Preparación del material fertilizante

El fertilizante nanocompuesto de nitrógeno (NCN) se preparó con una bentonita con espacios interlaminares en un rango de 60-100 nm (Figura 1a) microscopia electrónica de barrido (SEM, UHR FEI HELIOS NANOLAB 600, E.U.A), con una distribución uniforme de partículas (Figura 1b) microscopia electrónica de transmisión TEM (model JEM 1230, JEOL, USA). Para el cambio de polaridad se añadió el surfactante catiónico hexadecylamina (HDA CH₃ (CH₂)₁₅NH₂, Aldrich Chemicals) y se añadió Ca (NO₃)₂ ^- para la absorción en las láminas de la bentonita, de acuerdo con la metodología propuesta por ^{Romero-Méndez et al. (2019)}. Se utilizó un espectrofotómetro UV-Visible (Thermo CIENTIFIC GENESYS™ 10S U.S.A.) para determinar la concentración cargada de nitrato en el material nanocompuesto. La carga se obtuvo por la diferencia de concentración final e inicial que fue de 110 mg g^-1 de NO₃ ^-. Se analizó la liberación de NO₃ ^- del NCN durante 45 días por espectrofotometría UV-vis (Thermo CIENTIFIC GENESYS™ 10S U.S.A), se utilizó una solución Steiner de NO₃ ^- de 3, 6, 9 y 12 mmol L^-1 en 50 mL de agua desionizada.

Figura 1: a) Microscopia electrónica de barrido (SEM), b) Microscopia electrónica de trasmisión (TEM) del nanocompuesto nitrogenado.  

Figure 1: a) Scanning electron microscopy (SEM); b) Transmission electron microscopy (TEM) of the nitrogenous nanocomposite. 

Establecimiento del experimento

Al suelo utilizado se le realizó un análisis fisicoquímico (^{NOM-021-SEMARNAT-2000, 2002}) con las determinaciones: textura franco-arenosa, arena 76%, limo 8% y arcilla 16%, densidad aparente 1.37 g cm^-3, pH 7.9 y CE en extracto de saturación 0.6 mS cm^-1, contenido de materia orgánica de 1.4%, 6.0 kg ha^-1 de nitrógeno inorgánico, 16 kg ha^-1 de fósforo extraíble y 374 kg ha^-1 de potasio.

Se agregó 2.37 kg de suelo en columnas de PVC de 11 cm de diámetro y 20 cm de altura. En la parte inferior de la columna se colocó una malla de plástico de apertura menor a 1 mm para contener el suelo dentro de la columna y no interrumpir el flujo del lixiviado, además de un recipiente en la parte baja de la columna para colectar el drenado.

Las semillas de lechuga fueron de la variedad Montemar con una duración de 60 días, las cuales se sembraron en charolas de poliestireno de 200 cavidades, en sustrato sunshine mix 3^®, se trasplantaron en el suelo de las columnas a los 20 días cuando presentaban cuatro hojas verdaderas. Para el riego se utilizó agua desionizada y consistió en un volumen de 1350 mL distribuidos en 9 riegos cada 5 días y 150 mL a los 10, 20, 30 y 40 días para obtener drenaje y analizarlo.

Diseño y unidades experimentales

El experimento se estableció en un diseño completamente al azar, con 8 repeticiones por tratamiento, la unidad experimental consistió en una planta de lechuga colocada en una columna de suelo. La dosis de fertilización aplicada fue la recomendada en un cultivo de lechuga en suelo de 75 kg ha^-1 de Nitrógeno (^{De Grazia, Tittonell y Chiesa, 2001}). Los tratamientos evaluados fueron las dosis de nitrógeno complementados con nanocompuesto nitrogenado y fertilización convencional en una relación de 25/0, 50/0, 75/0 y 100/0, 0/100 (testigo), 25/75, 50/50 y 75/25 (Cuadro 1). El fertilizante de lenta liberación se aplicó en su totalidad al inicio del experimento sobre la superficie de la columna. Los fertilizantes comerciales que se usaron para completar la dosis de fertilización fueron K₂HPO₄, K₂SO₄ y Ca (NO₃)₂ + 4H₂O, los cuales se aplicaron a través de una solución nutritiva en cada riego durante todo el experimento.

