Poblaciones naturales muestreadas

Se seleccionaron dos poblaciones naturales de Pinus greggii var. australis localizadas en condiciones ambientales contrastantes de humedad y altitud (Cuadro 1). La población Zacualpan se encuentra en la localidad de Carrizal Chico, municipio Zacualpan, en el estado de Veracruz, México, cuya altitud es de 1600 m y su precipitación anual promedio de 1402 mm (^{Hernández-Martínez et al., 2007}). La población de Cieneguilla se localiza en El Cardonal, municipio Cieneguilla, estado de Hidalgo, México; en contraste con la otra localidad, tiene una mayor altitud (2000 m), pero menor precipitación anual (539 mm) (^{Hernández-Martínez et al., 2007}).

En cada localidad (Fig. 1) se establecieron cinco sitios de muestreo. El primer sitio se estableció de manera aleatoria en un punto cercano al centro geográfico de la población, con base en el mapa de distribución geográfica conocida de la especie (^{Hernández-Martínez et al., 2007}). En ese sitio se identificó el árbol adulto de P. greggii más cercano y a partir de ese punto se ubicaron los otros cuatro sitios de muestreo a una distancia de 20 m en cada una de las direcciones cardinales (N, S, E y O). En cada punto se eligió el árbol adulto más cercano, siguiendo las recomendaciones de ^{Reverchon et al. (2012)}.

Figura 1: Ubicación geográfica de las dos poblaciones naturales de Pinus greggii Engelm. ex Parl. var. australis Donahue & López incluidas en el estudio. 

Obtención de muestras de suelo

En el árbol elegido en cada sitio se tomaron cuatro muestras de suelo, una en cada punto cardinal (N, S, E y O), y a una distancia de 2 m del tronco (^{Reverchon et al., 2012}). Se obtuvieron 20 muestras de suelo por localidad. Estas se recolectaron en la zona de la rizósfera, en los primeros 20 cm del suelo mineral, con ayuda de un barreno de metal de 20 cm de longitud y 5 cm de diámetro, y una pala (^{Reverchon et al., 2012}). En los mismos puntos de muestreo se tomaron, con una pala, 1.5 kg de suelo adicional por árbol para ser utilizado como fuente de inóculo ectomicorrízico para el bioensayo (^{Hoeksema et al., 2012}). Las 20 muestras de suelo procedentes de las poblaciones naturales fueron debidamente etiquetadas con los datos de la localidad donde fueron recolectadas, las coordenadas del sitio, así como el número de muestra y árbol al que pertenecían. Posteriormente, se almacenaron herméticamente en un cuarto frío (2-4 °C) hasta su utilización para el análisis de los morfotipos en puntas de raíz micorrizadas.

Establecimiento del bioensayo en vivero

Con la finalidad de estimar la diversidad y diferenciación de las comunidades ectomicorrízicas en plantas sometidas a un ambiente diferente al nativo, se estableció un bioensayo de inoculación cruzada en el vivero del Posgrado en Ciencias Forestales del Colegio de Postgraduados (COLPOS), en Montecillo, Estado de México, México, en octubre de 2020. Para el desarrollo del estudio, se realizó un diseño experimental de parcelas divididas en bloques completos al azar con cinco repeticiones y unidades experimentales (parcelas) de 12 plantas, con un arreglo factorial 2³ (ocho tratamientos). Los factores de estudio fueron: a) “Presencia de inóculo micorrízico”, con dos niveles (con y sin inóculo); b) “Fuente de inóculo”, con dos niveles (Zacualpan y Cieneguilla); c) “Origen de semilla”, con dos niveles (Zacualpan, y Cieneguilla).

