Fuente de semillas y desinfección

Las semillas se extrajeron de cápsulas maduras colectadas de poblaciones silvestres ubicadas en el parque estatal de la Sierra del estado de Tabasco, México; éstas se lavaron con detergente comercial por 5 min y se enjuagaron con agua de la llave y agua destilada estéril. Después, se sumergieron en hipoclorito de sodio comercial Cloralex® (NaOCl 30 % v/v) y Tween 20® (Sigma-Aldrich, 0.05 % v/v) durante 15 min y enseguida se enjuagaron cinco veces con agua destilada esterilizada. Posteriormente, las semillas se sumergieron en Captan (N-triclorometiltio-4-ciclohexeno-1,2 dicarboximida, 1 g L^-1) durante 10 min y nuevamente se enjuagaron cinco veces con agua destilada esterilizada.

Medio de cultivo y condiciones de incubación

El medio de cultivo empleado en la germinación, inducción, alargamiento y enraizamiento de los brotes fue el de ^{Murashige y Skoog (MS) (1962)} con las sales inorgánicas completas, suplementado con sacarosa (30 g L^-1), glicina (2 mg L^-1), mio-inositol (100 mg L^-1), ácido nicotínico (0.5 mg L^-1), piridoxina (0.5 mg L^-1), tiamina (0.1 mg L^-1) y agar-agar (Merck®, 7 g L^-1). El pH del medio se ajustó a 5.7 con NaOH o HCl 1N y se esterilizó en una autoclave vertical (FELISA®, Modelo FE-405, México) a 121 ºC y 1.5 kg cm^-2 de presión por 20 min. Los cultivos se mantuvieron a 25 ± 2 ºC, 16 h de luz e intensidad luminosa de 45 µmol m^-2 s^-1.

Germinación in vitro y crecimiento de plántulas

Las semillas se sembraron en frascos de vidrio de 45 mL de capacidad con 15 mL de medio de cultivo MS completo o a la mitad de su concentración de sales minerales, sin y con carbón activado (0.5 g L^-1); cuatro semanas después de la siembra se contabilizó el porcentaje de semillas germinadas. Para promover el crecimiento de las plántulas se hicieron subcultivos a los mismos medios de cultivo cada cuatro semanas, y a las 12 semanas se midió la altura de las plántulas y el número de raíces. El experimento se condujo en un diseño completamente al azar con 10 repeticiones y la unidad experimental consistió en un frasco con 20 semillas.

Viabilidad de semillas

Las semillas se colocaron en sobres de papel manila y se conservaron a temperatura ambiente (26 ± 1 ºC) o en refrigeración (10 ºC) durante dos años; después de 3, 6, 9, 12, 18 y 24 meses, lotes de 200 semillas se sembraron en el mejor medio de cultivo obtenido en la etapa de germinación; 20 semillas se colocaron en cada frasco y su germinación (porcentaje) se evaluó después de 30 d.

Regeneración vía organogénesis

Inducción de brotes

Plántulas de 12 semanas germinadas in vitro con longitud de 1 a 1.5 cm se colocaron en frascos de vidrio de 90 mL de capacidad que contenían 30 mL de medio MS completo adicionado con 6-bencilaminopurina (BAP; 5, 10 y 15 µM) y ácido α-naftalenacético (ANA; 1 y 2 µM); subcultivos a medio fresco se hicieron cada seis semanas. A las 12 semanas se cuantificó el número de explantes que generaron brotes, el número de brotes por explante y la longitud de brote (cm). Se usó un diseño experimental completamente al azar con 10 repeticiones y la unidad experimental consistió en un frasco con tres plántulas.

Multiplicación de brotes

Para promover la multiplicación se seleccionaron 60 brotes de 1.5 a 2 cm de longitud y se establecieron en la mejor combinación de BAP y ANA resultante de la fase de inducción. En cada frasco con medio de cultivo se establecieron tres brotes y durante dos ciclos de cultivo de ocho semanas se cuantificó el número de brotes por explante al final de cada ciclo.

