Introducción

La producción de rumiantes en el trópico se basa en el pastoreo de gramíneas nativas o introducidas, estos pastos se caracterizan por aportar menos de 10% de proteína y más de 40% de fibra (^{Carmona, 2007}), presentan baja digestibilidad y tienen menos de seis por ciento de carbohidratos solubles (^{Gaviria et al., 2015}). Los pastos tropicales presentan buen rendimiento de biomasa (^{Rojas et al., 2017}) sin embargo, en el trópico la producción es afectada por la época de sequía y de lluvias. Durante la época lluviosa los pastos presentan mayor altura, aumenta la producción de biomasa por una mayor tasa de crecimiento (^{Muñoz et al., 2016}). La época de estiaje afecta la disponibilidad y la calidad nutritiva del forraje, por ello la producción es estacional (^{Jarillo et al., 2011}). Uno de los pastos más utilizados en el trópico es el Cynodon nlemfuensis, ^{Laredo (1985)} reportó que contiene menos de 11% de proteína cruda (PC), una DIVMS de 60%, un contenido de fibra insoluble en detergente neutro (FIDN) de 70%, f ibra insoluble en detergente acido (FIDA) de 40% y 2.3 Mcal kg^-1 de energía metabolizable (EM). Debido a la limitada calidad nutritiva de esta gramínea, es necesario buscar alternativas para mejorar la dieta de los rumiantes. Una alternativa, es la suplementación de los pastos con arbóreas forrajeras para incrementar el porcentaje de proteína a la dieta (Manotoa, 2016¹; ^{Cardona et al., 2016}). Las arbóreas tienen más de 20% de PC y sus niveles de fibra son menores a 40% (^{Carmona, 2007}; ^{Vélez et al., 2015}). Dentro de las arbóreas más estudiadas se encuentra la Moringa oleífera, Leucaena leucocephala y Guazuma ulmifolia. La Moringa oleífera contiene 16% de proteína, menos de 45% de FIDN y FIDA y una DIVMS superior a 60% (^{García et al., 2006}; ^{Cuartas et al., 2015}). La Leucaena leucocephala contiene 26% de proteína, menos de 46% de FIDN y FIDA, una DIVMS superior a 50% (^{Cordoví et al., 2013}; ^{Gutiérrez et al., 2018}). La Guazuma ulmifolia contiene 12% de proteína, 60% de FIDN y menos de 40% de FIDA, una DIVMS mayor a 45% (^{Mojica et al., 2017}; ^{Hernández-Morales et al., 2018}). Las arbóreas son una fuente de forraje y rebrotes continuos durante la época de sequía (^{Gutiérrez et al., 2018}). Las arbóreas presentan compuestos químicos que pueden limitar su valor nutricional. ^{Padma y Sumathi (1993)} reportan que una gran cantidad de leguminosas arbóreas y arbustivas del trópico contienen metabolitos secundarios como