En el bioensayo se utilizó suelo natural recolectado en las poblaciones, tamizado con una malla de 1 × 1 cm de apertura, y sustrato formado con la mezcla de arena y corteza compostada en proporción 1:1 en volumen, esterilizado con vapor en una esterilizadora artesanal de acero inoxidable de 250 l. A este sustrato se le agregó, como fuente de inóculo, 250 ml de suelo recolectado de cada localidad por cada litro de sustrato, de acuerdo con el tratamiento correspondiente. A lo largo del estudio, el término “origen del inóculo” se refiere a la combinación del sustrato esterilizado y la fuente de inóculo. El término ambiente “con inóculo” se refiere a la combinación de sustrato esterilizado con suelo natural sin esterilizar, mientras que el ambiente “sin inóculo” (utilizado como control o referencia para separar el efecto microbiológico del efecto del suelo mineral) hace referencia a aquel al que se le agregó la misma cantidad de sustrato después de una doble esterilización, en una olla de acero inoxidable con capacidad de 250 l, con vapor (125 °C) durante seis horas, con un periodo de reposo de 48 horas entre ambas.

Para evitar la contaminación del sustrato con las fuentes de inóculo durante el bioensayo, los cuatro “ambientes” generados por la combinación de los factores “presencia de inóculo” y “origen del inóculo” se aislaron por distancia y con una barrera física elaborada con una estructura de madera cubierta con plástico y malla tul. Dentro de cada “ambiente” se ubicaron los dos niveles de “origen de semilla” con las cinco repeticiones asignadas al azar en cada uno de los cinco bloques.

En el bioensayo se utilizaron contenedores individuales de plástico de 310 cm³ de capacidad, colocados en rejillas sobre una mesa en el vivero. Después de colocar el sustrato con su nivel de inóculo, se sembraron de tres a cuatro semillas por contenedor de la fuente de semilla correspondiente. La semilla utilizada fue obtenida de lotes conservados en el banco de germoplasma del Postgrado en Ciencias Forestales del COLPOS Montecillo y recolectados en años previos en cada localidad.

Caracterización de la comunidad micorrízica en poblaciones naturales y en bioensayo

Las muestras de suelo recolectadas de las poblaciones naturales se remojaron durante 24 h para disminuir los agregados, facilitar el tamizado (con una malla de 0.85 mm de abertura), y efectuar una recuperación eficiente de las raíces cortas. Las raíces se colocaron en cajas Petri con agua destilada y se observaron bajo microscopio estereoscópico (Olympus SZ40, Tokio, Japón) para identificar la presencia de puntas micorrizadas en el sistema radical. La metodología para el almacenamiento y conservación de las puntas micorrizadas en tubos Eppendorf en una solución alcohol-agua en proporción 1:1, fue tomada y modificada de ^{Agerer (1991)}, para fines de caracterización.

En el bioensayo se realizaron muestreos de raíces a los 4, 6, 8 y 12 meses a partir de la siembra. En cada ocasión se tomaron al azar tres plantas por unidad experimental (15 por tratamiento). En cada planta se extrajo el sistema radical del contenedor, se enjuagó para separar las partículas del sustrato adheridas y se extendió en un acetato. Las muestras se cubrieron con una toalla húmeda de papel y se almacenaron en una hielera en un cuarto frío (2-4 °C) y posteriormente se fotografiaron con una cámara digital (Iphone SE, California, EUA) a una resolución 326 ppi; se incluyó una escala de referencia. Una vez obtenida la foto, las muestras se volvieron a almacenar en cuarto frío, en un recipiente hermético de plástico, con una toalla húmeda de papel en el interior; dicha metodología es propuesta por los autores con la finalidad de conservar las raíces hasta su procesamiento.

Las raíces fueron analizadas con un microscopio estereoscópico (Olympus SZ40, Tokio, Japón) para identificar y separar las raíces colonizadas (rc) por hongos ectomicorrizógenos de las no colonizadas. Las puntas micorrizadas se cuantificaron, se separaron de la raíz y se almacenaron en tubos Eppendorf para su caracterización. Por otro lado, las imágenes obtenidas fueron analizadas con un procesador de imagen “Image-J” (^{Ferreira y Rasband, 2012}), para cuantificar el número total de raíces cortas (trc). Con estos datos se calculó el porcentaje de raíces colonizadas utilizando la fórmula rc (%) = (rc/trc) × 100 (^{Rodríguez-Gutiérrez et al., 2019}).

