Material vegetal y tratamientos

Semilla de lechuga (Lactuca sativa L.) "Parris Island cos" de Heirloom Seeds^® fueron germinadas en placas de foamy agrícola, 40 días después de la siembra las plántulas se trasplantaron en un sistema hidropónico NFT y la nutrición del cultivo se realizó utilizando la solución nutritiva ^{Steiner (Steiner, 1961)}. Los tratamientos evaluados consistieron en la aplicación foliar de sulfato de hierro (FeSO₄ 7H₂O, Sigma-Aldrich^®): 0, 20, 25, 30 y 35 µM L^-1, utilizando agua destilada como diluyente y un surfactante comercial no tóxico (INEX-A^®, 2 mL L^-1). Las aplicaciones foliares se realizaron con aspersores manuales durante las primeras horas de la mañana, en total se realizaron tres aspersiones cada 15 días después del trasplante.

Muestreo

Las lechugas se cosecharon a 60 días después del trasplante, se midieron y se pesaron para determinar el crecimiento total y el rendimiento total del cultivo. Al mismo tiempo, se recolectaron muestras para cuantificar las variables bioquímicas y el contenido de Fe, obteniendo cinco muestras por cada tratamiento.

Rendimiento

Para determinar el peso fresco (rendimiento del cultivo), las cabezas de lechuga se cosecharon y se pesaron en una balanza analítica (Ohaus Corporation, Pine Brook, NJ, USA).

Análisis del contenido de nutrientes

El contenido de micronutrientes se determinó mediante digestión triácida. Se pesó un gramo de cada muestra en una balanza analítica (HR-120), con una precisión de 0.0001 g. Luego se colocó la muestra en un vaso de precipitados de 250 mL con perlas hirviendo y se agregaron 25 mL de mezcla tríacida (1 L de HNO₃, 100 mL de HCl, 25 mL de H₂SO₄). Después de esto, la muestra se colocó en una parrilla de digestor en una campana extractora durante una hora. Al final, las muestras resultantes se filtraron en matraces aforados de 50 mL (solución madre), se calibraron y se agitaron con agua triple destilada. Finalmente, las muestras se vertieron en tubos de 50 mL para centrifugarlas. Las concentraciones de Zn, Mn, Cu, Fe se determinaron mediante espectrofotometría de absorción atómica (AAS, iCE 3000 Series, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), y los resultados se expresaron en mg L^-1. Los macronutrientes (K, Ca y Mg) se determinaron mediante espectrofotometría de absorción atómica (AAS, iCE 3000 Series, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), informando la concentración en porcentaje. El fósforo (P) se determinó mediante el método colorimétrico de metavanadato de amonio (NH₄VO₃) en un rango de absorción de 430 nm frente a una curva de calibración de K₂HPO₄. En total, se agregaron a los tubos de ensayo 3.5 mL de agua destilada, 500 L de la solución madre y 1 mL de reactivo de fósforo (P). Cada tubo se agitó en un vórtice y se dejó reposar durante una hora. Al final, la lectura se realizó en un espectrofotómetro de luz visible (espectrofotómetro, Genesis 10s UV / Vis, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). La concentración de P se expresó como porcentaje.

Compuestos bioactivos

Para los extractos etanólicos, se molieron 100 g de pulpa de lechuga fresca por tratamiento y se utilizaron para evaluar la calidad nutracéutica de la lechuga. Se colocó 1 g de muestra en un tubo Falcon de 15 mL y se agregaron 10 mL de grado reactivo de etanol. Después de 1 min de agitación en Vortex, se dejaron reposar durante 24 h. Los extractos etanólicos se decantaron posteriormente a 3500 rpm, y el sobrenadante se transfirió a un tubo Falcon y se almacenó a -20 °C hasta su uso.