taninos, saponinas, alcaloides, terpenos, fitatos, hemoglutininas, aminoácidos tóxicos como canavanina y mimosina, glucósidos cianogénicos, cumarina y flavonol. El consumo en exceso de estos compuestos puede afectar la utilización de los nutrientes, la conversión alimenticia, la fermentación ruminal y la salud de los animales (^{Aregheore, 1999}; ^{Torres et al., 2008}). Los metabolitos secundarios además pueden afectar a los microorganismos ruminales y la fermentación (^{Carmona, 2007}; Escobar, 2009²). Los metabolitos secundarios también han tenido efecto contra larvas y garrapatas adultas (^{Rosado et al., 2010}). El follaje de las arbóreas puede tener un efecto nutracéutico en los animales (^{Hoste et al., 2015}). Los metabolitos presentes en Leucaena (^{Verdecia, et al., 2012}), M. oleífera (^{Velázquez et al., 2016}; ^{Cabrera et al., 2017}) y G. ulmifolia (^{Pinto et al., 2009}; ^{Luna y González, 2017}) también pueden ayudar a reducir las emisiones de metano. El uso de arbustivas y arbóreas en la alimentación de rumiantes es una buena alternativa para incrementar la digestibilidad, mejorar el balance de energía y proteína de la dieta, así como reducir las emisiones de CH₄ en rumen (Manotoa, 2016¹; ^{Cardona et al., 2016}). Los metabolitos con propiedades antimetanogénicas son saponinas, taninos, aceites esenciales, compuestos órganosulfurados y flavonoides (^{Patra y Saxena, 2010}). La reducción de la metanogénesis también puede ocurrir mediante efecto indirecto al reducir la población de protozoarios e inhibir la actividad de las arqueas metanogénicas (^{Bodas et al., 2012}; ^{Vélez et al., 2014}). ^{Ribeiro et al. (2015)} reportan que la actividad ganadera en los últimos años ha sido cuestionada por generar altos niveles de metano por el consumo de pastos de baja calidad nutricional (^{Ribeiro et al., 2015}). Durante la fermentación de los pastos por los microorganismos ruminales, se generan una mayor concentración de acetato que libera H₂ y CO₂ que son los sustratos para formar CH₄ por las arqueas metanogénicas. Este gas representa una pérdida del 7 al 12% de la energía bruta consumida por el animal (^{Vélez et al., 2015}). La producción de CH₄ depende de la composición de la dieta, la digestibilidad, procesamiento del alimento y frecuencia de alimentación (Manotoa, 2016¹). El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la incorporación de 15, 30 y 45% de Moringa oleífera, Leucaena leucocephala y Guazuma ulmifolia en una dieta a base de pasto Cynodon nlemfuensis durante la fermentación ruminal in vitro.