Las puntas de raíces micorrizadas (obtenidas de las muestras en las poblaciones naturales y en el bioensayo) se observaron en un microscopio estereoscopio (20×) (Leica, S8APO, Morrisville, EUA). Los morfotipos se clasificaron con base en características diagnósticas evaluadas de manera macroscópica y microscópica. En las primeras se incluyó color, ramificación, estructura externa adicional, presencia/ausencia de micelio extracelular, su color y/o textura, y partículas minerales. Los caracteres microscópicos incluyeron el tipo de hifa (evaluado a través de la extracción y montaje de micelio), la Red de Hartig en las células del córtex (en cortes transversales), y la morfología del manto (en cortes longitudinales). Dicha caracterización morfoanatómica de morfotipos se basó en los criterios propuestos en la base de datos “Determination of Ectomicorrhizae” (^{DEEMY, 2022}).

Dentro de los objetivos del trabajo, no se consideró la identificación molecular de los morfotipos; solo se atendió su caracterización morfoanatómica. Esta no siempre permite la identificación taxonómica, pero sí el poder distinguir diferenciación entre morfotipos en puntas ectomicorrizadas bajo el supuesto de tratarse de especies distintas.

Estimación de la diversidad y diferenciación de la comunidad ectomicorrízica

Con base en el número de morfotipos encontrados por sitio de muestreo en cada localidad, se elaboró una curva de rarefacción para conocer si el esfuerzo de muestreo fue suficiente para obtener una estimación de la riqueza estable y comparable entre localidades (^{Kraker-Castañeda y Cóbar-Carranza, 2011}). Los índices de diversidad y abundancia se estimaron a partir del conteo de los morfotipos en las muestras obtenidas de las poblaciones naturales, así como en cada una de las edades de muestreo en las plantas del bioensayo. Se determinó la diversidad α con base en el índice de diversidad de Shannon y el grado de diferenciación utilizando el índice de similitud de Bray-Curtis con el software PAST (^{Hammer et al., 2001}). Se interpretó el grado diferenciación entre las comunidades a partir de los valores de similitud: valores cercanos a 0 indican mayor diferenciación, mientras aquellos cercanos a 1 revelan menor diferenciación.

Diversidad y diferenciación de morfotipos de HECM en localidades naturales

Las curvas de rarefacción (Fig. 2) se comportaron de manera asintótica en las dos localidades, con una trayectoria más elevada en Zacualpan, pero con un fuerte traslape en sus intervalos de confianza. En total se identificaron 32 morfotipos de hongos ectomicorrízicos de ambas poblaciones naturales de P. greggii (Fig. S1). En Zacualpan se encontraron 23 morfotipos diferentes, mientras que en Cieneguilla fueron 17, ocho de ellos compartidos con la otra localidad.

Figura 2: Curvas de rarefacción de los morfotipos recolectados en las poblaciones naturales de Pinus greggii Engelm. ex Parl. var. australis Donahue & López de Zacualpan, Veracruz y Cieneguilla, Hidalgo, México, con intervalos de confianza de 95% (líneas continuas para Zacualpan y líneas discontinuas para Cieneguilla). 

La comunidad ECM presentó mayor diversidad en la población de Zacualpan que en Cieneguilla, con valores del índice de Shannon de 2.82±0.01 y 1.71±0.01, respectivamente. Ambas localidades compartieron ocho morfotipos (25%), por lo que Zacualpan posee 15 morfotipos (46.9%) exclusivos y Cieneguilla nueve (28.1%). De acuerdo con lo anterior, el índice de similitud entre las poblaciones, estimado por el índice de Bray-Curtis, fue de 0.16, lo cual indica un amplio grado de diferenciación entre las comunidades de ECM de las dos poblaciones.