Alargamiento y enraizamiento de plantas

Brotes de 3.0 cm de longitud se transfirieron a medio MS completo o a la mitad de su concentración de sales minerales, sin y con 1 µM de ácido giberélico (AG₃). Después de 12 semanas se cuantificó el enraizamiento (%), número de raíces y altura de las plantas (cm). El diseño experimental fue completamente al azar con 10 repeticiones; la unidad experimental fue una planta por frasco.

Aclimatación de plantas

Plantas de 6.0 cm de altura se colocaron en macetas de 0.5 L con fibra de coco (Cocos nucifera), corteza y una mezcla de turba (peat moss) y perlita (1:1). Las plantas se mantuvieron en condiciones de invernadero por ocho semanas a 26 ºC y se regaron cada tercer día con las sales MS a la mitad de su concentración, para posteriormente evaluar su supervivencia (%). Se usó un diseño experimental completamente al azar con 30 repeticiones y la unidad experimental fue una planta.

Análisis estadístico

Los datos obtenidos en cada experimento se sometieron a análisis de varianza con el paquete estadístico SAS (^{SAS Institute, 2003}) y la prueba de Tukey (P ≤ 0.05) se usó para la comparación de medias. Los valores de porcentaje se transformaron mediante la raíz cuadrada.

Germinación in vitro

La composición del medio de cultivo afectó significativamente la altura de las plántulas, número de raíces y longitud de las mismas. No se detectaron diferencias significativas entre tratamientos para la germinación, mientras que el crecimiento de las plántulas fue mayor en el medio MS con las sales completas. En cuanto al número de raíces, éste fue favorecido por el medio MS a la mitad de la concentración de sales con o sin carbón activado, y su longitud por el medio MS a la mitad de su concentración con carbón activado (Cuadro 1).

La germinación, considerada como la emergencia de la radícula, se presentó después de 7 d de cultivo en todos los tratamientos (Figura 1a) y a las ocho semanas se observaron las primeras hojas (Figura 1b). La propagación por semillas es el método más viable de reproducción de bromelias en condiciones naturales; sin embargo, aunque se ha reportado que las semillas no enfrentan mayores problemas para la germinación (^{Benzing, 2000}), la proporción de plántulas que alcanza el estado adulto regularmente es limitada.

Para la germinación in vitro de bromelias se ha probado con éxito el medio de cultivo C de Knudson (^{Knudson, 1946}) y sus modificaciones (^{Mercier y Kerbauy, 1992}; ^{Pickens et al., 2003}); sin embargo, los mejores resultados se han alcanzado con el medio MS, ya sea con las sales completas o a la mitad de su concentración (^{Guerra y Dal Vesco, 2010}). El porcentaje de germinación de las semillas de V. heliconioides en el medio MS fue alto, tanto con la concentración completa del medio MS como al 50 % de sales. En contraste, las semillas de V. gigantea y V. philippocoburgii germinaron en el medio MS con las sales completas, pero después de algunas semanas las plántulas no prosperaron (^{Droste et al., 2005}). En V. scalaris la baja tasa de germinación obtenida (60 %) también se atribuyó a las sales completas del medio MS (^{Da Silva et al., 2009}).

La germinación de semillas de V. heliconioides en condiciones naturales no está documentada, pero por tratarse de una especie epífita está condicionada a que las semillas se depositen sobre la corteza de árboles, lianas, troncos o grietas de rocas; en el suelo las semillas germinan, pero no prosperan. Si bien una inflorescencia puede producir de 5 a 12 cápsulas con 375 a 420 semillas por cápsula, se desconoce el porcentaje de germinación en su hábitat natural, aunque probablemente es reducido. Por estas razones, la germinación in vitro de semillas de V. heliconioides podría incrementar sustancialmente la cantidad de plantas que alcancen el estado adulto para la recuperación de poblaciones silvestres y su eventual aprovechamiento sustentable.