Materiales y Métodos

El experimento se realizó en el Laboratorio de Bioquímica y Nutrición de la Universidad del Mar Campus Puerto Escondido, ubicado en el Campo Experimental de Bajos de Chila, localizado en el kilómetro 128.1 de la carretera Federal Pinotepa Nacional-Puerto Escondido, cuyas coordenadas son 15º 55’ 33.4” N y 97º 09’ 01.9” O y una altitud de 12 m. El pasto Cynodon nlemfuensis se cosechó a los 27 días de rebrote, en una parcela experimental establecida en San José Manialtepec, Tututepec, Juquila, Oaxaca con coordenadas 15° 56’ 59.1” N y 97° 14’ 18.3” O y una altitud de 17 m. En los meses de junio y julio del año 2018. El follaje de las arbóreas M. oleifera, L. leucocephala y G. ulmifolia se recolectó en los meses de junio y julio del año 2018, en Rio Grande, Tututepec, Juquila, Oaxaca con coordenadas 16° 00’ 31.3” N y 97° 27’ 06.8” O y a una altitud de 24 m. El material vegetal recolectado fue secado a 65 °C en una estufa (FELISA. México) por 72 h, y molido con malla de 1 mm en un molino Wylley (Arthur H. Tomas, Philadelphia, PA, U.S.A.). Se elaboraron 10 dietas compuestas de la siguiente manera: Cn-100: 100% Cynodon nlemfuensis, Mo-15: 85% Cynodon nlemfuensis + 15% Moringa oleífera, Mo-30: 70% Cynodon. nlemfuensis + 30% Moringa oleífera, Mo-45: 55% Cynodon nlemfuensis + 45% Moringa oleífera, Ll-15: 85% Cynodon nlemfuensis + 15% Leucaena leucocephala, Ll-30: 70% Cynodon nlemfuensis + 30% Leucaena leucocephala, Ll-45: 55% Cynodon nlemfuensis + 45% Leucaena leucocephala, Gu-15: 85% Cynodon nlemfuensis + 15% Guazuma ulmifolia, Gu-30: 70% Cynodon nlemfuensis + 30% Guazuma ulmifolia y Gu-45: 55% Cynodon nlemfuensis + 45% Guazuma ulmifolia. La composición química de las dietas fue determinada por los métodos de la AOAC (2005): cenizas (método 942.05) y proteína cruda (PC) (método 984.13). El contenido de fibra insoluble en detergente neutro (FIDN), fibra insoluble en detergente acida (FIDA) y hemicelulosa se determinaron por el método propuesto por ^{Van-Soest et al. (1991)}. La fuente de inoculo se obtuvo de una vaca Cebú × Pardo suizo, canulada en el rumen, estabulada, alimentada con 70% forraje, 30% de concentrado y agua a libre acceso. El líquido ruminal fue extraído por la mañana, filtrado en gasas a cuatro capas y transportado en un termo cerrado herméticamente al laboratorio hasta su posterior uso. Para determinar la degradación in vitro de la materia seca (DIVMS), la concentración de AGV y pH se utilizaron viales serológicos de vidrio con capacidad de 100 mL como biofermentadores. Fueron agregadas muestras de 0.5 g de MS de cada dieta con 45 mL de medio de cultivo para bacterias totales a base de glucosa, celobiosa, almidón y fluido ruminal clarificado (GCA-FR) preparado de acuerdo a ^{Cobos y Yokoyama (1995)}. Los viales se mantuvieron en condiciones de anaerobiosis con CO₂, y se sellaron herméticamente con tapones de goma y arillos de aluminio, cada biofermentador se consideró una unidad experimental. El biogás se capturó en trampas de solución salina saturada, preparada de acuerdo a Cobos et al. (2018). Los biofermentadores se incubaron en baño María a 39 °C, se inocularon con 5 mL de líquido ruminal fresco centrifugado a 10000 rpm durante 15 minutos. Las trampas de biogás fueron conectadas con el biofermentador por medio de una manguera de Tygon^® con un diámetro interior de 3/32”. La manguera fue adaptada con dos agujas de jeringa calibre 20Gx1” en cada extremo, a las trampas se les colocó una aguja como válvula de alivio. Las trampas se colocaron en forma invertida en una probeta de plástico. La producción de biogás se cuantificó midiendo el desplazamiento del líquido de las trampas en la probeta. Para medir la cantidad de CH₄ y CO₂ se tomó una muestra de 50 µL de las trampas (^{Cobos et al., 2018}).