Los morfotipos encontrados mostraron diferencias en el tipo de manto (Fig. S2), el tipo de hifas (Fig. S3) y en la presencia de estructuras como micelio externo, rizomorfos y cordones miceliares. Con los cuatro morfotipos adicionales encontrados en las plantas del bionesayo, en total se registraron 36 morfotipos distintos, de los cuales solo cuatro se reconocieron taxonómicamente como Tomentella sp., Rhizopogon sp., Cenoccocum geophilum Fr. y Wilcoxina sp. (Cuadro S1). El morfotipo con mayor abundancia relativa fue Tomentella sp. (M1), presente en más de 30% de las puntas de raíz micorrizadas, especialmente en la localidad de Cieneguilla (Fig. 3) y los de menor abundancia fueron Wilcoxina sp. (M31) y Cenococcum geophilum Fr. (M32), presentes en el 0.2% de las raíces muestreadas, de manera exclusiva en la localidad de Cieneguilla (Fig. 3).

Figura 3: Abundancia de los morfotipos ectomicorrízicos (M) identificados en poblaciones naturales de Pinus greggii Engelm. ex Parl. var. australis Donahue & López de Zacualpan, Veracruz y Cieneguilla, Hidalgo, México. 

Dinámica de micorrización y colonización de raíces en vivero

El porcentaje de plantas micorrizadas fue afectado (p≤0.05) por el origen de la semilla y del inóculo, pero no existió interacción significativa entre los dos factores. La edad de la planta también afectó el porcentaje de micorrización (Cuadro 2). Durante los primeros ocho meses, las plantas procedentes de Cieneguilla, y con inóculo de la localidad antes mencionada, mostraron un mayor porcentaje de micorrización que las plantas con inóculo de Zacualpan, aunque a los 12 meses de edad las plantas inoculadas con las dos fuentes de inóculo ECM alcanzaron 100% de plantas micorrizadas (Fig. 4A). Así mismo, las plantas de Cieneguilla presentaron mayor porcentaje de micorrización que las de Zacualpan hasta los ocho meses de edad, pero a los 12 meses se igualaron con 100% de plantas micorrizadas (Fig. 4B).

Figura 4: Dinámica del porcentaje de plantas ectomicorrizadas (ECM) de Pinus greggii Engelm. ex Parl. var. australis Donahue & López a diferentes edades por el efecto de (A) origen de la comunidad ECM y (B) la procedencia de la semilla. Los triángulos negros representan los valores promedios de Zacualpan y los círculos vacíos los de Cieneguilla, y las líneas verticales por encima y por debajo de cada uno de ellos corresponden al error estándar de la media; n=30 por edad en cada tratamiento. Letras distintas a una misma edad indican diferencias significativas (p<0.05) entre orígenes de las comunidades ectomicorrízicas con base en la prueba de comparación de medias de Tukey. 

Por otro lado, se encontró un efecto significativo (p≤0.05) de la edad de la planta y de su interacción con el origen de la comunidad ECM en el porcentaje de raíces colonizadas (Cuadro 2), lo cual implica que el origen de la comunidad ECM afectó la dinámica de colonización de las raíces durante el periodo de estudio. Sin embargo, no hubo un efecto significativo de la interacción comunidad ECM por procedencia de semilla. El inóculo procedente de Cieneguilla mostró una mayor velocidad de colonización de raíces que el de Zacualpan en los primeros ocho meses; sin embargo, a los 12 meses la velocidad de colonización del inóculo de Zacualpan superó al de Cieneguilla, con valores de 61.8% y 41.8% de raíces colonizadas, respectivamente (Fig. 5).

