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Introducción
Ecuador ocupa el cuarto lugar en exportación de cacao (Theobroma cacao L.) con 293 487 toneladas al año, producidas en 559 617 hectáreas (Anzules-Toala et al., 2022). Sin embargo, existen grandes pérdidas de casi el total de su producción por hectárea por la presencia de patógenos que afectan la mazorca en épocas de mayor humedad y altas temperaturas (El Salous, Marcillo, Vargas y Alcivar, 2020).
La enfermedad de la mazorca negra afecta a las plantaciones de cacao, causada por diferentes especies de oomiceto hemibiotrófico superior al género Phytophthora spp. como P. megakarya, P. capsici, P. citrophthora, y P. palmivora, donde esta última es la más virulenta y dañina (Perrine-Walker, 2020). Por el tamaño de sus esporangios, germina en el agua con facilidad para formar zoosporas móviles o produciendo un tubo germinal en la periferia de la pared de los esporangios (Kuswinanti, Patandjengi y Hardina, 2023). El micelio tiene la capacidad de propagarse por todas las partes del árbol de cacao en cada fase de su desarrollo, llegando a incidir en el proceso de maduración de la mazorca (Decloquement et al., 2021).
La muerte regresiva ocasionada por el género Lasiodiplodia spp., como L. theobromae endofíticos cosmopolitas (Vanam, Ather, Madhura y Rudramurthy, 2019; Uranga et al., 2016), se presenta en las mazorcas de cacao con la presencia de manchas negras de apariencia a polvillo negro que se asimila al carbón (He, Matsuura y Yoshihara, 2004; Alvindia y Gallema, 2017). También expresa la muerte regresiva en el área foliar como clorosis y necrosis (Mbenoun, Momo, Samuels, Nsouga y Nyasse, 2008). Estas enfermedades provocan pérdidas de rendimiento significativas de mazorcas de un 30 hasta un 10% de los árboles anualmente una vez que ha infectado el cacao (Acebo-Guerrero, Hernández, Heydrich, El Jaziri y Hernández, 2012; Bahia et al., 2015). En la búsqueda de estrategias de biocontrol, las investigaciones se han orientado hacia el empleo de bacterias con propiedades beneficiosas para las plantas. Entre estas, se destacan Pantoea agglomerans sp., Flavobacterium sp. (Gunasinghe y Karunaratne, 2009), Streptomyces sp. (Sajitha y Florence, 2013), Bacillus subtilis (Sultana y Ghaffar, 2010), Pseudomonas fluorescens sp. (Muthukumar, Raj, Udhayakumar y Naveenkumar, 2019), Azospirillum sp. y Azotobacter sp. (Sangeetha, Thangavelu, Usha-Rani, Muthukumar y Udayakumar, 2010), consideradas como rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR).
Las rizobacterias usan su propio metabolismo para solubilizar fosfatos por la producción de ácidos orgánicos donde las enzimas fosfatasas juegan un papel importante en la mineralización del fósforo insoluble a soluble asimilable a la planta (Behera, Singdevsachan, Mishra, Dutta y Thatoi, 2014), secretan fitohormonas como el ácido indol-3-acético (AIA) que controla diversos procesos fisiológicos como la elongación y división celular (Vega-Celedón, Canchignia, González y Seeger, 2016). Fijan nitrógeno atmosférico, aumentan la absorción de agua y nutrientes por parte de las plantas, mejorando el desarrollo de las raíces y la actividad enzimática de las plantas en combinación con fungicidas (Ganeshan y Manoj, 2005). Los compuestos antifúngicos producidos por la rizobacterias actúan sobre la germinación de las esporas que pueden ser termoestables y los que actúan sobre los micelios pueden incluir también compuestos termolábiles (Backer et al., 2018).
Grandes poblaciones de rizobacterias endófitas del género Pseudomonas fluorescens viven en la rizosfera del suelo y se transportan a través de los conductos de xilema y floema en la superficie de la hoja (Oliveira-Santana et al., 2018; Bhetwal et al.,2021). Estas bacterias no solo fomentan el crecimiento de las plantas, sino que también ejercen un control supresor sobre fitopatógenos mediante diversos mecanismos. Entre ellos, se destaca la producción de antibióticos volátiles, sideróforos, cianuro de hidrógeno (HCN) (Rijavec y Lapanje, 2016), así como la enzima quitinasa (Sajitha y Florence, 2013) y otros metabolitos auxiliares. Estas rizobacterias, simultáneamente, compiten con los fitopatógenos por nutrientes y desencadenan la Inducción de Resistencia Sistémica (ISR) en las plantas para fortalecer su capacidad defensiva contra enfermedades (Pieterse et al., 2014).
