Artículo científico

 

Razas patogénicas de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris en garbanzo cultivado en Guanajuato, México

 

Pathogenic races of Fusarium oxysporum f. sp. ciceris in chickpeas grown in Guanajuato state, México

 

Brenda Z. Guerrero-Aguilar¹, Jorge A. Acosta-Gallegos¹, Bertha M. Sánchez-García¹, Pedro F. Ortega-Murrieta² y Mario M. González-Chavira¹*

 

¹ Campo Experimental Bajío, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP). Km. 6.5 Carr. Celaya-San Miguel Allende, A. P. 112. 38110, Celaya, Guanajuato, México. *Autor de correspondencia: gonzalez.mario@inifap.gob.mx

² Campo Experimental Costa de Hermosillo. INIFAP. Blvd. del Bosque No.7 Esq. Paseo de la Pradera, Col. Valle Verde. 83200, Hermosillo, Sonora.

 

Recibido: 9 de Octubre del 2013
Aceptado: 20 de Agosto del 2014

 

RESUMEN

En la región de el Bajío en el centro de México, el rendimiento del garbanzo (Cicer arietinum L.) es limitado por enfermedades de la raíz como la marchitez vascular causada Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (FOC). El conocimiento de las razas existentes de este patógeno permitirá usar los cultivares resistentes apropiados. El objetivo fue identificar las razas de FOC existentes en El Bajío, estado de Guanajuato por medio de marcadores moleculares específicos. Se analizaron aislados provenientes de cinco municipios productores de garbanzo (Celaya, Salvatierra, Valle de Santiago, Huanímaro y Pénjamo). Se probaron 12 iniciadores, siete de secuencia arbitraria tipo RAPD (OP1-01, OPI-09, OPI-18, OPF-06, OPF-10, OPF-12 y OPF-16) asociados a las razas 0, 1A, 1B/C, 2, 3, 4, 5 y 6 de F. oxysporum f. sp. ciceris, y cinco de secuencia tipo SCAR (FocR0-M15, FocR1B/C-N5, FocR5-L10, FocR6-O2, FocR6-P18-FocR0-M15), procedentes de los fragmentos marcadores raciales tipo RAPD inicialmente identificados. Los marcadores señalaron la presencia de cuatro razas: 0, 1B/C, 4 y 6, de FOC; las razas de mayor frecuencia fueron la 0 y 1B/C, que inducen el síntoma de "amarillamiento", y la raza 6 que induce el síntoma de marchitez. Con las razas identificadas en Guanajuato y la raza 5 aislada en el estado de Sinaloa, se realizó una prueba de patogenicidad sobre las líneas diferenciales: JG 62, Sanford, P 2245, CRIL 1-53, CRIL 1-94, CRIL 1-17, CRIL 1-36, y WR 315, por el método de inmersión de raíces. Los resultados de la inoculación verificaron la identificación de razas con los marcadores. Las diferenciales resistentes fueron CRIL 1-36, WR 315, y CRIL 1-17, las que pueden utilizarse como progenitores en el mejoramiento de la resistencia contra FOC en México.

Palabras clave: Cicer arietinum, diversidad patogénica, marcadores moleculares, variedades diferenciales.

 

