Descripción del sitio de estudio

Las parcelas y los laboratorios donde se realizó el estudio se encuentran ubicados en el Campo Experimental, los Laboratorios de Nutrición y Microbiología son parte de la Licenciatura en Zootecnia de la Universidad del Mar, Campus Puerto Escondido. Se localiza en la comunidad de Bajos de Chila del municipio de San Pedro Mixtepec, Juquila, Oaxaca, en el kilómetro 128.1 de la carretera Federal Pinotepa Nacional-Puerto Escondido, ubicado entre las coordenadas 15º 55’ 27.54” N y 97° 09’ 04.09” O y altitud de 12 m. El clima predominante es cálido subhúmedo, clasificado como A(c) w2 y Aw0 (^{García, 2004}), con dos estaciones marcadas, lluviosa y de secas, con intervalos de temperatura media anual entre 22 a 26 °C y una precipitación pluvial de 930.8 a 1668.0 mm por año. El tipo de suelo predominante corresponde al tipo regosol éutrico con una fertilidad moderada, su textura varía desde arena hasta migajón arcillo-arenoso. La actividad predominante corresponde a la agricultura y la ganadería debido a la abundancia de gramíneas presentes en este tipo de suelo (^{CRENCO, 2007}).

Obtención de las muestras y tratamientos

Se seleccionaron cinco parcelas, una para cada tipo de pasto en estudio, con superficie de 20 m² para cada pasto. Inicialmente los pastos de cada parcela fueron cortados a 15 cm de altura, se dejaron crecer y posteriormente fueron cosechados para su análisis. Los tratamientos evaluados fueron los siguientes: Cn26 = Cynodon nlemfuensis, cosechado a 26 días de rebrote. Ag35 = Andropogon gayanus, cosechado a los 35 días de rebrote, Pptm45 = Pennisetum purpureum cv. Taiwan Morado, cosechado a los 45 días de rebrote, Ppm40 = Pennisetum purpureum cv. Maralfalfa, cortado a los 40 días de rebrote y Pm35 = Panicum maximum, cosechado a los 35 días de rebrote.

Análisis químico de los pastos

A las muestras de los pastos se les determinó humedad en un horno de secado (Felisa⁽, México) a 65 (C durante 48 h (^{Herrera, 2014}). Las muestras secas fueron molidas en un molino industrial (Ika^® Werke MF 10, U.S.A.) equipado con malla de 1 mm (^{Williams, 2000}). A las dietas por quintuplicado se les determinó el porcentaje de proteína cruda (PC) por el método de Kjeldahl (^{AOAC, 1990}); fibra detergente neutro (FDN) y fibra detergente ácido (FDA) de acuerdo a la metodología descrita por ^{Van Soest et al. (1994)}. Los análisis fueron realizados en el Laboratorio de Nutrición Animal del Colegio de Postgraduados, Montecillo, Texcoco, México.

Fermentación ruminal in vitro

Preparación de los medios de cultivo. Para cuantificar las poblaciones de microorganismos ruminales, AGV, degradabilidad in vitro de la materia seca (DIVMS) y generación de biogás (CH₄ y CO₂), se utilizó el medio de cultivo para bacterias totales que contenía glucosa, celobiosa, almidón y fluido ruminal fresco (GCA-FR), el cual se elaboró según los métodos de ^{Cobos y Yokoyama (1995)}, fue preparado en condiciones de esterilidad y bajo flujo de CO₂. La fuente de inóculo utilizado fue fluido ruminal fresco extraído 2 h después de ser alimentado, de un bovino adulto cruza de Cebú × Pardo Suizo, de 500 kg con cánula ruminal, el cual fue alimentado con 90% de Panicum máximum y 10% de alimento concentrado cuyo contenido fue de 2.6 Mcal de EM y 14% de proteína cruda.