Resultados y Discusión

Los resultados del examen químico de las dietas se muestran en el Cuadro 1. Los valores de proteína cruda mostraron diferencias (P < 0.05) entre las dietas evaluadas. Las dietas que contenían 30 y 45% de L. leucocephala y 45% de G. ulmifolia tuvieron el mayor contenido de proteína con relación a la dieta con 100% de C. nlemfuensis.

La fracción de FIDA presentó diferencias (P < 0.05) entre las dietas evaluadas; la dieta con 45% de M. oleífera tuvo menor porcentaje de FIDA, comparado con la dieta con 100% de pasto C. nlemfuensis. Los porcentajes de FIDN mostraron diferencias (P < 0.05) entre las distintas dietas, la dieta de 100% de pasto C. nlemfuensis tuvo el mayor contenido de FIDN. El porcentaje de hemicelulosa también mostró diferencias (P < 0.05) entre las dietas evaluadas; la dieta con 100% de pasto C. nlemfuensis presentó el mayor contenido. Los valores de cenizas no presentaron diferencias (P > 0.05) entre las dietas.

Los resultados de proteína, FIDN, hemicelulosa y cenizas de la dieta con 100% de pasto C. nlemfuensis fueron superiores a los encontrados por ^{Ley-de Coss et al. (2018)} para el mismo pasto cosechado a los 75 días. En contraste, fueron inferiores en proteína y cenizas a lo reportado por ^{Villalobos y Arce (2014)}; pero similares a lo reportado por ^{Maya et al. (2005)} a los 28 días de corte. ^{Rodríguez et al. (1998)} indican que, al aumentar la inclusión de arbóreas en la dieta, aumenta el contenido de proteína y disminuye el porcentaje de FIDA y FIDN; debido a que las arbóreas tropicales tienen mayor contenido de proteína y menor proporción de pared celular que las gramíneas (^{Carmona, 2007}). En estudios in vivo se han alimentado ovinos con una dieta a base de pasto clon Cuba CT-115 (P. purpureum) con la inclusión de L. leucocephala y se han obtenido mayores ganancias diarias de peso (^{Madera et al., 2013}). Se ha determinado que la suplementación con L. leucocephala durante la lactancia incrementa el peso de las crías al destete e incrementa la producción de leche en las hembras (Pérez et al., 2017; ^{López et al., 2011}). ^{Mayren et al. (2018)} y ^{Gutiérrez et al. (2018)}, enfatizan que la calidad nutricional de las especies arbóreas como M. oleífera, L. leucocephala y G. ulmifolia mejoran la producción de los rumiantes al suplementar las dietas de pastos tropicales, porque mejora el consumo voluntario, la utilización del nitrógeno, incrementa la digestibilidad y disminuye las excreciones de nitrógeno. En el presente estudio la incorporación de 15, 30 y 45% de L. leucocephala en la dieta del pasto C. nlemfuensis aumentó el contenido de proteína de las dietas. ^{Petit et al. (2011)} reportan que L. leucocephala es la especie que tiene alto contenido de proteína y menor proporción de paredes celulares que las gramíneas, por lo que es una buena opción como forraje para el ganado en el trópico. La DIVMS presentó diferencias (P < 0.05) entre las dietas (Cuadro 2).

La dieta con 30% de M. oleífera mostró la mayor (P < 0.05) DIVMS, mientras que las dietas con 45% de M. oleífera, 30% de L. leucocephala y 30% de G. ulmifolia presentaron los más bajos porcentajes (P < 0.05). Los resultados de este estudio para la dieta a base de 100% de pasto C. nlemfuensis fueron menores a los reportados por ^{Villalobos y Arce (2014)}, pero fueron mayores a los reportados por ^{Sandoval et al. (2016)} a los 35 días de rebrote. En general, los porcentajes de DIVMS de las dietas fueron superiores al 50%. Los datos obtenidos fueron similares a los resultados reportados por ^{Rodríguez et al. (1998)}, quienes adicionaron 5, 10, 20 y 40% de arbóreas a dietas a base de pastos. Por otra parte, se ha determinado que la adición de arbóreas a las dietas no asegura un incremento en la DIVMS; debido a que hay un desbalance entre el aporte de proteína y energía, debido a que las arbóreas tienen bajo contenido de carbohidratos de fácil fermentación. Estos desbalances de proteína y energía en el rumen no permiten la utilización total del amoniaco producido por la degradación de las proteínas, limitando el crecimiento microbiano y reduciendo la degradabilidad de la materia seca (^{Van-Soest, 1982}).

Las dietas evaluadas no presentaron diferencias (P > 0.05) en pH a las 72 h de incubación (Cuadro 2), estos valores fueron superiores a 6.2, siendo adecuados para la proliferación de la población de bacterias, sobre todo de las bacterias celulolíticas que degradan las paredes celulares (^{Cobos et al., 2018}).