La aplicación excesiva de productos químicos sintéticos para controlar hongos fitopatógenos afecta negativamente las funciones microbianas del suelo provocando una alteración en la diversidad y composición de la comunidad bacteriana (Onwona-Kwakye et al., 2020). El trabajo de investigación se enfocó en seleccionar rizobacterias con potencial solubilización de nitrógeno, fósforo y potasio productoras de enzimas líticas de biocontrol hacia Phytophthora palmivora y Lasiodiplodia theobromae.
Materiales y Métodos
La investigación se ejecutó en el Laboratorio de Biotecnología Molecular de la Universidad Técnica Estatal de Quevedo (UTEQ), localizado en la finca experimental “La María” ubicado en el km 7.5 de la Vía Quevedo - El Empalme, cantón Mocache, con sus coordenadas geográficas 1° 20’ 30” de latitud Sur y 79° 28’ 30” O, ubicada a 75 m de altitud.
Aislamiento de bacterias endófitas de cultivares nativos
Se recolectaron cinco muestras del tejido radicular y foliar de cultivares endémicos CCN-51 de las provincias, Los Ríos, Guayas, Bolívar, Esmeralda, Manabí, Santa Elena. Esto generó un total de 30 muestras, donde se almacenaron en bolsas de plástico ziploc® y trasladas al laboratorio de biotecnología molecular para su procesamiento. El tejido radicular fue sumergido en agua destilada estéril separando las partículas del suelo y segmentadas en 5 cm para su maceramiento en agua destilada estéril y procesadas en diluciones en serie. El tejido foliar fue lavado con abundante agua estéril-alcohol al 70% secadas con papel absorbente para ser cortadas en fragmentos de 2 cm2. Las muestras de tejidos de cada procedencia se ubicó cajas Petri con King B Agar [(g/L): peptona, 20.0; glicerol, 15 mL; K2HPO4, 1.5 g; MgSO4 x 7H2O, 1.5 g; agar, 15 g)] e incubadas a 28 °C por 24 h. Se observó la presencia de pigmento fluorescente bajo la luz ultravioleta a 365 nm (Nathan, Rathinam, Kasi, Rahman y Subramaniam, 2011). Se tomó una colonia bacteriana fluorescente e inoculada en 50 mL de King B líquido a 28 °C por 48 h/150 rpm y almacenada en glicerol al 20% a -40 °C para su conservación.
Caracterización bioquímica de los aislados
Se rescató 10 µL del inoculo bacteriano 5×10-4 colonias mL-1 desarrollados en 50 mL de King B liquido e inoculadas en medio Gelatin [(g L-1): peptona, 4 g; extracto de levadura, 1 g; gelatina, 12 g; agar, 15 g] (Smith y Goodner, 1958) evaluando la actividad proteolítica. Los halos de degradación alrededor de la colonia se observaron a las 24 horas, la producción de sideróforos se recogieron 5 mL de bacteriana sometidas en tubos falcón de 15 mL adicionándole 5 mL de FeCl3 al 2% en relación 1:1 la formación del cambio de color marrón a anaranjado indica la presencia de sideróforo (Sujatha y Ammani, 2013).
Evaluación de la actividad solubilizadora de N-P-K
Se seleccionaron nueve rizobacterias de plantaciones de cacao CCN-51, extraídas del sistema radicular y foliar de Los Ríos: BF 567, FZ 9-7, LH 5-10, MH-18, MH 4-20, MN 5-20 y MN 5-19. Santa Elena: AC3. Esmeralda: PV-25 que presentaron características consideradas como PGPR por su actividad antagonistas, Estas bacterias se incubaron en 75 mL de King B líquido a 28 °C por 24 h a 180 rpm en un agitador, Rescatando 5 μL de cada suspensión celular e inoculadas en cajas Petri con el medio de cultivo Cristensen´s Urea Agar [(g L-1): peptona 1g, dextrosa 1g, Nacl 5g, K2HPO4 2g, urea 20g, rojo fenol 0.012g, agar 15 g)] (Brink, 2010), Pikovskaya modificado [(g L-1): glucosa 10 g, KNO₃ 5 g, KCl 0.2 g, (NH₄)₂SO₄ 0.5 g, MgSO₄·7H₂O 0.1 g, púrpura de bromocresol 0.125 g, agar 15 g)] y NBRIP [(g L-1): glucosa 10 g, Ca3PO4 5 g, MgCl2 x 6H2O 5 g, KCl 0.2 g, (NH4)2SO4 0.1 g, agar 20 g)] (Nautiyal, 1999) e incubadas a 28 °C por tres días. El proceso se realizó por triplicado. Se evaluó a las 24, 48 y 72 h después de la inoculación para determinar el porcentaje de solubilidad de N-P-K. Se observó cada colonia con una zona de halo claro y se midió el diámetro del halo (HD) y el diámetro de la colonia (CD). Empleando la siguiente fórmula planteada por Joshi, Jaggi, Tiwari, Sah y Sahgal (2019) (ecuación 1).