Viabilidad de las semillas

Las semillas almacenadas por 3, 6, 9, 12, 18 y 24 meses mostraron diferente capacidad para germinar cuando se sembraron en medio MS a la mitad de concentración de sales adicionado con 0.5 g L^-1 de carbón activado. Las semillas almacenadas a 10 ºC mostraron porcentajes de germinación más altos que aquellas conservadas a temperatura ambiente. En las semillas almacenadas a 10 ºC durante un año el porcentaje de germinación se mantuvo entre 98 y 100 %, mientras que, en las almacenadas durante 18 y 24 meses, la germinación se redujo a 95 y 86 %, respectivamente (Cuadro 2).

Las semillas almacenadas a temperatura ambiente (26 ± 1 ºC) mostraron 100 % de germinación sólo durante el primer año y después de 24 meses ésta se redujo hasta 72 % (Cuadro 2).

Conocer el comportamiento de la germinación de las semillas de V. heliconioides es esencial para diseñar estrategias de conservación y aprovechamiento de esta especie. En bromelias se ha reportado que las semillas pueden mantenerse viables de forma natural por seis meses (^{Miranda et al., 2007}); sin embargo, este periodo es variable entre especies. Los resultados observados en la presente investigación son similares a los obtenidos en Guzmania lingulata, Tillandsia fasciculata y V. sanguinolenta, donde el almacenamiento en frío (-20 ºC) permitió que 93 % de las semillas germinaran después de dos años (^{Zotz, 2013}). Si bien no hay estudios de viabilidad de semillas de bromelias in vitro, la observada en V. heliconioides supera a la reportada en otras especies en condiciones ex vitro. En Aechmea bracteata las semillas recién cosechadas no tienen problemas para su germinación; sin embargo, sólo 75 % de las que son almacenadas durante un año germinan, mientras que después de dos años pierden su capacidad para germinar (^{Goode y Allen, 2009}). En especies del género Tillandsia se puede conservar la germinación por más de un año, pero ésta se reduce gradualmente. En T. caput-medusae 81.7 % de las semillas germinaron después de un año de almacenamiento a 25 ºC, mientras que en T. recurvata sólo 8 % de éstas germinó (^{Flores-Palacios et al., 2015}). Por otra parte, las semillas de Guzmania lingulata, Tillandsia fasciculata y V. sanguinolenta almacenadas durante un año a 22 ºC mantuvieron porcentajes de germinación cercanos a 100 %; sin embargo, después de dos años la germinación fue menor a 25 % (^{Zotz, 2013}).

La temperatura es un factor importante para la conservación de semillas, y para varias especies de bromelias la temperatura baja tiene un efecto positivo. En el presente estudio el almacenamiento de semillas de V. heliconioides a 10 ºC fue suficiente para mantener su viabilidad hasta por dos años. Es probable que la rápida pérdida de viabilidad en V. heliconioides y otras bromelias se relacione con su origen tropical, ya que las semillas de muchas especies que crecen en estos climas pueden ser recalcitrantes, aspecto que dificulta el almacenamiento y la preservación de su diversidad en bancos de semillas (^{Bewley et al., 2013}). No obstante, el hecho de que las semillas de V. heliconioides permanezcan viables durante un año podría ayudar a preservar sus poblaciones en condiciones naturales, al coincidir con los periodos de lluvia propios de la selva alta perennifolia.