Variables evaluadas

Al final del experimento se midieron biomasa fresca (g), área foliar (cm²), volumen radical (cm³), biomasa (g) seca de raíz y biomasa seca total (radical y aérea) en horno de secado de aire forzado (Omron, Japón), a 72 °C, hasta obtener peso constante y rendimiento (mg ha^-1). En el drenaje se determinó la conductividad eléctrica en dS m^-1 (CE Meter, Walfront, China). En hojas intermedias de la parte externa de la cabeza se registró las unidades SPAD (Soil Plant Analysis Development, SPAD-502 Plus Chlorophyll Meter 2900P, Spectrum Technologies, Illinois, USA) y el índice de vegetación de diferencia normalizada (NDVI, Green Seeker Trimble handheld crop sensor, California, USA). Para determinar la liberación del NCN se usó un espectrofotómetro UV-Visible (Thermo CIENTIFIC GENESYS™ 10S U.S.A) y se determinó la concentración de nitrato (mg L^-1) en los lixiviados y en el extracto celular del peciolo (Ionómetro Laqua Twin, Horiba, Japón).

Análisis estadístico

Los datos obtenidos fueron sometidos a un análisis de varianza y las medias de los tratamientos se compararon mediante una prueba de Tukey (P < 0.05), realizada con SAS versión 9.0 (^{SAS Institute, 2002}).

Peso fresco de hojas

En el peso fresco de la lechuga (Cuadro 2), los tratamientos mostraron en promedio 16.8 g en todos los tratamientos y estos fueron diferentes estadísticamente al tratamiento 25/0 al reducir un 20% el peso fresco. Al aplicar un nanofertilizante al 50% de la dosis recomendada aumento 24% el peso fresco de la lechuga respecto al testigo con la dosis recomendada (100 kg ha^-1), el efecto presentado es porque el nano tiene una dimensión que oscila entre 30 y 40 nm que retiene iones y los libera de acuerdo con la demanda del cultivo. (^{Nofal, Ashmawi, Mohammed, El-Abd y Helaly, 2021}). En nuestro caso, las dosis con NCN a excepción de la 25/0 mostraron un peso fresco similar, lo que pudo ser debido a que se liberó el nutriente de forma disponible para la planta y en el caso del 25/0 la cantidad de nutriente disponible en el tratamiento era menor.

Área foliar

El área foliar de los tratamientos 50/50 y 75/25 fue mayor con 16.58 % que el tratamiento 75/0 y 23% mayor que el tratamiento 25/0, que redujo 18.20% el área foliar con respecto al tratamiento testigo 0/100 (Cuadro 2). Mencionan ^{Nofal et al. (2021)}, que al aplicar un nano fertilizante NPK en lechuga, el área foliar aumentó 31% con una dosis a la mitad de la recomendada (50 kg ha^-1). En este sentido ^{Marschner (2011)} mencionan que la cantidad insuficiente de nitrógeno puede limitar el crecimiento de la planta. Sin embargo, en otros casos con el uso de los nanomateriales tienen una mayor disponibilidad del N en dosis más bajas en comparación con las fuentes de N convencionales, lo que incrementa el crecimiento vegetativo de las plantas.

Volumen radical

Se encontraron diferencias estadísticas entre tratamientos para el volumen radical de las lechugas (Cuadro 2). Con respecto al control 0/100 se registraron mayor volumen radical en los tratamientos 50/0, con 62 %, 75/0 con 78 % y 100/0 con 87 %, mientras que los tratamientos 25/75, 50/50, 75/25 y 25/0 fueron iguales al control. ^{Okyay, Karagöz, Ulaş y Özen (2020)} mencionan que las plantas con fertilizantes convencionales alcanzan el desarrollo radicular adecuado para obtener el nitrógeno y los fertilizantes de lenta liberación promovieron el crecimiento de la raíz hasta el último período de cosecha.

Biomasa seca

La biomasa seca de la raíz presentó una diferencia significativa entre el tratamiento 100/0 con un aumento de 57% en comparación con el control 0/100 (Cuadro 2). Menciona ^{Okyay et al. (2020)} que aplicar un nanofertilizante aumentó el crecimiento radicular en plantas de lechuga romana.