ABSTRACT

At El Bajío region of Central México, chickpea (Cicer arietinum L.) yields are limited by root rot such as wilt caused by Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (FOC). Knowledge on the prevailing races of this pathogen could guide efforts to use appropriate resistant cultivars. The study identified FOC races present at the El Bajío, Guanajuato State by using specific molecular markers. Isolates from five chickpea producing counties were analyzed (Celaya, Salvatierra, Valle de Santiago, Huanímaro and Pénjamo). Twelve primers were used: seven RAPD-type arbitrary sequences (OP1-01, OPI-09, OPI-18, OPF-06, OPF-10, OPF-12 and OPF-16) associated to races 0, 1A, 1B/C, 2, 3, 4, 5 and 6 of F. oxysporum f. sp. ciceris; and five SCAR-type sequences (FocR0-M15, FocR1B/C-N5, FocR5-L10, FocR6-O2, and FocR6-P18-FocR0-M15) derived from RAPD markers previously identified. Markers showed presence of four FOC races in Guanajuato: 0, 1B/C, 4 and 6. Races 0 and 1B/C that produce the yellowing symptom, and race 6 that induces the wilting symptom, were highly frequent. A pathogenicity test was performed taking one sample from each isolated race, plus a race 5 isolate from Sinaloa State upon the differential genotypes: JG 62, Sanford, P 2245, CRIL 1-53, CRIL 1-94, CRIL 1-17, CRIL 1-36, and WR 315. Infection was promoted by immersion of the root system into liquid inoculum. The results from the inoculation test validated the racial identification made with the specific molecular markers. Since differential cultivars CRIL 1-36, WR 315 and CRIL 1-17 showed to be resistant, they could be used as parental stocks in the breeding of resistant cultivars against FOC in México.

Key words: Cicer arietinum, pathogenic diversity, molecular markers, differential cultivars.

 

INTRODUCCIÓN

En México la producción de garbanzo (Cicer arietinum L.) se lleva a cabo en dos regiones, el Noroeste (Sinaloa, Sonora y Baja California Sur) donde se produce garbanzo blanco o "kabuli" que se destina para exportación, con grano color blanco cremoso a blanco lechoso y calibre grande (60 a 80 g en 100 semillas), y en El Bajío (áreas de Jalisco, Michoacán y Guanajuato), en donde se produce ambos tipos, el blanco para grano o consumo en fresco y el forrajero o tipo "desi" de color café y de menor tamaño (15 a 30 g en 100 semillas), este último dedicado a la alimentación de ganado porcino, aves y bovino.

Las enfermedades que causan pérdidas en la producción de garbanzo son las pudriciones de raíz, y entre ellas la más importante es la fusariosis o marchitez vascular, ocasionada principalmente por Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (FOC). La pudrición de raíz es una enfermedad de etiología compleja ya que puede haber diversos agentes causales involucrados. Según Trapero-Casas y Jiménez-Díaz (1985a), la fusariosis vascular causada por FOC se caracteriza por dos síntomas distinguibles "marchitez vascular" y "amarillamiento vascular". Ambos síntomas son consecuencia de infecciones vasculares en la planta que llevan asociada una coloración castaño oscuro del xilema, y ocasionalmente de la médula de la raíz, cuello y tallo de las plantas infectadas (Trapero-Casas y Jiménez-Díaz, 1985b).

El síntoma de amarillamiento vascular se expresa con más lentitud que el de marchitez vascular y se caracteriza por el desarrollo de clorosis, amarillamiento y necrosis de los foliolos de las hojas inferiores, que dan lugar a la defoliación prematura de éstas. En experimentos en ambiente controlado, las plantas susceptibles generalmente mueren después de transcurridos 40 d después la siembra en un suelo infestado artificialmente (Trapero-Casas y Jiménez -Díaz 1985b). El síntoma de marchitez vascular se caracteriza por el desarrollo rápido de flacidez de las hojas en cualquier nivel de la planta y la desecación de foliolos que adquieren una coloración verde-grisácea, que luego se extiende a toda la planta. La flacidez es seguida por desecación de hojas y tallos, que adquieren un color castaño claro y finalmente se produce la muerte de la planta (Trapero-Casas y Jiménez-Díaz, 1985b). En inoculaciones artificiales, la muerte de plantas susceptibles en suelo infestado ocurre generalmente antes de transcurridos 20 d después de la siembra (Trapero-Casas y Jiménez-Díaz, 1985a).

En un principio las razas de FOC se identificaron con un conjunto de variedades diferenciales (Haware y Nene, 1982; Sharma et al., 2005), posteriormente se desarrolló una forma eficaz para identificarlas por medio de marcadores moleculares específicos. La identificación de las razas de FOC por patogenicidad y severidad ha sido complicada y confusa, por la diversidad de variedades diferenciales utilizadas por diferentes grupos de trabajo, las cuales han variado desde 8 hasta 22 (Haware y Nene, 1982; Phillips 1988; Jiménez-Díaz et al., 1989; Tullu, 1998; Sharma et al., 2005). Otro factor que ha complicado el proceso de determinación de razas es el criterio inconsistente en definir la susceptibilidad y la resistencia. Las escalas de severidad de la enfermedad han utilizado el fenotipo de la resistencia y susceptibilidad para la identificación de las razas, en donde cada autor ha variado considerablemente esas escalas (Cuadro 1).

