Muestreo de suelo y aislamiento de microorganismos

Se obtuvieron aleatoriamente muestras de suelo y raíz de la región productora de haba de los municipios de Libres, Zaragoza y Xochitlán de Vicente Suárez, Puebla a partir de cuadrantes de 1 m2. Una muestra compuesta por cuadrante consistió en la mezcla de aproximadamente 10 cm3 de suelo extraído a 5-10 cm del tallo y 20 cm de profundidad de todas las plantas del cuadrante. Se obtuvieron un total de tres muestras por localidad de un solo campo de cultivo. En el laboratorio, las muestras se refrigeraron a 4 ºC hasta su análisis y las raíces se lavaron y colocaron en etanol 70 % por un periodo no mayor a 5 d.

Para el aislamiento de las BFN se seleccionaron entre cinco y 10 nódulos de las raíces de 3 a 5 mm de diámetro. Los nódulos se lavaron con agua destilada y se colocaron en una solución de ácido clorhídrico 2 % y se agitaron con vórtex por 1 min; finalmente, se enjuagaron con agua destilada estéril y se lavaron con etanol 95 % durante 4 min. Los nódulos se molieron con mortero hasta lograr una mezcla homogénea, la cual se colocó en tubos de ensayo con medio de extracto de levadura-manitol. A partir de los cultivos líquidos se tomó una muestra con asa bacteriológica y se sembró por estriado en un medio de extracto de levadura manitol agar-Rojo Congo (ELMA-RC) por el método de estriado y se cultivaron a 28 °C durante 5 d. A partir de los cultivos en sólido se realizaron resiembras sucesivas hasta lograr el aislamiento.

Identificación y caracterización de bacterias

Las BFN se identificaron morfológicamente de acuerdo con ^{Somasegaran y Hoben (1994)}. Las pruebas bioquímicas basadas en los procedimientos de ^{MacFaddin (2000)} incluyeron evaluaciones de movilidad-indol- ornitina con el medio MIO (peptona de carne y caseína, extracto de levadura, L-ornitina, dextrosa, púrpura de bromocresol y agar); se evaluó la utilización de azúcares con el medio TAH (triple azúcar-hierro, lactosa, sacarosa y glucosa), urea con agar urea (agar base urea) y citratos con medio agar citrato de Simmons (fosfato dibásico de amonio, sulfato de magnesio, fosfato dipotásico, azul de bromotimol, cloruro de sodio, citrato de sodio y agar). Las pruebas de descarboxilación de aminoácidos se hicieron por la inducción de enzimas específicas mediante el medio AHL (agar de hierro y lisina) que produce una respuesta colorimétrica.

La caracterización de las bacterias se hizo con evaluación del crecimiento in vitro a diferentes temperaturas (4, 20, 35 y 45 ºC), pH (5, 6, 7 y 8) y salinidad (0.25, 0.5, 0.75 y 1 % de NaCl) en medio líquido LM (levadura-manitol) con base en lo descrito por ^{Hernández et al. (2012)}. Las bacterias se inocularon en el medio líquido con una asada a partir de las colonias previamente aisladas. Los cultivos se mantuvieron en agitación constante con control de temperatura, a una velocidad de 70 rpm durante una semana. El monitoreo se realizó cada 12 h mediante espectrofotometría (540 nm); los resultados se compararon con una curva de calibración absorbancia vs. número de células para obtener el tiempo generacional y calcular el número de generaciones con base en la fórmula de Lambert-Beer, de acuerdo con ^{Harris (2007)}.

Inoculación bacteriana

El inóculo de bacterias se preparó cultivando las cepas previamente aisladas en medio líquido ELM-RC en agitación a 20 ºC. La concentración en el inóculo se ajustó a 109 células mL-1 (^{Somasegaran y Hoben, 1994}). Para la inoculación se aplicó 1 mL del cultivo bacteriano a cada maceta con los cultivos de haba en una sola ocasión y a los 30 d después de la germinación, según lo propuesto por ^{Workalemahu (2009)}.