El contenido fenólico total se determinó mediante una modificación del método de Folin-Ciocalteau (García-Nava, 2009¹). Se tomaron 150 µL de extracto etanólico, se diluyeron en 3 mL de agua (milli-Q), se agregaron 250 µL de reactivo de Folin-Ciocalteau (1N), se agitó y se dejó reaccionar durante 3 min. Posteriormente se añadieron 750 µL de Na₂CO₃ (20%) y 950 µL de agua (milli-Q). Se dejó reposar la solución durante 2 h y se cuantificaron las muestras en un espectrofotómetro UV-Vis a 760 nm. El patrón se preparó con ácido gálico. Los resultados se expresaron en mg GAE/100 g^-1 de peso fresco.

Los flavonoides totales se determinaron mediante colorimetría (García-Nava, 2009¹). Se tomaron 200 µL de extracto etanólico, se mezclaron con 1.25 mL de agua (milli-Q) y 75 µL de NaNO2 (5%). Después de 5 min de reposo, se agregaron 150 µL de AlCl₃. Posteriormente, se añadieron 500 µL de NaOH (1 M) y 275 µL de agua (milli-Q). Se agitó vigorosamente y las muestras se cuantificaron en un espectrofotómetro UV-Vis a 510 nm. El estándar se preparó con quercetina disuelta en etanol absoluto (y = 0.0122x-0.0067; r² = 0.965). Los resultados se expresaron en mg QE/100 g^-1 de peso fresco.

La capacidad antioxidante total se midió mediante el método DPPH⁺ in vitro (^{Brand-Williams, Cuvelier y Berset, 1995}). Se preparó una solución de DPPH⁺ (Aldrich, St. Louis, MO, USA) en etanol, a una concentración de 0.025 mg mL^-1. Se mezclaron 700 µL de extracto etanólico con 1.300 µL de solución DPPH⁺, después de 30 min las muestras se cuantificaron en un espectrofotómetro UV-Vis a 517 nm. Los resultados se expresaron en µM equivalente en Trolox/100 g^-1 de peso fresco.

Análisis estadístico

El diseño experimental fue completamente al azar con seis repeticiones por tratamiento, considerándose una planta como unidad experimental. Las variables respuesta fueron analizadas mediante un análisis de varianza para determinar las diferencias entre los tratamientos y donde se detectó diferencia significativa, se utilizó la prueba Tukey (P ≤ 0.05).

Rendimiento

Los resultados indican que la aspersión foliar de hierro (Fe) en las dosis utilizadas no afectó significativamente el peso fresco de la lechuga (Cuadro 1), obteniéndose el mayor peso fresco de lechuga aquellas que fueron asperjadas foliarmente con 30 µM L^-1, superando al resto de los tratamientos. ^{Giordano et al. (2019)} reportan un aumento en el peso fresco de Lactuca sativa L tratadas con Fe, en comparación con las plantas no tratadas, de la misma manera, ^{Cecílio-Filho, Mendoza, de Sordi y Urrestarazu (2015)} en Cichorium intybus utilizando dosis crecientes de Fe, encontraron que la altura de la planta, el número de hojas, así como el peso fresco de la planta reducían a medida que aumentaba la concentración de Fe. Los resultados anteriores y a pesar de que el Fe es un elemento clave en crecimiento y muchos procesos fisiológicos de las plantas, también participa en la reacción de Fenton, que consiste en la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS), las cuales causan destrucción celular, porque reaccionan con grasas poliinsaturadas ácidos, proteínas y ácidos nucleicos (^{Briat, Dubos y Gaymard, 2015}; ^{Przybysz, Wrochna, Małecka, Gawrońska y Gawroński, 2016}), probablemente esta sea el motivo de que disminuya el rendimiento como lo señala ^{Giordano et al. (2019)}, quienes reportaron una disminución en el rendimiento de Lactuca sativa L, al aumentar las dosis de Fe; sin embargo, en nuestro trabajo no se observaron síntomas de toxicidad ya que el umbral de toxicidad puede variar entre especies, lo anterior significa que las dosis utilizadas en este trabajo están dentro de los rangos adecuados.