La biomasa seca total presentó diferencias entre tratamientos (Cuadro 2), el tratamiento de NCN aplicado 100/0 presentó el mayor valor de 5.5 g y una diferencia de 31% comparado con 0/100, 25/75, 75/25 y 25/0 y los demás tratamientos no mostraron diferencias. De igual manera al aplicar un nanofertilizante NPK en lechuga la biomasa seca aumentó con la dosis 50 kg ha^-1que es la mitad de la dosis recomendada (^{Nofal et al., 2021}). ^{Sharaf-Eldin et al. (2022)} mencionan que la evaluación de dos ciclos en el cultivo de lechuga aumentó de 123 a 159% el peso de la planta con aplicaciones al suelo y foliares con un nanofertilizante nitrogenado en suelo 75% nanopartículas y 25% fertilizante convencional. (^{Abdel-Aziz, Hasaneen y Omer, 2016}) mencionan que el efecto positivo de los nanofertilizantes aumentan la materia seca, debido a la presencia de macronutrientes que mejoran la eficiencia de absorción y uso de nutrientes.

Rendimiento

En el rendimiento de la lechuga, casi todos los tratamientos fueron estadísticamente iguales al control a excepción del tratamiento 25/0 con un valor de 3.05 Mg ha^-1, al reducir 20.7% menos que el testigo 0/100 (Cuadro 2). ^{Sharaf-Eldin et al. (2022)} al aplicar fertilización nitrogenada en forma de nanofertilizante como 25% foliar y 75% fertiirrigación obtuvo rendimientos de 20 Mg ha^-1. En nuestro caso, el rendimiento refleja que la dosis de fertilización nitrogenada fue deficiente por el bajo crecimiento y peso que obtuvo la lechuga con los diferentes tratamientos.

Conductividad eléctrica (CE)

Los resultados de la conductividad eléctrica del lixiviado mostrados en el Cuadro 3, a los 10, 20 y 40 días no presentaron diferencias significativas entre tratamientos. Dado que las lecturas de CE no son selectivas de iones, cualquier ion en solución contribuirá en sus valores (^{Cancellier, Degryse, Silva, da Silva y McLaughlin, 2018}), de tal manera que la conductividad eléctrica aumenta debido a la liberación de nutrientes por parte del fertilizante (^{Zanin, Maucieri, Dal Ferro, Bortolini y Borin, 2020}), además de que las plantas los absorben más fácilmente (^{Andiru, Pasian y Frantz, 2015}). En este caso la cantidad de nitratos aplicados como NCN o como fertilizante convencional no influyeron en mostrar una CE diferente entre tratamientos. En el día 30 el tratamiento 25/75 mostró una diferencia significativa en los valores de conductividad con un 32% comparado con los tratamientos 25/0, 75/0 y 100/0. Mencionan ^{Gwenzi, Nyambishi, Chaukura y Mapope (2018)} que los fertilizantes convencionales se caracterizan por una rápida liberación de nutrientes y pérdidas potencialmente altas de nutrientes por lixiviación y escorrentía. En este caso los tratamientos del fertilizante convencional liberaron menor cantidad de iones en el drenaje y en el caso del NCN pudo ser debido a que se libera más lento que el fertilizante convencional y la cantidad fue mayor a lo que la planta podría absorber en los primeros días, por ello se acumuló más CE en el lixiviado.

Unidades SPAD

En las unidades SPAD que se registraron durante el ciclo del cultivo (Cuadro 4), los valores no mostraron diferencias significativas entre tratamientos durante el desarrollo del cultivo, con valores promedios de 25 a 30 unidades SPAD que serían bajos según lo reportado por otros autores en lechuga como lo mencionan ^{Lara-Izaguirre, Rojas, Romero, Ramírez, Cruz, Alcalá y Loredo (2019)}) el efecto del SPAD no varía en relación con las dosis de nitrógeno, pero si el cultivar en diferentes ciclos, en otoño valores de 39.38 y en verano 29.58. Los cambios de color de las hojas son causados por cambios en la absorción de N por parte del sistema radicular, y el color de la hoja es una medida de diagnóstico importante para las plantas (^{Ling et al., 2005}). En este trabajo la coloración de las lechugas a la cosecha era de un verde pálido (Figura 2), lo que influyo en los valores bajos de las unidades SPAD y pudieron ser debido a la aplicación de una dosis baja de nitrógeno (75 kg ha^-1).