Preparación de hongos micorrízicos e inoculación

Para la producción de inóculo de HMA se utilizó sorgo (Sorghum spp.) como planta trampa. El cultivo se hizo en un sustrato inerte de vermiculita; después de tres semanas de germinación se inocularon las plantas con suelo procedente de campo. Para la inoculación las muestras de suelo se tamizaron en húmedo con mallas de 60, 120 y 250 μm, se cuantificó el número de esporas en los tamices de 60 y 120 μm mediante un diferencial de sacarosa y la observación en microscopio estereoscópico para inocular cerca de 100 esporas por planta en los cultivos de sorgo. En el monitoreo del desarrollo de los HMA en las plantas trampa se observó la colonización de raíces mediante la tinción con azul de Tripano 5 %, se verificó el establecimiento de la simbiosis. Cuando las plantas iniciaron la formación de espigas se identificaron las morfoespecies y la cantidad total de esporas. Se consideró un inóculo listo cuando se contabilizaron aproximadamente 100 esporas g-1 de suelo (^{Liu y Wang, 2003}). Se hicieron cultivos independientes para cada localidad con tres repeticiones y un testigo, sin inoculación de suelo.

Los experimentos con plantas se realizaron en condiciones controladas de invernadero en Zacapoaxtla, Puebla. Se inició con la germinación de semillas (dos por maceta) de haba desinfectadas en macetas de 4 kg con una mezcla de arena:tierra:humus (1:2:1 v/v/v), previamente tratada con doble esterilización (120 ºC y 1.40-1.75 kg cm-2). Para la inoculación con los simbiontes probados de manera independiente, los hongos o las bacterias se agregaron 30 d después de la germinación, mientras que en HMA-BFN las bacterias y hongos se añadieron a los 30 y 37 d, respectivamente. Para los ensayos de respuesta del haba a la simbiosis se utilizaron tres experimentos independientes BFN, HMA y BFN-HMA. En cada experimento hubo cuatro tratamientos, uno para cada cepa de las tres localidades (Libres, Zaragoza y Xochitlán) y el testigo. Los cultivos se mantuvieron en invernadero con iluminación natural y temperatura ambiente durante diciembre a marzo, periodo regular de siembra en la región. Las plantas se regaron semanalmente con 100 mL de agua filtrada.

Variables respuesta

Después de la floración las plantas se extrajeron para separar la raíz del vástago; se cuantificó el peso fresco de cada parte y se colocó en una estufa a 45 ºC durante 48 h hasta peso constante y se determinó el peso seco. La concentración de nitrógeno se midió por el método de ^{Kjeldahl (1883)}. El nivel de simbiosis (número de nódulos por raíz) se cuantificó categorizando la nodulación en las raíces de acuerdo con ^{Amijee y Giller (1998}). Para conocer el nivel de colonización micorrízica se tiñeron de 100 a 150 mg de raíces secas (45 ºC) con azul de Tripano, después de aclarar los tejidos con KOH 10 %, según lo descrito por ^{Phillips y Hayman (1970)}. El porcentaje de colonización se calculó con el número de segmentos de raíz con micelio intracelular con respecto al número total de raíces (^{Biermann y Linderman, 1983}).

Diseño experimental y análisis estadístico

El diseño experimental de los tres experimentos independientes (BFN, HMAy BFN-HMA) fue completamente aleatorizado con cuatro repeticiones, para un total de 16 unidades experimentales, consistentes en una maceta con una planta. Los datos se analizaron mediante análisis de varianza, previa verificación de normalidad en los datos y la comparación de medias se hizo por el método de Tukey- Kramer, con una probabilidad P ≤ 0.05.

Cracterización de los simbiontes

Se detectaron dos morfoespecies de HMA (Figura 1), identificadas como A y B según el orden en que se encontraron. Las primeras se observaron únicamente en las plantas inoculadas con suelos procedentes de Zaragoza (Figura 1A), mientras que el tipo B se detectó en los tres sitios (Figura 1B). Se observaron diferencias en el grosor de la pared esporal, ornamentación (tipo A) y presencia de cicatriz de unión a hifa de sostén (tipo B). La cuantificación total de esporas en el sustrato de las plantas trampa fue de aproximadamente 100 esporas g-1 de suelo, dentro de lo recomendado por ^{Liu y Wang (2003)}. Las características bioquímicas de Rhizobium, aislada a partir de raíces de plantas de cada uno de los sitios seleccionados se muestran en el Cuadro 1. La información sugiere que se trata de una misma especie.