La fermentación ruminal de las dietas con alto contenido de paredes celulares no causa disminución de pH menor a 6.2 debido a que la mayor parte de la glucosa liberada se fermenta hasta acetato (^{Ley-de Coss et al., 2018}). En el Cuadro 2 se muestra la concentración de AGVs y la relación acetato: propionato determinada en las dietas a las 72 h de incubación. Se encontraron diferencias (P < 0.05) en las concentraciones de acetato y propionato, la dieta con 45% de M. oleífera presentó la mayor (P < 0.05) concentración de ambos AGVs; mientras que la dieta con 30% de L. leucocephala tuvo la menor (P < 0.05) concentración. Para butirato, la mayor (P < 0.05) concentración la tuvo la dieta con 45% de M. oleífera; la dieta con 45% de M. oleífera tuvo la mayor (P < 0.05) concentración de AGVs totales, mientras que las dietas con 30% de L. leucocephala y 30% de G. ulmifolia tuvieron la menor concentración (P < 0.05). La relación acetato: propionato fue mayor (P < 0.05) para las dietas con 30% de L. leucocephala y 30% de G. ulmifolia, comparado con la dieta con 45% de M. oleífera que presentó una relación acetato: propionato menor (P < 0.05). ^{Ley-de Coss et al. (2018)} reportaron para el pasto C. nlemfuensis valores de acetato, propionato, butirato, AGVs totales y una relación acetato: propionato muy superior a lo encontrado en el presente estudio. El acetato origina la producción de CH₄, por la mayor disponibilidad de CO₂ y H₂ para las arqueas metanogénicas; mientras que la formación de propionato se considera una forma de competencia por la captación de H₂ que causa una menor síntesis de CH₄ (^{Gidlund et al., 2015}). Lo anterior explica lo encontrado en este estudio en la dieta con 45% de M. oleífera que presento la mayor concentración de acetato y butirato, comparado con la dieta con 30% de L. leucocephala que tuvo la menor concentración, y fue una de las dietas con la menor producción de CH₄.

La producción acumulada de biogás durante la fermentación ruminal in vitro presentó diferencias (P < 0.05) entre las dietas (Cuadro 3). A las 72 h la dieta con 45% de L. leucocephala la única que mostró la menor producción de biogás (P < 0.05), comparada con la dieta con 100% de pasto C. nlemfuensis que presentó la mayor producción (P < 0.05). La producción de biogás in vitro está relacionada con la fermentación del alimento por los microorganismos ruminales, también la composición química de la dieta influye sobre el volumen producido de biogás (^{Gaviria et al., 2015}). ^{Cuartas et al. (2015)} mencionan que la producción de biogás está relacionada con la degradación de la FIDN y esta relación suele ser lineal, debido a que producen más biogás aquellos forrajes con mayor contenido de FIDN (^{Krizsan et al., 2013}).

Lo anterior coincide con los resultados del presente experimento, donde la dieta con 100% de pasto C. nlemfuensis presentó el mayor porcentaje de FIDN y mostró la mayor producción de biogás a las 72 h de incubación, además la dieta con 45% de L. leucocephala tuvo la menor producción acumulada de biogás a las 72 h, y fue una de las dietas con menor porcentaje de FIDN. Estos datos coinciden con lo encontrado por ^{Rodríguez et al. (2014)} quienes al fermentar in vitro L. leucocephala y M. oleífera durante 72 h, determinaron mayor producción de biogás en M. oleífera con respecto a L. leucocephala. En contraste, ^{Ramírez et al. (2012)} reportan menor producción de biogás para G. ulmifolia. Por otra parte, ^{Gaviria et al. (2015)} también reportó menor producción de biogás al incluir 23% de L. leucocephala en una dieta de pasto Panicum máximum.