Regeneración vía organogénesis

Inducción de brotes

Todas las combinaciones de BAP y ANA indujeron la formación de brotes en los explantes; sin embargo, sólo los explantes cultivados en 5 y 15 µM de BAP y 1 y 2 de ANA µM mostraron un número de brotes significativamente menor (3.3 a 5.3) que aquellos cultivados en 10 µM de BAP y 1 µM de ANA (6.8) (Cuadro 3) (Figura 1c). En contraste, sólo los brotes obtenidos en una combinación de 10 µM de BAP y 1 µM de ANA tuvieron una longitud significativamente menor (0.63) que la de los obtenidos con 5 µM de BAP y 1 µM de ANA (0.83) (Cuadro 3). El crecimiento lento es un aspecto que caracteriza a las bromelias; este comportamiento también se observó en la propagación in vitro, aunque se aceleró por los nutrientes del medio de cultivo y los reguladores de crecimiento. Se desconoce el tiempo preciso que transcurre para que una planta alcance su estado adulto e inicie la floración, pero se sabe que puede tardar desde meses hasta años.

La eficiencia del BAP y ANA observada en V. heliconioides también ha sido reportada en la propagación in vitro de otras especies de Vriesea utilizando plántulas como explante. En la organogénesis de V. fosteriana se obtuvieron en promedio 22.5 brotes por plántula después de tres meses de cultivo en el medio Knudson adicionado con 8.9 µM de BAP y 2.7 µM de ANA (^{Mercier y Kerbauy, 1992}); en contraste, para V. hieroglyphica la máxima cantidad de brotes (7) se produjo con el mismo medio de cultivo y las mismas concentraciones de reguladores de crecimiento, pero después de seis meses (^{Mercier y Kerbauy, 1994}). En V. gigantea el medio MS adicionado con 8.9 µM de BAP y 2.7 µM de ANA indujo la mayor cantidad de brotes (3.1) después de cuatro meses de cultivo, mientras que en V. philippocoburgii la mejor respuesta (5.0 brotes por explante) se alcanzó con estas mismas concentraciones de BAP y ANA pero en el medio Knudson (^{Droste et al., 2005}).

El número de brotes generados en V. heliconioides en comparación con otras especies de bromelias refleja las diferencias en la capacidad morfogénica de acuerdo con el genotipo y el estado fisiológico del explante. Aunque la combinación de BAP y ANA ha logrado inducir la organogénesis en diversas especies de bromelias, es necesario optimizar las condiciones de cultivo para la propagación in vitro de cada especie.

Multiplicación de brotes

En el primer ciclo de multiplicación de ocho semanas, el número promedio de brotes por explante fue de 7.4, con una longitud media de 0.62 cm cuando se cultivaron en el medio MS adicionado con 10 µM de BAP y 1 µM de ANA, que fue una de las combinaciones de reguladores de crecimiento que más favoreció la organogénesis, en tanto que en el segundo ciclo los explantes mostraron un ligero incremento en su capacidad organogénica al formar en promedio 7.8 brotes de 0.57 cm de longitud (Figura 1d).

Durante la etapa de multiplicación en la propagación in vitro de algunas bromelias se han empleado los mismos reguladores de crecimiento que han favorecido la inducción (^{Guerra y Dal Vesco, 2010}). En V. heliconioides y V. cacuminis el BAP y ANA utilizados en la etapa de inducción también promovieron la multiplicación de los brotes (9.3 brotes por explante) (^{De Resende et al., 2016}); en tanto que en Nidularium fulgens, la combinación de thidiazuron (0.1 µM) y ANA (2.7 µM) indujo la mejor respuesta en la etapa de multiplicación (12.1 brotes por explante) (^{Paiva et al., 2009}).

Alargamiento y enraizamiento de plantas

El enraizamiento se obtuvo tanto con el medio MS completo o a la mitad de su concentración, con o sin AG₃; sin embargo, el número de raíces fue mayor al emplear la mitad de la concentración de sales, con o sin AG₃ (3.9 a 4.6) (Cuadro 4). Por otro lado, las plantas duplicaron su tamaño en la mayoría de los tratamientos después de 12 semanas de cultivo; los brotes que crecieron en el medio MS completo adicionado con 1 µM de AG₃ mostraron un tamaño significativamente mayor (7.6 cm) que el de aquellos que se cultivaron en el medio MS completo o a la mitad de la concentración sin AG₃ (Cuadro 4; Figura 1e). El enraizamiento inició a partir de la cuarta semana de cultivo y al mismo tiempo el envés de las hojas comenzó a tornarse de color morado claro, típico de las plantas juveniles de V. heliconioides.