Microorganismos ruminales. La población de bacterias ruminales se determinó por conteo directo mediante una muestra obtenida directamente de los biofermentadores a las 6, 12, 24, 48 y 72 h de incubación en una cámara Petroff Houser⁽ (U.A.S.) en un microscopio óptico Motic⁽ (México), a 1000 magnificaciones. El procedimiento se realizó de acuerdo a lo reportado por ^{Cobos et al. (2011)}. La población de bacterias celulolíticas se cuantificó a 72 h de incubación mediante la técnica del número más probable (NMP) descrita por ^{Harrigan y McCance (1979)}. Se inoculó líquido proveniente de los biofermentadores en tubos de ensayo de 13 × 100 mm que contenían medio de cultivo líquido para bacterias celulolíticas preparado de acuerdo a las técnicas de ^{Hungate (1969)} y ^{Cobos et al. (2011)}. El desarrollo microbiano se confirmó por la degradación del papel Whatman 541 durante 10 d a 39.0 °C. La población de protozoarios fue calculada a 6, 12, 24, 48 y 72 h por método directo (^{Cobos et al., 2011}) mediante una cámara Neubauer-improved (Marienfeld, U.S.A.) en un microscopio óptico (Motic⁽, México), a 400 magnificaciones. El pH se midió directamente del fluido de los biodigestores obtenido a 72 h de fermentación con potenciómetro portátil (Orion⁽, U.S.A.).

Ácidos Grasos Volátiles (AGV). Las muestras de los biodigestores fueron obtenidas a 72 h y depositadas en viales Eppendorf ⁽ (U.S.A.) de 2 mL, con ácido meta-fosfórico (Merck⁽, U.S.A.) al 25% con una proporción 4:1, y se congelaron a -4 °C. Posteriormente se midió la concentración molar de los AGV de acuerdo a las técnicas reportadas por ^{Erwin et al. (1961)}. Utilizando un cromatógrafo de gases (Perkin Elmer⁽, U.S.A.) con un detector de ionización con flama. Las condiciones de trabajo fueron: temperatura de horno 130 °C, y del inyector y la columna capilar (15 × 0.32 m) 250 °C. Los tiempos de retención fueron 1.26 min para acetato, 1.6 min propionato y 2.09 min butirato. Los análisis fueron realizados en los Laboratorios de Microbiología Ruminal y Genética Microbiana del Colegio de Postgraduados, México.

Determinacion de pH. A 72 h de incubación se determinó el pH del fluido de los biofermentadores con un potenciómetro portátil (Orion⁽, U.S.A.), calibrado a pH cuatro y siete.

Degradabilidad in vitro de la materia seca y producción de biogás (CH ₄ y CO ₂ )

Degradación in vitro de la materia seca (DIVMS). Para determinar la degradabilidad in vitro de la materia seca (DIVMS) el contenido del biofermentador se filtró a 72 h de incubación en papel Whatman⁽ 541 para recuperar la materia seca no degradada y por diferencia de peso se calculó la digestibilidad de acuerdo a las técnicas reportadas por ^{Mellenberger et al. (1970)}.

Determinación de las emisiones de biogás (CH₄ y CO₂). Se pesaron 0.5 g de MS de cada tratamiento y fueron agregadas por quintuplicado en viales serológicos de 120 mL. A cada vial se le agregó 45 mL de medio de cultivo estéril para bacterias totales (^{Cobos y Yokoyama, 1995}). Los viales fueron inoculados en condiciones anaerobias con CO₂, a cada vial se le agregó 5 mL de fluido ruminal fresco. Cada vial se consideró un biofermentador y una unidad experimental. La producción de biogás se cuantificó mediante la técnica descrita por ^{Krabill et al. (1969)}, cuya modificación fue reportada por ^{Cobos et al. (2018)}. Los biofermentadores se colocaron en un baño María 39 °C, se conectaron con las trampas de captura de biogás por medio de una manguera Tygon⁽ con un diámetro interior de 3/32”. La manguera fue adaptada con dos agujas marca Terumo⁽ de calibre 20 GX1” en cada extremo. Una aguja del extremo de la manguera se colocó en el biofermentador y la otra a la trampa de captura de biogás, la que contenía una aguja como válvula de liberación. La trampa se colocó en forma invertida en una probeta de plástico. Se cuantificó el volumen de biogás a 6, 12, 24, 48 y 72 h de incubación. Para medir las proporciones de CH₄ y CO₂ se tomó una muestra de 500 µL del biogás atrapado en las trampas, el cual se inyectó en un cromatógrafo de gases (Perkin Elmer⁽, U.S.A.) provisto con un indicador de conductividad térmica y una columna empacada Poropack. Las condiciones de detección fueron las siguientes: temperaturas de horno 80 °C, columna empacada 170 °C y detector de conductividad térmica 130 °C; los tiempos de retención fueron 0.71 min y 1.005 min para CH₄ y CO₂, respectivamente. El gas trasportador fue helio con una circulación de 23 mL m^-1. Los análisis fueron realizados en el Laboratorio de Microbiología Ruminal y Genética Microbiana del Colegio de Postgraduados, México.