Obtención de los sobrenadantes celulares antagonistas
Las rizobacterias se incubaron en 75 mL de king líquido a 180 rpm a 28 °C por 48 h en agitación constante. Se vertieron 15 mL del cultivo bacteriano y centrifugado a 6000 × g 5 min-1. Los sobrenadantes fueron filtraron empleando Nalgene Syringe de 0.2 µm para descartar la presencia de células bacterianas, sometidas a choque térmico de 15 min a 90 °C a baño María y 15 min a -40 °C por triplicado y almacenados a 4 °C (Chávez-Arteaga et al., 2020).
Ensayos de sobrenadantes antifúngico al crecimiento micelial de P. palmivora y L. theobromae
Se utilizaron cepas de P. palmivora y L. theobromae donadas por Carmen Suarez (INIAP) con un crecimiento micelial de siete días. Se colocaron 0.1 mL de sobrenadantes celulares previamente homogenizado en 10 mL de medio de cultivo PDA y distribuidas en cajas Petri, Se incorporó un disco fúngico (Ø 7 mm) micelial de P. palmivora y L. theobromae por separado. Se evaluó el porcentaje de inhibición desde el extremo del tarugo hasta el crecimiento fúngico a las 24, 48 y 72 h, utilizando la fórmula propuesta por Qingwei et al., (2023) (ecuación 2).
Donde el porcentaje de inhibición es el porcentaje de inhibición del crecimiento micelial del fitopatógeno. Crecimiento del control es el radio micelial del fitopatógeno. Crecimiento del tratamiento es el radio micelial del fitopatógeno que crece frente al sobrenadante bacteriano.
Cada experimento contempla 3 réplicas con 2 unidades experimentales cada una para la solubilización de N P K y antagonismos a P. palmivora y L. theobromae. Los valores a cada condición están representados con la desviación estándar promedio individual (±), los tratamientos fueron sujetos al análisis de varianza por ANOVA, y separados por procedimiento de comparación múltiple de Tukey SD, al nivel de significancia de (P ≤ 0,05), empleando el programa estadístico Statgraphics CenturionTM V.18 (Statgraphics Technologies, 2019).
Resultados y Discusión
Aislamiento de rizobacterias endófitas
Se logró la recuperación de 155 aislados bacterianos fluorescentes por el método de dilución en serie para el tejido radicular y tejido foliar por proceso de lavado y secado impregnados en placas en king B Agar (Figura 1). La caracterización bioquímica de rizobacterias con actividad proteolítica, pigmentación fluorescente y producción de sideróforos. Determinante para el escrutinio de rizobacterias (PGPR) por su actividad inhibitoria contra hongos fitopatógenos, se presenta en el Cuadro 1. La proteasa alcalina al gen AprA producida por la cepa P. protegens CHA0 combinada con otras enzimas líticas actúa de forma, directa o indirectamente a los polímeros de la pared celular de la eclosión de los huevos y la mortalidad de los juveniles de M. incognita (Siddiqui et al., 2005; Herkersdorf et al., 2021). Las enzimas líticas degradan la pared celular fúngica, compuesta de quitinasa, β-1,3-glucanasa y proteasas por Pseudomonas fluorescens, MT9, Bacillus subtilis y Streptomyces exfoliatus. P. fluorescens presenta un antagonismo de amplio espectro hacia varios fitopatógenos como Fusarium oxysporum fsp, P. meadiiy, C. vanillae (Rathore, Vakharia y Rathore, 2020), P. palmivora (Cedeño-Moreira et al., 2020), M. perniciosa (Auhing-Arcos et al., 2021). Además, tiene la capacidad de producir un líquido soluble de color verde amarillento característico por la producción de sideróforo de tipo pioverdina, un quelante de hierro (Vindeirinho, Soares y Soares, 2021). El cual participa en el transporte de hierro de alta afinidad en presencia de otros metales hacia la célula bacteriana (Mandal y Kotasthane, 2014). Biodisponible reducido a Fe+2 que mejora el crecimiento de las plantas por los procesos metabólicos como la síntesis de ADN, la respiración celular, formación de la clorofila y la fotosíntesis al aumentar la disponibilidad de Fe cerca de la raíz (Gull y Hafeez, 2012; Rout y Sahoo, 2015) e inhiben la colonización de las raíces por patógenos de plantas u otras bacterias dañinas (Alexander y Zuberer, 1991).