Figura 5: Porcentaje de raíces colonizadas en plantas de Pinus greggii Engelm. ex Parl. var. australis Donahue & López de diferentes edades crecidas en inóculos ECM con comunidades alopátricas o simpátricas recolectados en dos poblaciones naturales. Los triángulos negros representan los valores promedios de Zacualpan y los círculos vacíos los de Cieneguilla, y las líneas verticales por encima y por debajo de cada símbolo corresponden al error estándar de la media; n=30 por edad en cada tratamiento. Letras distintas a una misma edad indican diferencias significativas (p<0.05) entre orígenes de las comunidades ectomicorrízicas con base en la prueba de comparación de medias de Tukey. 

Diversidad y diferenciación de morfotipos en plantas del bioensayo

En las plantas del bioensayo se identificaron en total ocho morfotipos distintos, cuatro de los cuales (M1, M22, M24 y M32) estaban presentes en las comunidades ECM de las poblaciones naturales de P. greggii var. australis, mientras que los cuatro restantes fueron categorizados como nuevos, con los códigos M33-M36 (Fig. S1); el morfotipo M33 se identificó como Rhizopogon sp.

La presencia y abundancia de los morfotipos varió con la edad de la planta. A los cuatro y seis meses predominaron los morfotipos M32 (Cenoccocum geophilum) y M22 en todas las combinaciones origen de inóculo-origen de semilla, pero a partir de los ocho meses fue más abundante el morfotipo M33 (Rhizopogon sp.) (Fig. 6). El morfotipo de Tomentella sp. (M1) fue más abundante en las plantas procedentes de Cieneguilla, mientras que el morfotipo M22 fue más común en las de Zacualpan, especialmente cuando se utilizó el inóculo de Cieneguilla. Los morfotipos restantes (M24, M32, M34, M35 y M36) tuvieron una frecuencia baja en todas las combinaciones origen de inóculo-origen de semilla a partir de los seis meses.

Debido a los cambios en la abundancia de morfotipos en las raíces colonizadas, la diversidad α se redujo con la edad en todos los ambientes de 0.83 a los ocho meses a 0.50 a los 12 meses (Cuadro 3). El efecto del origen del inóculo y de la semilla fue más notorio a los 12 meses, con mayor índice de diversidad asociado a la comunidad ECM de Cieneguilla (0.75±0.01) que de Zacualpan (0.23±0.01), al igual que en el caso del origen de la semilla (0.56±0.01 vs. 0.46±0.01). También se encontró un efecto significativo de la interacción sustrato-semilla (i.e., origen del inóculo por origen de la semilla) en la diversidad de morfotipos en las raíces colonizadas, con una mayor diversidad en las asociaciones simpátricas que en las alopátricas a los ocho meses (0.92±0.01 vs. 0.72±0.02), pero a la inversa a los 12 meses (0.44±0.01 vs. 0.59±0.01) (Cuadro 3).

La diferenciación de las comunidades ECM en las raíces colonizadas también se redujo con la edad de la planta (Cuadro 4). En relación con el origen del inóculo (comunidad ECM), el índice de similitud aumentó de 0.69 a los ocho meses a 0.83 a los 12 meses y en relación con el origen de la semilla, de 0.50 a 0.91. Algo similar ocurrió al comparar las asociaciones simpátricas y alopátricas, en donde el índice de similitud aumentó de 0.49 a 0.94 entre los ocho y 12 meses de edad de las plantas.