Por la inconsistencia de las variedades diferenciales y de las escalas de severidad usadas, en los últimos años se ha implementado una herramienta que permite la identificación de las razas de FOC mediante el uso de marcadores de ADN (Jiménez-Gasco y Jiménez Díaz, 2003; Arvayo-Ortiz et al., 2011). Los marcadores utilizados fueron desarrollados a partir de fragmentos tipo RAPD amplificados al azar. Después de su amplificación los fragmentos fueron seleccionados y secuenciados para corroborar la especificidad de las bandas de ADN a las razas 0, 1B/C, 2, 3, 4, 5, y 6. Posteriormente, estas secuencias fueron convertidas a marcadores tipo SCAR (Jiménez-Gasco y Jiménez Díaz, 2003).

El objetivo de este estudio fue identificar las razas de F. oxysporum f. sp. ciceris que afectan el cultivo de garbanzo en el estado de Guanajuato mediante marcadores moleculares tipo RAPD y SCAR, y verificar la patogenicidad de los aislamientos en variedades diferenciales de garbanzo.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

En 2011 y 2012 se hicieron muestreos en campos comerciales y experimentales en cinco municipios de El Bajío Guanajuatense ubicado en los municipios de: Salvatierra, Huanímaro, Valle de Santiago, Pénjamo y Celaya (Cuadro 2). Se muestrearon 21 lotes y se colectaron 10 plantas de garbanzo tomadas al azar con síntomas de marchitamiento y amarillamiento ocasionados por Fusarium sp. para un total de 210 muestras. Las colectas de plantas se hicieron en diferentes etapas de crecimiento, tal como fueron localizadas en los campos. Las coordenadas de los sitios de colecta se determinaron con un posicionador geográfico (Garmin Etrex 20®; Kansas, USA) y la clasificación de suelos se hizo con un mapa de suelos elaborado por el Soil Survey Staff de Estados Unidos de América (Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, USDA).

 

Aislamiento, purificación e identificación de especies de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris

En las plantas colectadas se tomaron muestras de tejido mediante cortes longitudinales de 3 mm de raíz y tallo en donde se observó la lesión necrótica. El tejido obtenido se desinfectó con hipoclorito de sodio 5 % por 1 min y se enjuagó con agua destilada estéril. Se tomaron 5 fragmentos de tejido de raíz y tallo y se colocaron por separado en cajas Petri (90 x 15) con medio agar papa dextrosa (APD) acidificado (200 μL L^-1 de ácido láctico a 85 %), y se incubaron a temperatura ambiente (22 a 25 °C). Los aislados obtenidos se purificaron mediante cultivos monospóricos; para ello se agregó un fragmento de 2 cm de hifas en un microtubo de 1.5 mL con 1 mL de agua destilada estéril, se tomaron 30 μL de la suspensión y con ayuda de una varilla de vidrio se esparció en cajas con medio agua-agar. Se incubaron por un periodo de 24 h a temperatura ambiente (22 a 25 °C). Con un microscopio Leica modelo DME® (Alemania) se observó la germinación de los conidios y se transfirieron tres de ellos a medio APD, donde los cultivos monoconidiales fueron mantenidos en activo y utilizados para llevar acabo la identificación de especie.