Análisis estadístico

Se utilizó un diseño completamente aleatorio utilizando cinco tratamientos y cinco repeticiones en cada uno de ellos. Las variables evaluadas se examinaron mediante el análisis de varianza con el procedimiento PROC GLM del paquete estadístico SAS (^{SAS, 2003}) y para la comparación de medias se usó la prueba de Tukey, (^{Steel y Torrie, 1988}) α = 0.05. Para las variables de población de bacterias totales, bacterias celulolíticas y protozoarios, se realizó una transformación logarítmica para normalizar los datos.

Composición química de los pastos

En el Cuadro 1 se muestran los resultados de la composición química de los pastos evaluados. Los pastos con los mayores (P < 0.05) contenidos de materia seca (MS) fueron el Andropogon gayanus, Cynodon nlemfuensis y Panicum maximum, cuyos valores oscilaron entre 17 y 20%. Se observa que el contenido de MS de Pennisetum purpureum cv. Taiwán morado fue menor a 10% y Pennisetum purpureum cv. Maralfalfa fue menor a 12%. ^{Van Soest (1994)} indica que la diferencia de MS en los pastos se debe a la edad fisiológica al momento del corte, un mayor contenido de MS a una edad fenológica temprana indica mayor contenido de materia orgánica, lo que implica mayor contenido de nutrientes. Los pastos del presente estudio fueron cortados a la edad de rebrote recomendada por ^{Villalobos y Arce (2013)} e ^{Hinojosa et al. (2014)}. El Cuadro 1 también muestra los resultados de proteína cruda (PC) de los pastos, el contenido de PC fue menor (P < 0.05) a seis por ciento en Pennisetum purpureum cv. Taiwán morado y Pennisetum purpureum cv. Maralfalfa, mientras que en Panicum maximum fue de 13% y en Cynodon nlemfuensis fue mayor a nueve por ciento (P < 0.05). En general, las gramíneas tienen un bajo porcentaje de proteína cruda, menor contenido de nitrógeno que limita el desarrollo de los microorganismos del rumen (^{Dijkstra et al., 2005}). ^{Ley de Coss et al. (2018)} reportan valores de 9.56% para Cynodon nlemfuensis cosechado a 75 d de edad que son similares a los resultados del presente estudio. El porcentaje de F ibra Detergente Neutro (FDN) presentó diferencias (P < 0.05) entre los pastos. El valor más bajo de FDN lo tuvieron Pennisetum purpureum cv. Taiwán Morado, Pennisetum purpureum cv. Maralfalfa y Cynodon nlemfuensis que fluctuó de 66.87 a 73.97%, mientras que Panicum maximum tuvo el contenido más alto de FDN (86.31%). ^{Juárez et al. (2009)} y ^{Ley de Coss et al. (2018)} han determinado en Panicum máximum un contenido de 67.24% y 72.70 de FDN respectivamente, que son valores menores a los obtenidos en el presente experimento. En general, la fibra detergente ácido (FDA) presentó la misma tendencia que la FDN como se observa en el Cuadro 1. ^{Villalobos y Arce (2013)} enfatizan que cuando el contenido de FDN y FDA es mayor en los pastos disminuye la digestibilidad de la MS, lo que reduce el aporte de nutrientes.