Diversidad y diferenciación de la comunidad de HECM en poblaciones naturales

El comportamiento asintótico de las curvas de rarefacción y el traslape de sus intervalos de confianza indican que el esfuerzo de muestreo fue suficiente (^{Ding et al., 2011}; ^{Huang et al., 2012}) en las dos poblaciones y que no existen diferencias significativas entre las localidades (^{Reverchon et al., 2012}) en el número estimado de morfotipos. El número de morfotipos y los índices de diversidad encontrados en estas poblaciones naturales de Pinus greggii var. australis son diferentes a los registrados en poblaciones naturales de otras especies de Pinus L., como P. patula Schiede ex Schltdl. & Cham. (^{Baeza-Guzmán et al., 2021}), P. montezumae Lamb. (^{Reverchon et al., 2012}) y P. massoniana Antonio Turra (^{Huang et al., 2012}), lo cual reafirma la importancia del factor “ambiente” (p. ej., las condiciones bióticas, incluyendo el hospedero, y abióticas del sitio), en la expresión y aptitud de los morfotipos de ectomicorrízas (^{Hoeksema et al., 2012}; ^{Craig et al., 2016}; ^{Rúa et al., 2018}).

Sin embargo, se observaron diferencias significativas en el índice de diversidad de morfotipos de ECM en las dos poblaciones naturales, con una mayor diversidad en la población de Zacualpan; además, se encontró un elevado grado de diferenciación entre ellas, con 75% de morfotipos exclusivos en una u otra población, resultado posiblemente de la divergencia ambiental y aislamiento geográfico de estas poblaciones de P. greggii var. australis, como se ha demostrado en P. radiata y en otras especies de coníferas (^{Hoeksema et al., 2012}).

Las diferencias climáticas como precipitación y temperatura (^{Ishida et al., 2007}; ^{Craig et al., 2016}; ^{Rosinger et al., 2018}), tipo y estado nutrimental de suelo (^{Ishida et al., 2007}), pH (^{Goldmann et al., 2015}), humedad (^{Rosinger et al., 2018}), relación carbono/nitrógeno (C/N) (^{Goldmann et al., 2015}), calidad y profundidad de hojarasca (^{Ishida et al., 2007}; ^{Craig et al., 2016}), y los niveles de luz ambiental (^{Craig et al., 2016}), pueden influir en la diversidad y diferenciación de la estructura de comunidades de ECM de las poblaciones de P. greggii, como lo indican los resultados de estudios previos en ésta y otras especies de coníferas (^{Hoeksema et al., 2012}; ^{Rosinger et al., 2018}; ^{Casique-Valdés et al., 2020}). En el estudio de ^{Casique-Valdés et al. (2020)}, por ejemplo, se encontraron diferencias en la estructura y composición de la comunidad de ECM de P. greggii var. greggii con respecto a otros bosques de coníferas neotropicales; dichas diferencias se atribuyen a su posible adaptación a ambientes áridos. Al parecer, las condiciones de mayor precipitación, humedad y fertilidad del suelo en la localidad de Zacualpan conllevan a una mayor diversidad de morfotipos (^{Castaño et al., 2018}), lo cual confiere ventaja en bosques maduros, donde existen condiciones competitivas (^{Ishida et al., 2007}). Por otro lado, la menor diversidad de morfotipos en un sitio como Cieneguilla, con condiciones ambientales más restrictivas, especialmente en términos de humedad, temperatura y calidad del suelo, pudiera estar reflejando condiciones de estrés y una mayor presión de selección en la comunidad ECM, que conduce a la predominancia de un menor número de morfotipos.

Los diferentes factores y presiones de selección en las dos localidades también ayudan a explicar la diferenciación encontrada en las dos comunidades de ECM naturales, mayor a la encontrada por ^{Reverchon et al. (2012)} en poblaciones naturales de Pinus montezumae. En este caso, la diferenciación de las comunidades ECM pudiera estar asociada a una respuesta adaptativa de las especies de hongos a las condiciones del sitio y/o características del hospedero (^{Ding et al., 2011}; ^{Casique-Valdés et al., 2018}).