Respuesta de las cepas a factores ambientales

En la Figura 2 se presenta la respuesta de las distintas cepas ante los factores ambientales temperatura, pH y salinidad sobre el crecimiento bacteriano. Los datos indican que, dependiendo del clima predominante en sitios de origen, el crecimiento de las bacterias es diferentes en los distintos niveles de los tres factores evaluados. Existen diferencias climáticas contrastantes entre los municipios estudiados: clima frío-seco (Libres), húmedo- frío (Zaragoza) y húmedo-cálido (Xochitlán).

En cuanto a temperatura, el mayor crecimiento de las tres cepas fue a 20 ºC; aunque los valores óptimos de Rhizobium son alrededor de 20 ºC, existen cepas con tolerancia a temperatura, que permiten una tasa de reproducción relativamente constante en amplios intervalos (^{Ogata y Zúñiga, 2008}). La cepa de Zaragoza creció significativamente más a 4 ºC, la cepa de Libres a 35 ºC y la cepa de Xochitlán a 45 ºC, mientas que la de Libres se inhibió completamente con esta última temperatura. En general, Rhizobium presenta crecimiento lento a pH ácido (^{Hernández et al., 2012}). En este estudio, las cepas de Libres y Xochitlán crecieron mejor a pH 7, mientras que la de Zaragoza lo hizo a pH 8. La cepa de Libres es más susceptible a pH bajo y la de Xochitlán a pH alto.

En cuanto a la salinidad, la cepa de Libres creció mejor a 0.25 % de NaCl, el aislado de Xochitlán se desarrolló igual en todos los niveles de salinidad evaluados y la cepa de Zaragoza fue resistente al 1 % de NaCl, con un crecimiento similar al observado en la salinidad más baja. ^{Cuadrado et al. (2009)} señalaron que algunas cepas de Rhizobium son capaces de tolerar una salinidad de hasta 5.5 % de NaCl, aunque su crecimiento es lento. Estos autores sugieren que las cepas con mayor tolerancia a condiciones extremas son candidatas idóneas para utilizarse como bioinoculantes.

En el experimento combinado de bacterias y hongos (BFN-HMA) se observaron diferencias estadísticas en todas las variables morfométricas. El peso fresco en plantas con BFM-HMA presentó valores mayores que el testigo (más de 10 g de diferencia), mientras que solamente el peso seco del tejido aéreo fue menor en el testigo en comparación con el resto de tratamientos con HMA de las tres zonas, con una diferencia de 1 a 2 g. Con BFN se observó que el peso fresco del vástago con la cepa de Xochitlán fue de 5 g más que con las otras cepas y el testigo. Con HMA todas las variables morfométricas fueron estadísticamente similares en los tratamientos (Cuadro 2). Lo anterior puede relacionarse con el balance costo-beneficio de la asociación, pues se considera benéfico cuando la planta transfiere carbono al huésped y éste retribuye facilitando la tasa de fijación de carbono por unidad de área, lo que mejora la asimilación de nutrientes y disminuye los requerimientos para producir o mantener una unidad de área fotosintética. Lo contrario puede presentarse, y entonces, la interacción pasa de simbiosis a parasitismo, cuando la retribución del hospedero no compensa el gasto de la transferencia de C al huésped (^{Lapointe y Molard, 1997}; ^{Tinker et al., 1994}; ^{Wright et al., 1998}).

Figura 1 Esporas de HMA encontradas en plantas trampa con suelo de Zaragoza (A) y en los tres sitios muestreados (B). Pared de la espora (PE), cicatriz de unión a la hifa de sostén (C) y ornamentación (O). 

Cuadro 1 Caracterización bioquímica de las cepas de Rhizobium sp. aisladas de tres campos de cultivo de haba en Puebla. 