Evaluación de la fermentación ruminal in vitro (microorganismos, AGV y pH)

Microorganismos ruminales. La población de bacterias ruminales totales y protozoarios no mostraron diferencias (P > 0.05), como se observa en el Cuadro 2. La población de bacterias fue de 10⁹ células por mL del medio, de acuerdo con ^{Yokoyama y Johnson (1988)} las bacterias están en el rango adecuado de la población de bacterias ruminales.

La población de protozoarios en el rumen puede fluctuar de 10 × 10⁴ a 20 × 10⁵ células por mililitro de fluido ruminal (^{Yokoyama y Jonhson, 1988}), lo que corresponde con los valores obtenidos en este estudio. La mayor concentración de bacterias celulolíticas la tuvieron Pennisetum purpureum cv. Taiwán Morado y Pennisetum purpureum cv. Maralfalfa, mientras que Cynodon nlemfuensis, Andropogon gayanus y Panicum maximum mostraron una menor (P < 0.05) población de bacterias celulíticas. Una menor población de bacterias celulolíticas se ha relacionado con una reducción de la degradabilidad de la materia seca en rumen (^{Yogianto et al., 2014}), debido a que las bacterias celulolíticas degradan polisacáridos estructurales de la pared celular, para lo cual requieren pH cercano al neutro para su adecuado metabolismo (^{Barboza et al., 2009}). Además, en un pH inferior a 6.0 se inhibe el crecimiento de las bacterias celulolíticas (^{Chen et al., 2011}).

Producción de ácidos grasos volátiles (AGV). La concentración de acetato fue mayor (P < 0.05) en el pasto Pennisetum purpureum cv. Maralfalfa, mientras que la menor concentración (P < 0.05) de acetato y propionato la tuvo Cynodon nlemfuensis; Panicum máximum tuvo mayor producción (P < 0.05) de acetato y propionato. La concentración de butirato fue mayor (P < 0.05) en Panicum maximum, la menor producción (P < 0.05) la presentó Pennisetum purpureum cv. Taiwán Morado. Las bacterias celulolíticas que degradan en el rumen los carbohidratos estructurales de la pared celular de los pastos tropicales dan como productos finales acetato y CO₂ (^{Cai et al., 2010}). La mayor producción de acetato y butirato por la fermentación de los pastos en el rumen originan una mayor disponibilidad de CO₂ y H₂ que son sustratos para la síntesis de CH₄ (^{Ley de Coss et al., 2018}); mientras que la formación de propionato se considera una forma competitiva para captar H₂ que resulta en una menor síntesis de CH₄ (^{Gidlund et al., 2015}), se produce mayor concentración de propionato cuando los rumiantes consumen pastos con alto contenido de azúcares solubles o debido a un aporte de almidones en la dieta (^{Cobos et al., 2018}).

Valores de pH de los de cultivos. El pH de los cultivos no presentó diferencias (P > 0.05) a 72 h de incubación, como se aprecia en el Cuadro 2. En general, los valores de pH variaron de 6.42 a 6.57. Se considera que un pH menor a 6.5 puede disminuir la población de bacterias celulolíticas y la producción de CH₄, lo cual se debe a una reducción de la actividad de las bacterias que degradan paredes celulares (Russell et al., 2009). Otra de las causas por las que puede disminuir el pH ruminal es por el aumento en la concentración de los AGV (^{Sánchez y Cobos, 2016}). La fermentación ruminal de los pastos con alto contenido de paredes celulares, como los evaluados en este estudio, no causan disminuciones de pH menores a 6.3 debido a que una gran proporción de la glucosa liberada se fermenta hasta acetato (^{Ley de Coss et al., 2018}).