Colonización de raíces por la comunidad de HECM en plantas de vivero

La mayor velocidad de colonización de raíces y micorrización de plantas por efecto de la comunidad de ECM y procedencia de la semilla de Cieneguilla en los primeros ocho meses del bioensayo refleja diferencias adaptativas de la comunidad de ECM, asociadas con las condiciones ambientales de las localidades. Es común que en sitios con ambientes limitantes las especies desarrollen como mecanismos de supervivencia estrategias de tipo ruderal para colonizar el área (^{Ding et al., 2011}; ^{Lofgren et al., 2018}). La mayor velocidad de colonización de la comunidad de ECM de Cieneguilla se asocia con la capacidad de invasión que poseen algunas especies para colonizar plántulas a partir de hifas (^{Peay et al., 2010}; ^{Ding et al., 2011}). Este es uno de los aspectos relevantes del estudio, ya que a diferencia de otros ensayos con ectomicorrizas en vivero en los que se estima el porcentaje de colonización en una sola evaluación (^{Martínez-Reyes et al., 2012}; ^{Barroetaveña et al., 2016}; ^{Rodríguez-Gutiérrez et al., 2019}), este trabajo aporta información sobre la dinámica de colonización y diferencias adaptativas de las especies presentes en diferentes comunidades ectomicorrízicas asociadas a Pinus greggii.

Sin embargo, la velocidad de colonización y micorrización de la comunidad de ECM de Zacualpan aumentó rápidamente después de los ocho meses. Este comportamiento se asocia con el aumento en biomasa del hospedero, lo cual le permite tener una mayor inversión de carbono para establecer simbiosis con especies fúngicas de exploración larga, que son características de sitios húmedos como Zacualpan (^{Castaño et al., 2018}). Esas especies pueden estar presentes dentro del banco de inóculo de ECM en forma de estructuras de resistencia como esporas, micelio, o esclerocios, y no necesariamente como morfotipos.

Diversidad y diferenciación de la comunidad de HECM en plantas de vivero

Generalmente, el ambiente abiótico suele ser un factor que influye en la interacción huésped (GHu) × hospedero (GHo), situación que se manifestó en la diversidad y diferenciación de las comunidades de ECM en las poblaciones naturales muestreadas. Sin embargo, las plantas en el bioensayo fueron sometidas a las mismas condiciones ambientales; en particular de temperatura y disponibilidad de agua en el suelo. Es posible, por lo tanto, que estas condiciones ambientales similares moldearan la interacción fitobionte-micobionte (^{Ishida, et al., 2007}) en el bioensayo, modificando el efecto del origen del huésped y hospedero en la diversidad y diferenciación de la comunidad de ECM detectada en las plantas de Pinus greggii en el vivero.

Durante los primeros meses del bioensayo se observaron principalmente morfotipos registrados en poblaciones naturales, lo cual se ha documentado en otros estudios (^{Huang et al., 2012}; ^{Reverchon et al., 2012}; ^{Baeza-Guzmán et al., 2021}). Eso indica un efecto de la presencia y frecuencia de especies ectomicorrizógenas, en forma de hifas en el inóculo, que fácilmente se propagan y colonizan nuevas raíces. La alta frecuencia de Cenoccocum geophilum (M32) y del morfotipo de una especie no identificada (M22) en todas las combinaciones inóculo-semilla refleja la naturaleza de estos morfotipos como especies de estadio temprano por su capacidad de colonizar rápidamente al hospedero (^{Bahram et al., 2013}; ^{Almaraz-Llamas et al., 2019}). La presencia de nuevos morfotipos de estadio tardío a partir de los ocho meses, como Rhizopogon sp. (M33), marca una etapa de surgimiento de especies provenientes de la comunidad de propágulos resistentes (CPR) (^{Kjøller y Bruns, 2003}). Estos morfotipos no fueron detectados en las muestras de raíces micorrizadas recolectadas en las poblaciones naturales, debido a que se encontraban formando parte del banco de inóculo como estructuras de resistencia como ha sido reportado en estudios previos (^{Rusca et al., 2006}; ^{Bahram et al., 2013}).