Para la identificación de Fusarium a nivel especie los cultivos monoconidiales se sembraron en tres medios de cultivo: Agar Papa Dextrosa (APD), Spezieller Nahrstoffmmarmer (SNA; 1.0 g de KH₂PO₄. 1.0 g de KNO₃, 0.5 g de MgSO₄.7H₂O, 0.5 g de KCl, 0.2 g de glucosa, 0.2 g de sacarosa y 20 g de agar en 1 L de agua destilada) (Nirenberg, 1976) y en hojas de clavel (Dianthus caryophyllus L.) o plátano ( Musa sp.)(CLA; 20 g de agar en 1 L de agua destilada luego se colocaron de cuatro a diez piezas de hojas de clavel estériles en la superficie del medio agua-agar justo antes de que el medio solidificara). Una vez preparados los medios se colocó un fragmento de micelio en cada uno y se incubó a temperatura ambiente. Las colonias crecidas se observaron al microscopio Leica DME® (Alemania) (4X, 10X, 40X), la identificación se basó en las claves de Leslie y Summerell (2006), con base en características como: presencia de color, tasa de crecimiento, micelio aéreo, pigmentación del medio y formación de estructuras fúngicas (macroconidios, microconidios y clamidosporas). Los aislados identificados se conservaron en medio SNA con aceite mineral, a 4.0 °C (Massa 1991).

 

Extracción de ADN de Fusarium f. sp. ciceris

Para la extracción de ADN fúngico se utilizó el método descrito por Raeder y Broda (1985), con ligeras modificaciones. Se colocó un fragmento de micelio de 0.3 cm de los cultivos monospóricos activos sobre una película estéril de celofán extendida sobre una placa del medio APD (Difco ®). Se incubó de 5 a 7 d a temperatura ambiente. Después se raspó con un bisturí estéril y se procedió a la extracción de ADN.

La identificación de razas se hizo mediante la amplificación de ADN genómico de cada uno de los aislados, con marcadores específicos para cada raza (Cuadro 3). Para ello se estandarizaron las condiciones de la reacción de PCR, mediante la determinación de las temperaturas óptimas para la amplificación del ADN con cada marcador, las cuales se presentan en una columna de cada cuadro.

La mezcla de reacción fue de 25 μL, preparada con 5 μM de iniciador, 2.5 μM dNTP, 10X amortiguador de reacción (50 μM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 9.0 [25 °C]) 1U de Taq ADN polimerasa; 1.5 mM de MgCl , y 45 ng de ADN genómico fúngico. Los ciclos para el PCR² de los iniciadores OPF y OPI fueron: 4 min a 94 °C, 30 ciclos de 1 min a 94 °C, 1 min a 40 °C, y 3 min a 72 °C; un ciclo final de 7 min a 72 °C. Para los iniciadores Foc: 2 min a 94 °C, 25 ó 28 ciclos de 30 s a 94 °C, 1 min a Tm, 30 s a 72 °C, un ciclo final de 4 min a 72 °C. El ciclo de PCR touch-down (Don et al., 1991) estuvo compuesto por: 2 min de 94 °C, 10 ciclos a [30 s a 94 °C, 1 min a 71 °C - 61 °C, 30 s a 72 °C] + 15ciclos [30 s a 94 °C, 1 min a 61 °C, 30 s a 72 °C] y 4 min de extensión final a 72 °C.

 

Pruebas de patogenicidad

Material biológico. Se seleccionaron al azar tres aislados de diferentes razas de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris, identificadas por medio de marcadores moleculares, provenientes de las localidades de Valle de Santiago Foc12 (Raza 6) que ocasiona síntomas de marchitez, de Salvatierra Foc27 (Raza 1B/C) y de Pénjamo Foc71 (Raza 0) que ocasionan síntomas de amarillamiento. Se inocularon en ocho variedades diferenciales de garbanzo utilizadas por Sharma y Muehbauer (2007), JG 62, Stanford, P 2245, CRIL 1-53, CRIL 1-94, CRIL 1-17, CRIL 1-36 y WR 315.

Preparación del inoculo. La producción de inoculo se hizo a partir de las colonias almacenadas en medio SNA. Se transfirió un fragmento de cada colonia a cajas Petri con medio agar papa dextrosa acidificado (200 μL L^-1 de ácido láctico a 85 %) y se mantuvieron a temperatura ambiente (25 °C) por un periodo de 10 d. Se obtuvo la suspensión de conidios de cada aislado y con la ayuda de un hematocímetro Neubauer® improved, Marienfeld (Alemania) se registró una concentración de 1 x 10⁶ conidios mL^-1. Esta concentración de inoculación ha sido utilizada previamente por Tekeoglu et al. (2000) y Sharma et al. (2004) en garbanzo.