Análisis nutrimental

El contenido de nutrimentos en la parte comestible de los cultivos determina el contenido de minerales que proporcionará al ser humano cuando estos sean consumidos (^{Guillén-Molina et al., 2016}). En el presente estudio, se observó un incremento en el contenido foliar de N, P en las hojas de lechuga tratadas con de 20 µM L^-1 y en el caso de Fe, el contenido de este micro nutrimento estuvo influenciado por la dosis utilizada; las mayores dosis aplicadas promovieron una acumulación de Fe en las hojas de lechuga, sin efectos significativos en el resto de los nutrimentos (Cuadro 2). Para el caso de elementos como Mn, Zn, se ha reportado efectos antagónicos entre el Fe y estos micronutimentos (^{Ghasemi-Fasaei y Ronaghi, 2015}), en el presente trabajo si se presenta este efecto, pero sin existir diferencias significativas por los incrementos del Fe asperjado. Se ha señalado una relación positiva entre el contenido de nitrógeno y la suplementación con Fe (^{Cakmak, Pfeiffer y McClafferty, 2010}), pues bajo una adecuada nutrición nitrogenada y la aspersión foliar con Fe aumenta la absorción de N, P y Fe en el tejido vegetal (^{Aciksoz, Yazici, Ozturk y Cakmak, 2011}), en relación con el P,^{Guillén-Molina et al. (2016)} señala que la aspersión foliar con Fe aumenta el P en el tejido y dosis excesivas lo disminuyen. El mayor contenido de Fe en la parte comestible de la planta también se ha reportado con la aspersión foliar de Fe con una dosis que fluctúa entre 20 y 50 µM en Phaseolus vulgaris (^{Sida-Arreola, Sánchez, Ávila, Zamudio y Acosta, 2015}), la fertilización foliar con Fe puede incrementar el contenido de Fe en cereales entre un 15 y 30% (^{Prasad y Shivany, 2020b}). El Fe se encuentra en muchos alimentos, especialmente aquellos en el reino animal y, a menudo, estas fuentes no son accesibles para personas de bajos ingresos; por lo tanto, la lechuga biofortificada con Fe es una buena alternativa por las implicaciones positivas que puede tener en la nutrición humana.

Compuestos bioactivos

La aplicación foliar de Fe, promovió un aumento en la biosíntesis de compuestos bioactivos, obteniendo los valores más altos de estos metabolitos con la dosis de 30 μM L^-1 (Cuadro 3). Estos resultados son similares a los reportados por ^{Przybysz et al. (2016)} al indicar que la concentración y actividad de los sistemas antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos aumenta con el contenido de Fe de las plantas; estos metabolitos secundarios que tienen una gran actividad antioxidante y efectos beneficiosos contra las enfermedades crónicas enfermedades, como inflamación, diabetes y algunos tipos de cáncer (^{Kim et al., 2016}). La producción de alimento de origen vegetal con un alto contenido de compuestos fitoquímicos es deseable ya que estos compuestos aumentan la calidad nutricional de los alimentos (^{Schiavon, Nardi, Dalla y Ertani, 2020}) y su consumo pueden mejorar la salud humana (^{Gupta y Gupta, 2017}). El Fe es un cofactor en la producción de compuestos bioactivos con alta capacidad antioxidante (^{Porras-Loaiza y López-Malo, 2009}), los cuales eliminan los radicales libres causantes de enfermedades cardiovasculares en el ser humano (^{Zapata-Vahos, Rojas, David, Gutiérrez y Castro, 2020}). Se reporta que la aplicación de dosis bajas de Fe aumenta la acumulación de metabolitos secundarios, mejorando así el perfil funcional de hortalizas (^{Giordano et al., 2019}); en cambio concentraciones superiores a 500 mg kg^-1 causan toxicidad, lo que puede ocasionar daños asociados a la formación de especies reactivas de oxígeno, induciendo la actividad de enzimas antioxidantes como como ascorbato peroxidasa, además de daños a la membrana y deterioro irreversible de la estructura celular, el ADN y las proteínas (^{Marschner, 2011}).