⁺reacción positiva

^-reacción negativa

Figura 2 Crecimiento in vitro de las cepas de Rhizobium aisladas de tres campos de habas cultivadas en medio líquido YM para evaluar el efecto del pH (A), temperatura (B) y salinidad (C)Los valores son el promedio de tres repeticiones. Medias con igual literal indica que no son estadísticamente diferentes (Tukey-Kramer, 0.05). 

Cuadro 2 Crecimiento de las plantas inoculadas con bacterias fijadoras de nitrógeno (BFN), hongos micorrízicos arbusculares (HMA) y BFN-HMA. 

Medias con letras iguales no son estadísticamente diferentes (Tukey-Kramer, 0.05)

^PFpeso fresco

^PSpeso seco

^[N]concentración de nitrógeno

^CM/CN:colonización micorrízica/categoría de nodulación

^NAno aplica

Con la inoculación de HMA se obtuvieron valores más altos de concentración de nitrógeno en las plantas con respecto a las no inoculadas. Aunque se considera que los HMA facilitan principalmente la asimilación de P, está documentado que también mejoran la asimilación de otros nutrientes como N. Vitis vinifera L. en simbiosis con Glomus fasciculatum presentó altos niveles de nitrógeno (^{Alarcón et al., 2001}). En las plantas testigo se encontró 30 % menos colonización micorrízica en comparación con las habas inoculadas, donde fue superior al 90 % y el peso fresco significativamente más alto que en el testigo. Se considera que la alta colonización micorrízica es inversa al desarrollo de la raíz. ^{Aguirre y Kohashi-Shibata (2002)} observaron más del 70 % de colonización, pero un menor volumen y peso de la raíz en relación con el testigo en plantas de frijol. En este caso, se registró que el peso fresco de la raíz fue mayor por más de 20 g que en el testigo solamente cuando la inoculación fue con BFN-HMA.

En los tratamientos donde se inocularon BFN y BFN- HMA se observó incremento en el peso de las plantas y en esos tratamientos se obtuvo un nivel de nodulación medio en las raíces. ^{Ramírez-Elías et al. (2014)} concluyeron que la única manera de obtener una respuesta positiva en el desarrollo y rendimiento vegetal con la inoculación de BFN es que la población bacteriana alcance una biomasa alta en la raíz; por lo tanto, para elaborar un inóculo de BFN debe considerarse su alta capacidad de colonización radicular.

Cuando se inocularon bacterias y hongos simbiontes se registraron incrementos significativos con respecto al testigo en todas las variables, excepto en el peso seco de la raíz. Para esta última variable, los valores más altos se obtuvieron con la cepa de Zaragoza (más de 10 g de diferencia en comparación con los demás tratamientos). El peso fresco de la raíz se incrementó en más de 20 g, el fresco aéreo en más de 5 g, y el contenido de nitrógeno en alrededor de 0.1 %. En las plantas con BFN-HMA la colonización de las raíces fue 100 % y la nodulación media en comparación con 70 % de colonización micorrízica y nodulación baja en el testigo. En kudzú (Pueraria phaseoloides) se encontró que la coinoculación con cepas de Rhizobium . Glomus producen incrementos de biomasa y de semillas (^{González et al., 2012}).

En este estudio la inoculación simultánea de BFN-HMA mejoró las variables evaluadas en las plantas de haba en comparación con los microorganismos benéficos por separado, similar a lo encontrado en lenteja (Lens culinaris) por ^{Xavier y Germida (2003)}. No se observó una relación entre el efecto benéfico y el sitio de origen de los microorganismos simbióticos. La inoculación individual de BFN o HMA únicamente incrementó la concentración de nitrógeno. Al parecer la presencia simultánea de BFN y HMA hace más evidente el crecimiento de la planta, similar a lo registrado en frijol por ^{Jia et al. (2004)}, quienes lo atribuyeron a que uno de los microorganismos modifica la colonización de la raíz para el otro, lo que repercute positivamente en las variables morfométricas y fotosintéticas.