En V. heliconioides la formación de raíces resultó eficiente con el medio de cultivo MS completo o a la mitad de concentración de sales, y no requirió la adición de auxinas, como se ha reportado en otras especies de bromelias. Al respecto, la inducción de raíces en brotes de V. scalaris fue mejor en el medio MS sin reguladores que con ácido indolbutírico (^{Da Silva et al., 2009}).

En V. fosteriana, V. gigantea y V. philippocoburgii el enraizamiento fue promovido con 1.1 µM de ANA (^{Droste et al., 2005}; ^{Mercier y Kerbauy, 1992}), mientras que en V. cacuminis la combinación de 15 µM de AG₃ y 1.5 µM de ANA estimuló la formación de 2.3 raíces por planta (^{De Resende et al., 2016}). En esta última especie se atribuyó un efecto positivo del AG₃ en combinación con ANA sobre el enraizamiento; sin embargo, en V. heliconioides el número de raíces fue mayor en ausencia de la giberelina. Si bien en los sistemas de propagación in vitro el enraizamiento es una fase crítica previa a la aclimatación (^{George et al., 2008}), en bromelias la presencia de raíces adventicias se considera innecesaria y ésta se puede inducir ex vitro (^{Guerra y Dal Vesco, 2010}). Las raíces de bromelias epífitas tienen como función principal el soporte de la planta en estado adulto; específicamente en los géneros Tillandsia y Vriesea, la absorción de humedad y nutrientes es llevada a cabo por las hojas, donde la presencia de tricomas peltados es más abundante (^{Mondragón et al., 2011}).

En el presente estudio, 1 µM de AG₃ promovió el alargamiento de los brotes, aunque redujo ligeramente el número de raíces; las plantas aumentaron de 2.3 a 2.5 veces su tamaño original lo que superó la respuesta de los tratamientos donde este regulador se omitió. En V. friburgensis var. paludosa y Dyckia distachya el alargamiento fue promovido con 5 µM de AG₃ (^{Alves y Guerra, 2001}; ^{Pompelli y Guerra, 2005}), mientras que en V. reitzii los mejores resultados se obtuvieron con 10 µM de AG₃ (^{Dal Vesco y Guerra, 2010}; ^{Rech Filho et al., 2005}). Se ha sugerido que en las bromelias la adición de 5 a 10 µM de AG₃ al medio de cultivo promueve el alargamiento; sin embargo, la efectividad de este regulador de crecimiento dependerá de la especie.

En la propagación in vitro de bromelias se ha reportado que la altura de la planta, más que su capacidad para formar raíces, es el factor limitante en la aclimatación, ya que 3 cm es el tamaño mínimo para que ésta sea exitosa (^{Guerra y Dal Vesco, 2010}).

Aclimatación de plantas

La supervivencia de las plantas de V. heliconioides cultivadas en fibra de coco y corteza fue de 95 y 93 %, respectivamente, mientras que en la mezcla de turba y perlita fue de 68 %. Las hojas más externas se tornaron de color amarillento y necróticas después de cuatro semanas; sin embargo, las plantas continuaron su crecimiento normal formando nuevas hojas y un sistema radical más completo (Figura 1F). En la aclimatación de bromelias no se ha definido un sustrato ideal, pero se han empleado mezclas de corteza de pino (Pinus L.), cáscara de arroz (Oryza sativa L.) carbonizada, vermiculita, turba, arena y fibra de coco con resultados favorables (^{Dal Vesco y Guerra, 2010}; ^{De Resende et al., 2016}; ^{Rech Filho et al., 2005}).