Producción de biogás. La generación de biogás en los distintos pastos no presentó diferencias (P > 0.05) entre las 6 y las 48 h como se muestra en el Cuadro 3. En general, la mayor producción de biogás se presentó entre las 6 y 24 h, lo que indica que en este periodo hubo gran actividad de las bacterias para degradar los sustratos (^{Ley de Coss et al., 2018}).

A 72 h los pastos Cynodon nlemfuensis y Andropogon gayanus produjeron la menor producción de biogás (P < 0.05), mientras que Panicum maximum produjo la mayor producción (P < 0.05). El volumen de biogás producido durante la fermentación es un buen indicador para predecir la degradabilidad y la síntesis de proteína microbiana por los microorganismos ruminales, también se ha demostrado que la DIVMS tienen una estrecha relación con el volumen de biogás emitido (^{Mould et al., 2005}; ^{Rivera et al., 2015}). Los pastos evaluados del presente experimento produjeron en promedio 170.67 mL g^-1 MS, lo cual coinciden con lo reportado por ^{Rivera et al. (2015)} y contrastan con ^{Ley de Coss et al. (2018)}, quienes reportaron mayor producción de biogás a las 72 h de incubación en pastos tropicales.

Degradabilidad in vitro de la materia seca (DIVMS) y emisiones de biogás, CH ₄ y CO ₂

Degradación in vitro de la materia seca. La DIVMS de los pastos presentó diferencias (P < 0.05) como se muestra en el Cuadro 3. El pasto Pennisetum purpureum cv. Maralfalfa presentó la mayor (P < 0.05) degradabilidad de la MS. El promedio de la degradabilidad de los pastos evaluados en el presente experimento es de 65.81%. La degradabilidad in vitro de los pastos tropicales es un indicador del potencial como aporte de nutrientes para el rumiante (^{Ruiz, 2011}). La degradabilidad de los pastos es afectada por su contenido de FDN, la edad de cosecha o pastoreo, la madurez, y la época del año (^{Barahona y Sánchez, 2005}). En el presente estudio la menor DIVMS de Cynodon nlemfuensis parece estar relacionada con la reducción de la población de las bacterias celulolíticas, por lo cual produjo menor concentración de acetato, debido a que estas bacterias degradan polisacáridos estructurales de la pared celular hasta acetato y CO₂ (^{Miron et al., 2001}).

Producción de CH₄ y CO₂. La producción de CH₄ y CO₂ (Cuadro 4) presentaron diferencias (P < 0.05). La producción de ambos gases fue menor entre las 24 h y las 72 h. El pasto Pennisetum purpureum cv. Maralfalfa produjo menor volumen (P < 0.05) de CH₄, comparado con Andropogon gayanus que produjo más gas (P < 0.05). La producción de CH₄ es un indicador de la actividad fermentativa de las bacterias durante la fermentación anaerobia, en este proceso intervienen distintos grupos de bacterias, como las fibroliticas que fraccionan los polisacáridos estructurales hasta azucares, las formadoras de AGV y las arqueas metanogenicas que sinterizan CH₄ a partir de H₂ y CO₂ (^{McAllister y Newbold, 2008}; ^{Morgavi et al., 2010}). El acetato y butirato originan la producción de CH₄ por la mayor disponibilidad de CO₂ e H₂ para las arqueas metanogenicas. Los protozoarios del rumen producen acetato e H₂ como productos f inales de su metabolismo, además generan mayor producción de H₂ cuando las dietas son a base de forrajes, una alta proporción de acetato origina una mayor producción de CH₄, lo que se traduce en una baja utilización de la energía por el rumiante (^{Ley de Coss et al., 2018}).

La menor (P < 0.05) producción de CO₂ la presentaron los pastos Cynodon nlemfuensis y Panicum maximum, mientras que la mayor (P < 0.05) producción la tuvieron Pennisetum purpureum cv. Taiwan morado y Pennisetum purpureum cv. Maralfalfa. La disminución de la emisión de CO₂ e H₂ en rumen es importante porque existe menor disponibilidad de estos sustratos para la producción de CH₄ (^{Morgavi et al., 2010}).