Inoculación. En condiciones de invernadero se sembraron siete semillas de cada una de las diferenciales en macetas de plástico (61 x 19 x 17cm) llenadas con sustrato "peat moss" Sunshine mezcla 3. Las plantas desarrolladas se inocularon en la fase vegetativa V3 (23 a 30 d). Para la prueba de inoculación se utilizó el método de inmersión de raíces (Trapero-Casas y Jiménez Díaz, 1985a; Sharma et al., 2005) que consiste en sacar cuidadosamente las plantas evitando dañar las raíces. Se cortaron 2 cm aproximadamente de las puntas de las raíces y se sumergieron en la suspensión de 1 x 10⁶ conidios mL^-1 durante 10 min. Las plantas inoculadas se sembraron nuevamente en el macetero original.

A los 20 d después de la inoculación (DDI) las plantas se evaluaron con la escala visual de daño descrita por Schoonhoven y Pastor-Corrales (1987). Se utilizó esta escala por su simplicidad y sencillez, además de tener un porcentaje específico de síntomas o de daño que corresponde a un número fijo en la escala, por lo que a cada número corresponde una descripción exclusiva y precisa. La escala utiliza un rango de calificación de 1 = sin síntomas aparentes de la enfermedad, hasta 9 = síntomas severos o muerte. En este trabajo se consideraron los valores de 1 a 3 como reacción resistente, los de 4 a 6 como reacción intermedia y los de 7 a 9 como reacción susceptible (Cuadro 4).

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Razas de F. oxysporum identificadas

De los 12 iniciadores probados para la identificación de razas, solamente siete amplificaron los fragmentos reportados por Jiménez-Gasco y Jiménez Díaz (2003); los cinco restantes no amplificaron ningún fragmento a pesar de utilizar las mismas condiciones reportadas. Esto pudo ser debido a la variación en los reactivos y el tipo de termociclador utilizados para la reacción de PCR. Por ello se utilizaron diferentes iniciadores que identificaban las mismas razas lo cual permitió su caracterización (Cuadro 3).

Se consideró que fragmentos de ADN genómico amplificados con la misma movilidad (peso molecular) correspondían al fragmento esperado, de acuerdo con Jiménez-Gasco y Jiménez Díaz (2003). Los amplicones obtenidos correspondieron sin ambigüedades a los tamaños esperados para las razas de FOC reportados por Jiménez-Gasco y Jiménez Díaz (2003). Así, el análisis con marcadores moleculares específicos identificó 33 aislados con el fragmento de 900 pb correspondiente a la raza 0, y 38 con el fragmento de 500 pb de la raza 1B/C, razas que inducen el síntoma de amarillamiento (Trapero-Casas y Jiménez-Díaz, 1985b). Además, los resultados señalaron a 22 aislados con el fragmento de 1000 pb de la raza 6, y seis aislados con un fragmento de 950 pb correspondiente a la de la raza 4, las cuales son causantes del síntoma de marchitez.

Las razas 0 y 1B/C se encontraron en los cinco municipios muestreados en el estado de Guanajuato: Pénjamo, Huanímaro, Salvatierra, Valle de Santiago y Celaya; esto sugiere que son las razas de mayor distribución en el estado y probablemente en estados vecinos que también producen garbanzo en localidades con clima similar, como el norte de Michoacán y centro y noreste de Jalisco (Soltero, et al., 2008). La raza 0 mostró alta frecuencia en campos cultivados con garbanzo en Sinaloa y Sonora, 41 % en 91 aislados (Arvayo-Ortiz et al., 2012). La alta presencia de esta raza en Guanajuato podría tener relación con la gran cantidad de semilla o grano que se utiliza como semilla de la variedad Blanco Sinaloa 92, susceptible a esa raza (Arvayo-Ortiz et al., 2012), semilla que se introduce al estado de Guanajuato desde la región Noroeste: Sinaloa, Sonora y Baja California Sur.