Figura 2: Plantas de lechuga con nanocompuesto nitrogenado en columnas de suelo.  

Figure 2: Lettuce plants with nitrogenous nanocomposite in soil columns. 

Índice de vegetación de diferencia normalizada (NDVI)

Para el NDVI (Cuadro 4), al día 10 se presentaron diferencias significativas en donde los tratamientos con NCN fueron más bajos en comparación con los tratamientos que solo contenían fertilizante convencional, ^{Gwenzi et al. (2018)} mencionan que esto pudo ser posible debido a la liberación rápida de nutrientes.

Para los días 20, 30 y 40 no se presentaron diferencias significativas mostrado valores entre 0.30 y 0.40. Estos valores del NVDI son bajos comparados con los obtenidos por ^{Lara-Izaguirre et al. (2019)} en un cultivo de lechuga en verano (0.65) y otoño (0.66). Igualmente, (^{Galieni, Stagnari, Speca y Pisante, 2016}) mencionan que las estaciones de crecimiento en lechuga no tienen diferencias (0.82 a 0.85) y en tratamientos sin N reducen los valores de NVDI. Los cambios morfológicos y fisiológicos de las hojas pueden emplearse como indicadores de condiciones de crecimiento limitante en términos de estrés (^{Kizil, Genc, Inalpulat, Şapolyo y Mirik, 2012}). En este caso el estrés en el cultivo de lechuga reflejado en los valores del NVDI en todos los tratamientos reflejaron menor disponibilidad de nitrógeno pudo ser debido a que se aplicó una dosis baja de nitrógeno (75 kg ha^-1) de acuerdo con lo mencionado por (Velázquez, Ruiz, Chávez y Luna, 2014) que utilizo 115 kilogramos por hectárea.

Comportamiento de liberación de NO₃ ^- en agua desionizada

Los resultados obtenidos de la liberación permiten ver que el nitrato cargado en el material NCN libera gradualmente la cantidad durante 45 días inclusive supera la cantidad calculada de nitratos que contiene el NCN (Figura 3). Se puede observar que a mayor concentración de la cantidad de nitrógeno agregada se liberó mayor cantidad de nitratos. Liberaron cerca del 100% aproximadamente a los 10 días, sin embargo, el material NCN continúo liberando hasta los 45 días de estudio en promedio 157% para 3 mmol L^-1, 131% para 6 mmol L^-1, 71% para 9 mmol L^-1 y 33% para 12 mmol L^-1 de nitrato.

Figura 3: Liberación de nitrato durante el desarrollo de lechuga con nanocompuesto nitrogenado en columnas de suelo. * Letras distintas en los tratamientos indican diferencias significativas Tukey (P < 0.05).  

Figure 3: Nitrate release during lettuce plant development with nitrogenous nanocomposite in soil columns. * Different letters in the treatments indicate significant differences Tukey (P < 0.05). 

Concentración de nitrato en los lixiviados

La concentración de nitrato (Figura 4), en los lixiviados en los primeros 10 días presentó valores diferentes significativamente entre tratamientos, donde los registros más altos se obtuvieron con los tratamientos que contienen nanocompuesto desde la dosis más baja hasta la más alta, con y sin fertilizante. Sin embargo, el tratamiento NCN 50/0 mostró mayor concentración de 23%, comparado con los tratamientos con base de fertilizante convencional; a la vez, la fertilización convencional presentó un mayor valor igual a 40% comparado con el control 0/100. En este sentido ^{Okyay et al. (2020)} mencionan que el suministro de nutrientes del fertilizante de lenta liberación de nitrógeno estaba listo para su uso en el suelo, pero no pudo ser tomado por la planta ya que la liberación no coincidió con el tiempo de cosecha de la lechuga, por lo que se quedó una gran cantidad de nitrógeno en el suelo al término de los experimentos.

