presentan los resultados de NDF, ADF, hemicelulosa, celulosa, lignina y proteína de los bloques de sustrato biotransformados. T. maxima CU1, P. sanguineus CS2 y T. hirsuta CS5 redujeron en 4.0, 6.5 y 6.2%, respecivamente, el contenido de NDF con respecto al control. Sin embargo, no hubo diferencia (p>0.05) en el contenido de ADF. T. maxima CU1, P. sanguineus CS2 y T. hirsuta CS5 redujeron 10.7, 17.0 y 14.2%, respectivamente (p<0.05), el contenido de hemicelulosa. P. sanguineus CS2 y T. hirsuta CS5 disminuyeron significativamente (p<0.05) el contenido de celulosa en un 21.6 y 19.8%, respectivamente en comparación al control. T. maxima CU1 fue asociado con una reducción numérica (p>0.05) del 14.2% en el contenido de lignina, con respecto al control. P. sanguineus CS2 y T. hirsuta CS5 incrementaron en 31% (p<0.05) el contenido proteico del control (Tabla 3).

Tabla 4 Contenido (%, base MS) de proteina y fracciones de fibra de pasto buffel (Cenchrus ciliaris) inoculado con diferentes cepas de hongos nativos. 

Tanto P. sanguineus CS2 y T. hirsuta CS5 produjeron mayores títulos de celulasas (principalmente avicelasas) (Tabla 3), explicando el menor contenido de celulosa y hemicelulosa (Tabla 4). Estos resultados concuerdan con ^{Dinis et al., (2009)}, quienes concluyeron que las xilanasas y feruloilesterasas de basidiomicetos, son enzimas clave en la degradación de la matriz lignina-hemicelulosa. En el trabajo realizado por ^{Shrivastava et al. (2011)}, también observaron una reducción del contenido de ADF, NDF, hemicelulosa, celulosa y lignina en paja de trigo fermentada con Pleurotus ostreatus y Trametes versicolor. Por otro lado, las cepas nativas incrementaron el contenido de proteína, sugiriendo un efecto positivo en la calidad nutricional.

A nivel mundial es reconocida la capacidad lignocelulolítica de los basidiomicetos de la pudrición blanca y su aprovechamiento en diversos procesos a nivel industrial (^{Elisashvili et al., 2011}). Sin embargo, en el sector pecuario son pocos los trabajos en los cuales aprovechen estos hongos, además de estar limitados a unos cuantos géneros (^{Ghorai et al., 2009}). Convencionalmente en el mejoramiento de la calidad nutricional de pastos y esquilmos para uso en la alimentación animal, requiere mayor degradación de lignina, hemicelulosa y celulosa que permita una mejor biodisponibilidad de nutrientes (^{Ribeiro et al., 2012}). Sin embargo, se ha reportado que dietas pobres en lignina y ricas en fibras solubles favorecen el establecimiento en el tracto gastrointestinal de floras nocivas, tales como Clostridum spp. y Escheri chia coli que incrementan la morbilidad y mortalidad en los animales.