La mayor abundancia de Tomentella sp. (M1) en plantas de Cieneguilla se relaciona con la capacidad de la especie a ser pionera o de estadío temprano, en sitios limitantes como el de esa localidad (^{Casique-Valdés et al., 2018}). Por otro lado, la mayor abundancia de un morfotipo de una especie no identificada (M22) en plantas de Zacualpan pudiera ser una estrategia del hospedero para establecer simbiosis micorrízica sin invertir grandes cantidades de carbono. A pesar de que se desconoce la identidad de M22, su color oscuro asociado a una elevada concentración de melanina (^{Almaraz-Llamas et al., 2019}) se relaciona con una menor necesidad de C (^{Casique-Valdés et al., 2018}; ^{Castaño et al., 2018}). La dinámica de reemplazo de los morfotipos de Tomentella sp. (M1) y de la especie no identificada (M22), presentes en los primeros meses de crecimiento, por los morfotipos de Cenoccocum geophilum (M32) y de especies no identificadas M24, M34, M35 y M36, a partir de los seis meses, es consecuencia de la etapa de sucesión de las especies fúngicas (^{Ishida et al., 2007}; Castaño et al., 2018), posiblemente por el desarrollo de la planta (^{Dejene et al., 2017}). Dicho proceso se ha atribuido a un cambio en la disponibilidad de N y P (^{Baeza-Guzmán et al., 2021}) o a la modificación en la relación C/N (^{Castaño et al., 2018}).

Los índices de diversidad en plantas de vivero de P. greggii var. australis son similares a los registrados en estudios previos en otras especies de pino, como en P. patula (^{Baeza-Guzmán et al., 2021}) y P. mugo Turra (^{Huang et al., 2012}). La mayor diversidad asociada al origen Cieneguilla, al comparar el origen del huésped (ECM) y del hospedero a los 12 meses, pudiera deberse a una mayor plasticidad que poseen algunas especies fúngicas y vegetales por establecerse naturalmente en sitios restrictivos (^{Almaraz-Llamas et al., 2019}; ^{Reyes-Matamoros y Martínez-Moreno, 2001}).

A los ocho meses las asociaciones simpátricas huésped/hospedero presentaron mayor diversidad de ECM que las alopátricas, con una diferenciación moderada (índice de similitud de 0.49). Estos datos proporcionan indicios de una predisposición genética a asociarse con los huéspedes de su ambiente nativo (^{Huang et al., 2012}), que refleja la presencia de procesos coevolutivos que pueden conducir a mecanismos de adaptación local (^{Rúa et al., 2018}; ^{Rodríguez-Gutiérrez et al., 2019}). Sin embargo, la reducción de la diversidad y diferenciación a los 12 meses permite observar un efecto del ambiente del bioensayo en la interacción huésped/hospedero (GHue × GHo × A) en relación con el origen de ambos y su relación simpátrica o alopátrica.

Las condiciones del bioensayo permitieron observar dos etapas en la dinámica de la asociación micorrízica con cambios en la diversidad y diferenciación de las comunidades de ECM. En la primera etapa se manifestó un cierto grado de adaptación del huésped al hospedero local, con una mayor diversidad promedio (indicios de mayor afinidad) en las asociaciones simpátricas que alopátricas. En la segunda etapa, después de los ocho meses, se observó un proceso de aclimatación y homogeneización al ambiente de crecimiento en el bioensayo, que redujo la diversidad global y la diferenciación de las comunidades de ECM en las asociaciones simpátricas y alopátricas. Por lo tanto, al paso del tiempo las comunidades de ECM podrían tener la capacidad de expresarse como morfotipos, como consecuencia de modificaciones ambientales. Sin embargo, las condiciones adversas que propicia el cambio climático podrían reducir la diversidad de ECM y posiblemente especies fúngicas de importancia ecológica para los bosques podrían reducir su frecuencia e incluso desaparecer.