Figura 4: Concentración de iones nitrato en el lixiviado obtenido durante el desarrollo de lechuga con nanocompuesto nitrogenado en columnas de suelo. *Letras distintas en los tratamientos indican diferencias significativas Tukey (P < 0.05). DDT = días después del trasplante.  

Figure 4: Nitrate ion concentration in the leachate obtained during lettuce plant development with nitrogenous nanocomposite in soil columns. *Different letters in the treatments indicate significant differences Tukey (P < 0.05). DDT= Days after transplant. 

A los 20 días, se observó la misma tendencia que a los 10 días, aunque el mayor valor lo obtuvo NCN 75/0. El día 30, los tratamientos donde se aplicó el nanocompuesto mostraron valores más altos en comparación con los fertilizantes convencionales y el mayor valor fue con 100/0. Caso contrario ^{Fernández, Esteban, Conesa, Ochoa y Álvarez (2012)} en el cultivo de lechuga al aplicar fertilizantes nitrogenados de lenta liberación en tres ciclos sucesivos, encontró que la concentración de nitratos disminuyó en el lixiviado conforme pasó el ciclo de cultivo en todos los tratamientos, en el fertilizante convencional desde 300 a 150 mg L^-1 de NO₃ ^- y el de lenta liberación fue menor de 170 a 50 miligramos por litro.

A los 40 días, los fertilizantes convencionales con las dosis más bajas 0/100, 25/75, 50/50 y las dosis de nanocompuestos más altas 75/0 y 100/0, fueron los que menor cantidad de lixiviados mostraron; caso contrario los valores más altos de nitrato en los lixiviados fueron con nanocompuesto sin fertilizante convencional 25/0 y 50/0 con valores de 538 y 483 NO₃ ^- mg L^{-1Saha, Rose, Wong, Cavagnaro y Patti, (2018)} mencionan que la utilización de fertilizantes de lenta liberación disminuye su contenido en el lixiviado.

En nuestro caso los mayores contenidos de nitrato en los lixiviados con NCN se podrían explicar por la forma de aplicación del fertilizante convencional que fue con cada riego y esto disminuye la lixiviación. También debido a la fracción correspondiente al NCN liberó más cantidad de nitrato que la calculada (Figura 3), por consecuencia la dosis de N en los tratamientos con NCN mostró mayor cantidad de nitrato lixiviado.

Concentración de nitrato en peciolo

La concentración de nitrato en el peciolo mostró diferencias significativas entre los tratamientos (Figura 5). Los mayores valores se presentaron con los tratamientos NCN 50/0 y 75/0, quienes tuvieron en promedio 2700 mg L^-1 con un aumento del 24% a diferencia de todos los tratamientos con un valor promedio de 2000 mgL^-1, a excepción de 100/0 que fue estadísticamente igual a los mejores tratamientos, pero diferente a 0/100, 50/50 y 75/25 al aumentar un 19% más que el tratamiento sin nanocompuesto nitrogenado 0/100. La concentración de nitratos en peciolo puede cambiar conforme a las condiciones climáticas en las épocas de cultivo, como lo mencionan ^{Lara-Izaguirre et al. (2019)} en lechuga con diferentes relaciones de NO₃ ^-/NH₄ ⁺ en el verano de 5431 mg L^-1 de NO₃ ^- y 2416 mg L^-1 en otoño. ^{Fernández et al. (2012)} evaluaron la fertilización durante tres ciclos sucesivos en lechuga cultivada en suelo. En el primer ciclo, la mayor concentración de nitrato con el tratamiento control 1200 mg kg^-1, en el segundo aumentó en todos los tratamientos, fue mayor con fertilización control y un fertilizante de lenta liberación entre 2000 y 2800 mg kg⁻¹. Al final, disminuyeron en todos los tratamientos, fue mayor en fertilización control con 611 mg kg^-1 y un fertilizante de lenta liberación con 515 miligramos por kilogramo.

Figura 5: Concentración de iones en peciolo de lechuga con nanocompuesto nitrogenado cultivada en columnas de suelo. * Letras distintas en los tratamientos indican diferencias significativas Tukey (P < 0.05).  

Figure 5: Ion concentration in lettuce petiole with nitrogenous nanocomposite grown in soil columns. * Different letters in the treatments indicate significant differences Tukey’s (P < 0.05).