^{Ley-de Coss et al. (2018)} reportaron para C. nlemfuensis una producción de biogás superior en más del 100% a los resultados encontrados en el presente experimento a las 72 horas. Las emisiones de CH₄ y CO₂ en las dietas mostraron diferencias (P < 0.05). La menor emisión de CH₄ se determinó en la dieta con 45% de L. leucocephala, en contraste las dietas con 100% de pasto C. nlemfuensis y con 45% de M. oleífera presentaron las mayores emisiones. La mayor emisión de CO₂ la tuvo la dieta con 100% de pasto C. nlemfuensis, comparado con la dieta con 45% de L. leucocephala que presentó las menores emisiones (Cuadro 3). En general la dieta con 45% de L. leucocephala produjo 18% menor emisión de CH₄, en comparación con la dieta con 45% de M. oleífera que tuvo la mayor emisión de CH₄; además tuvo 24% menor producción de CO₂ comparado con la dieta de 100% de pasto C. nlemfuensis que presento la mayor producción de CO₂. En contraste, otras investigaciones en condiciones similares han reportado emisiones de CH₄ superiores a las obtenidas en el presente estudio en pasto Pennisetum clandestinum y pasto Cynodon nlemfuensis a las 72 h de incubación (^{Posada et al., 2014}). También, ^{Ley-de Coss et al. (2018)} reportan emisiones de CH₄ superiores, además indican que este gas se encuentra en mayor proporción (73.9%) de los gases emitidos durante la fermentación a 72 horas. ^{Galindo et al. (2014)}, reportan emisiones de CH₄ superiores para C. nlemfuensis y G. ulmifolia, y menores emisiones para M. oleífera y L. leucocephala. En el presente estudio se destaca que la inclusión de Leucaena leucocephala a las dietas a base de pasto C. nlemfuensis presentó mayor capacidad para reducir las emisiones de CH₄ en comparación con Moringa oleífera y Guazuma ulmifolia. Probablemente la reducción en las emisiones de CH₄ y CO₂ se puede explicar por la presencia de metabolitos secundarios como los taninos y las saponinas en el follaje de L. leucocephala (^{Verdecia et al., 2012}), que pueden afectar el desarrollo de las poblaciones microbianas del rumen, en especial de las arqueas metanogénicas, además el mayor aporte de proteínas pueden cambiar los patrones de fermentación hacia una mayor formación de propionato para reducir la producción de CH₄ (^{Bodas et al., 2012}). ^{Vélez et al. (2014)} reportan que las saponinas disminuyen la metanogénesis de modo indirecto al reducir la disponibilidad de H₂ al reducir la población de protozoarios, los cuales se encuentran en endosimbiosis con las arqueas metanogénicas cuya relación puede generar de 9 a 37% de las emisiones totales de CH₄. Además, las saponinas pueden favorecer un aumento de la concentración de propionato y reducir la producción de acetato y butirato, lo que resulta en una menor producción de hidrógenos necesarios para la producción de metano (^{Patra y Saxena, 2009}, ²⁰¹⁰). Por otra parte, la inhibición de la metanogénesis ruminal por los taninos ha sido atribuido a un efecto directo sobre las arqueas metanogénicas y los protozoarios (^{Patra y Saxena, 2011}). Se ha determinado que los taninos pueden inhibir el crecimiento de las bacterias, arqueas metanogénicas y protozoarios ruminales (^{McSweeney et al., 2001}), también reducen la producción de acetato, lo que disminuye la formación de CO₂ e H₂ para la producción de metano (^{Bodas et al., 2012}). Los taninos condensados (^{Ku et al., 2014}), causan una reducción de la degradación ruminal de la fibra, lo que produce una disminución de la liberación de hidrógeno (^{Bonilla y Lemus, 2012}). ^{Hernández-Escobar et al. (2017)}, indican que al adicionar 15% de arbóreas a dietas de pastos no presentaron diferencias (P > 0.05) en las emisiones de CH₄ y CO₂ durante fermentación ruminal in vitro. De manera similar en la presente investigación la inclusión de 15% de L. leucocephala, M. oleífera y G. ulmifolia a una dieta de pasto C. nlemfuensis no presentó diferencias significativas en las emisiones de CH₄ y CO₂ comparado con la dieta con 100% del pasto.

Conclusión

La leguminosa Leucaena leucocephala es una excelente alternativa como aporte de nutrientes para mejorar la dieta de los rumiantes, así como, un recurso valioso para disminuir las emisiones de CH₄ y CO₂ al medio ambiente. La inclusión de 45% de L. leucocephala en una dieta a base de pasto C. nlemfuensis redujo 18% las emisiones de CH₄ y 24% las de CO₂ durante la fermentación ruminal estimada in vitro. Se sugiere realizar más investigaciones con el follaje de estas arbóreas tanto in vitro como in vivo a diferentes edades de la planta, en diferente época del año y medir la presencia y concentración de metabolitos secundarios, antes y después de la fermentación para determinar su degradabilidad en el rumen.