La raza 6 se ubicó en cuatro municipalidades: Salvatierra, Valle de Santiago, Pénjamo y Celaya. La raza 4 que es la primera vez que se reporta en Guanajuato estuvo presente en tres municipios: Salvatierra, Pénjamo y Celaya. La raza 5 reportada como la más agresiva a nivel mundial (Jiménez-Gasco et al., 2001) y que es la que ha ocasionado más pérdidas en este cultivo en los estados de Sonora y Sinaloa (Arvayo-Ortiz et al., 2012), no se identificó en el estado de Guanajuato, mientras que las razas 1B/C y 6 se encuentran en ambas regiones, El Bajío y el Noroeste (Arvayo-Ortiz et al., 2012). Las razas 1A, 2 y 3 no están presentes en el estado (Cuadro 5).

Los resultados anteriores indican que los marcadores de ADN específicos son una buena herramienta de apoyo para la detección temprana de la posible introducción de nuevas razas, así como para la identificación de los cambios que puedan ocurrir en las poblaciones existentes de FOC en respuesta al uso de cultivares de garbanzo resistentes a las razas prevalecientes en el estado; esto es acorde con la abundante diversidad molecular observada entre las poblaciones de FOC (Sivaramakrishnan et al., 2002).

 

Inoculación de las variedades diferenciales

La reacción de las diferenciales JG 62, P 2245 y W 315, coinciden con lo reportado para los aislados de la raza 0, 1B/C y 6 (Jiménez-Fernández, 2011). Estos resultados de patogenicidad confirman los resultados moleculares, similares a los obtenidos por Jiménez-Fernández et al. (2011).

En cuanto a las fuentes de resistencia, las variedades diferenciales CRIL 1-17 y WR 315 resultaron resistentes a todas las razas inoculadas, que incluyen a la raza 5 (dato no mostrado), resultados similares a los de Sharma et al. (2005). En cambio JG 62 fue altamente susceptible a todas las razas de F.oxysporum f. sp. ciceris excepto a la raza 0; P 2245 y CRIL 1-94 fueron altamente susceptibles a todas las razas en estudio, Sanford fue susceptible a la raza 5 e intermedia a las otras tres razas; la diferencial CRIL 1-53 fue resistente a la raza 0 e intermedia a las otras tres razas.

Para el mejoramiento genético de la resistencia a FOC, las diferenciales WR 315, CRIL 1-17 y CRIL 1-36 pueden utilizarse para derivar progenies resistentes para ambas regiones, El Bajío Guanajuatense y las áreas productoras de Sinaloa. WR 315 es de grano café, tipo forrajero (desi), mientras que las líneas CRIL son de tamaño de grano medio color cremoso (kabuli). Es probable que el uso de estas últimas permita la recuperación del tipo de grano blanco cremoso con mayor facilidad que al utilizar WR 315; en ambos casos, el uso de retrocruzas sería recomendado (Fehr, 1987) para la recuperación de la mayoría de las características ventajosas de variedades y materiales avanzados en el programa de mejoramiento del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP)(Cuadro 6).

 

CONCLUSIONES

Por medio de marcadores moleculares de ADN se identificaron cuatro razas de FOC que atacan al garbanzo en el estado de Guanajuato (0, 1B/C, 6 y 4). La reacción de patogenicidad con las variedades diferenciales confirmaron los resultados obtenidos con los marcadores moleculares.

Las razas predominantes en los cinco municipios muestreados fueron la 0 y la 1B/C que inducen el síndrome de amarillez vascular; las razas 4 y 6 que causan el síndrome de marchitez vascular, fueron identificadas en menor proporción. Los municipios Pénjamo, Salvatierra y Celaya mostraron mayor número de razas de FOC.

 

AGRADECIMIENTOS

Al Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias por el apoyo económico para conducir la investigación: "Desarrollo de líneas resistentes al complejo de pudriciones radiculares en garbanzo, con énfasis en Fusarium oxysporum f. sp. ciceris".

 

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