Figura 1: Selección de bacterias fluorescentes de cultivares endémicos CCN-51 y caracterización bioquímica. A. Colonias extraídas del sistema radicular y foliar. B. Producción de sideróforos. C. Actividad Proteolítica. La flecha marca el halo de degradación alrededor de la colonia en el medio de cultivo Gelatin Agar.
Table 1: Root and leaf tissue collection zone in cocoa plantations CCN-51.
| Provincia | Cantón | Cepa | Tejido Vegetal | Mecanismo de acción | |||||
| Solubilización | Antagonismo | ||||||||
| N | P | K | PR | FLT | SFR | ||||
| Los Ríos | Buena-Fe | BF 567 | R | ++ | +++ | ++ | +++ | ++ | + |
| Los Ríos | Valencia | FZ 9-7 | R | ++ | ++ | ++ | +++ | +++ | + |
| Los Ríos | Valencia | LH 510 | R | + | + | ++ | ++ | +++ | + |
| Los Ríos | Mocache | MH 18 | F | + | + | + | ++ | + | + |
| Los Ríos | Milagro | MH 4-20 | F | + | + | + | + | + | + |
| Los Ríos | Las Naves | MN 5-20 | F | + | + | ++ | +++ | ++ | + |
| Los Ríos | Las Naves | MN 519 | F | + | + | + | ++ | + | + |
| Santa Elena | Santa Elena | AC3 | F | + | + | ++ | ++ | + | + |
| Esmeralda | Quinindé | PV-25 | F | + | + | + | + | + | + |
Tejido = radicular (R) y foliar (F), mecanismo de acción; Solubilización = nitrógeno (N), fósforo (P), potasio (K); Antagonismos = actividad proteolítica (PR), fluorescencia (FLT), producción de sideróforo (SFR).
Tissue = radicular (R) and foliar (F), mechanism of action; Solubilization = nitrogen (N), phosphorus(P), potassium (K); Antagonisms = proteolytic activity (PR), fluorescence (FLT), siderophore product (SFR).
Solubilización de N-P-K
Se evaluó el potencial de solubilización de diferentes minerales insolubles de las cepas bacterianas aisladas, como la solubilización de N-P-K. La cepa BF 567 mostro el diámetro máximo de la zona del halo de solubilización de N-P-K a las 24, 48 y 72 h observando diferencia significativa de 92, 90 y 100% (Figura 2 A, B y C). Las cepas MN 5-20 mostraron una solubilización lenta a las 72 h en todos los minerales.
Figura 2: Respuesta de solubilización de N, P y K por las rizobacterias. A, B y C) Porcentaje de solubilización de N-P-K a 24, 48 y 72 h después de la inoculación. D) Colonias bacterianas que muestran zonas de halo claras alrededor del crecimiento microbiano de nuevos aislados bacterianos que disuelven minerales. Las barras indican el DE individual para tratamiento (±). Medias con letras iguales en la columna no difieren significativamente según Tukey (P ≤ 0.05).
Figure 2: N, P and K solubilization response by rhizobacteria. A, B and C) Percent solubilization of N-P-K at 24, 48 and 72 h after inoculation. D) Bacterial colonies showing clear halo zones around microbial growth of new mineral-dissolving bacterial isolates. Bars indicate individual SD for treatment (±). Means with equal letters in the column do not differ significantly according to Tukey (P ≤ 0.05).
A partir de las 24 h después de la inoculación mostraron halos de avances degradatorios con actividad solubilizadoras de N P K (Figura 2 D). Reportes obtenidos por Verma, Patidar y Vaishampayan (2016) muestran el efecto de solubilización de diferentes formas de potasio en medios suplementados con KCl y K2SO4 cumpliendo un rol en las funciones fisiológicas vitales en las plantas y su disponibilidad al fruto (Ashley, Grant y Grabov, 2006; Weinert et al., 2021). Los géneros bacterianos con mayores potencialidades de uso son Pseudomonas spp. y Bacillus spp., donde sus principales mecanismos de acción incluyen la producción de ácidos orgánicos, la quelación acidólisis, polisacáridos, complexólisis y reacciones de intercambio (Etesami, Emami y Alikhani, 2017), siendo estos elementos responsables de asimilación directa de minerales insolubles presentes en el suelo (Restrepo et al., 2015). La solubilización de elementos minerales en el suelo, está relacionado al fósforo (P) y potasio (K) disponible para la nutrición de las plantas (Paredes y Espinosa, 2010).
Inhibición en el crecimiento micelial de P. palmivora y L. theobromae por sobrenadantes bacterianos
Los sobrenadantes bacterianos producidos por la cepa FZ 9-7, BF 567, PV-25 presentaron mayor presencia inhibitoria a P. palmivora y L. theobromae entre el 40, 60 y 85% evaluadas a las 24, 48 y 72 horas observando diferencia significativa entre los tratamientos. El efecto de los sobrenadantes demuestra una actividad antagonista baja por la cepa BF 567 y PV-25 con 48 y 53% a L. theobromae a las 72 horas (Figura 3A y B).
Figura 3: Efecto de los sobrenadantes bacterianos en inhibición del desarrollo micelial. A y B El Porcentaje de Inhibición al desarrollo micelial de los hongos a 24, 48 y 72 h después de la inoculación. C y D). Visualización de los sobrenadantes en la inhibición de desarrollo micelial a P. palmivora y L. theobromae. Las barras indican el DE individual para tratamiento (±). Medias con letras iguales en la columna no difieren significativamente según Tukey (P ≤ 0.05).
Figure 3: Effect of bacterial supernatants on inhibition of mycelial growth. A and B The percentage inhibition of mycelial development of fungi at 24, 48 and 72 h after inoculation. C and D). Visualization of the supernatants in the inhibition of mycelial development to P. palmivora and L. theobromae. Bars indicate individual SD for treatment (±). Means with equal letters in the column do not differ significantly according to Tukey (P ≤ 0.05).
El rendimiento de actividad antifúngica producidas por los extractos celulares bacterianos producidos por la cepa FZ 9-7, BF 567, PV-25 impiden el desarrollo del crecimiento micelial (Figura 3 C yD). Esto coinciden con Alsultan et al., (2019), donde los extractos de P. aeruginosa inhiben el crecimiento micelial de P. palmivora, tienen la capacidad de producir enzimas líticas como son la producción de pioverdina, cianuro de hidrógeno, biosurfactantes, proteasa y lipasa (Acebo-Guerrero et al., 2015), provocando anomalía morfológica producto de la degradación de la pared celular al entrar en contacto los extractos celulares con las hifas del hongo (Masanto, Wibowo, Joko, Subandiyah y Kageyama, 2020). Los metabolitos bioactivos volátiles, como la 6-pentil-α-pirona, exhiben múltiples acciones, como inhibir el crecimiento del micelio fúngico, la germinación de esporas y la pigmentación de hongos (Intana, Kheawleng y Sunpapao, 2021).
Conclusiones
Las rizobacterias aisladas del sistema radicular del cultivo de cacao CCN-51, producen enzima proteolítica, pigmentación fluorescente y producción de sideróforos por BF 567 mantiene una alta capacidad de solubilizar N-P-K de 95, 60 y 80%. En inhibición al crecimiento micelial FZ 9-7 presenta mayor biocontrol con 69 y 80%. Los extractos celulares producido por las rizobacterias endófitas degradan la pared celular de P. palmivora y L. theobromae en fase infección causando la muerte celular.
Contribución de los Autores
Investigación, conceptualización, validación, administración del proyecto, adquisición de fondo: H.F.C.M. Escritura, revisión y edición: C.J.M.H. Investigación, metodología: E.G.I. Escritura: preparación del borrador original, escritura: revisión y edición: L.F.V.B. Curación de datos, análisis de datos: D.N.T.Q. Escritura, revisión, análisis formal: Á.V.C.M.
