Material genético

Se utilizaron 84 mazorcas que procedían de programas de mejoramiento genético para resistencia a pudrición de mazorca cosechadas en el ciclo otoño-invierno 2015, las que se conservaron en un cuarto frío a -10 ºC hasta su análisis. Cada mazorca contenía semillas sintomáticas y asintomáticas procedentes de lotes de producción de semilla ubicados en 14 localidades pertenecientes a cinco entidades federativas de México. Se analizaron 28 mazorcas de Chiapas, 16 de Chihuahua, 14 del Estado de México, 10 de Guanajuato y 16 de Jalisco.

Aislamientos y obtención de cultivos monoconidiales

De cada mazorca se seleccionaron 10 semillas sintomáticas y 10 asintomáticas, las cuales se desinfestaron con una solución de hipoclorito de sodio (NaClO) 1.5 % y se enjuagaron dos veces con agua destilada estéril; después, se cubrieron con papel filtro estéril y se colocaron a temperatura ambiente para eliminar el exceso de humedad. Posteriormente, cada grupo de 10 semillas se colocó en una caja de Petri que contenía medio de cultivo semiselectivo Spezieller-Nährstffarmer-Agar (SNA) (1 g KH₂PO₄, 1 g KNO₃, 0.5 g MgSO₄•7H₂O, 0.5 g KCl, 0.2 g dextrosa, 0.2 g sacarosa y 20 g agar) (^{Leslie y Summerell, 2006}). Las cajas Petri se colocaron en una cámara de crecimiento a 23 ºC por 5 d; posteriormente, una sección del micelio de cada caja se colocó en un tubo Eppendorf de 1.5 mL con agua destilada y Tween 20 0.5 %. Los tubos se mezclaron por inversión y 100 µL de la suspensión se transfirió a un nuevo tubo con 900 µL de agua con Tween 20 0.1 % para obtener diluciones seriadas. De las diluciones 10^-1 y 10^-2 se transfirieron 120 μL, por separado, en cajas Petri con medio agar-agua (AA) (18 g de agar, 1000 mL de agua destilada) para germinar los conidios. Transcurridas 12 h, se realizó la micro-manipulación bajo un estereoscopio para seleccionar tres conidios germinados, los que se colocaron por separado en cajas con medio papa-dextrosa-agar (PDA) (20 g de PDA, 2 g de agar). A los 8 d se registró el color del micelio (blanco, morado, salmón, violeta o rojo) que se desarrolló sobre las semillas. Al final del proceso se obtuvieron 439 cultivos monoconidiales (cepas); cada cepa se conservó en papel filtro Wathman #1 (GE Healthcare, Chicago, Illinois, EUA) cubierto con papel aluminio a 4 ºC dentro de un recipiente hermético.

Extracción de DNA de las cepas aisladas

Las cepas se reactivaron en medio SNA; después de 8 d se colectó el micelio con una espátula y se colocó en un tubo Eppendorf de 2 mL. La extracción de DNA se basó en una modificación al protocolo de Bromuro de cetil-trimetil-amonio (CTAB) 2 % propuesto por ^{Doyle y Doyle (1990)}, que consistió en re-suspender la pastilla de DNA en 400 µL de agua HPLC. Los tubos se incubaron a 55 ºC por 15 min; posteriormente, se agregaron 34 µL de acetato de sodio (C₂H₃NaO₂) 3 M y 1 mL de etanol 95 % frío y éstos se mezclaron suavemente por inversión; los tubos se colocaron a -20 ºC durante 1 h y se centrifugaron a 11,500 × g por 5 min. La pastilla se lavó dos veces con 650 µL de etanol 70 % y se centrifugó por 5 min. Finalmente, la pastilla se re-suspendió en 40 µL de agua HPLC y se almacenó a -20 ºC. El DNA se cuantificó por espectrofotometría en un NanoDrop 2000 UV-Vis (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA) y se consideró de buena calidad cuando los valores de absorbancia de las relaciones A₂₆₀/A₂₈₀ y A₂₆₀/A_230, se encontraron entre 1.8 y 2.0. Para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) el DNA se prepararó en diluciones de 20 ng mL^-1.

Amplificación y secuenciación del gen TEF-1α

Para la amplificación del gen TEF-1α se utilizaron los iniciadores EF-448 (5’-TCACTTGATCTACAAGTGCGGTGG-3’) y EF-1251 (5’-CCTCGAACTCACCAGTACCG-3’), que amplifican un fragmento de 650 pares de bases (pb) (^{Alves et al., 2008}). La mezcla de reacción de PCR se preparó en un volumen final de 15 µL que contenía agua HPLC, 1X buffer, 0.2 µM de dNTPs, 10 pmol de cada iniciador, 0.9 U Go Taq DNA Polimerasa (Promega, Madison, Wisconsin, EUA) y 60 ng de DNA. Las condiciones de amplificación consistieron en una desnaturalización inicial a 95 ºC por 85 s, seguida por 35 ciclos de 95 ºC por 35 s, 60 ºC por 55 s y 72 ºC por 1.5 min, y un ciclo de extensión final a 72 ºC por 10 min. La reacción de PCR se llevó a cabo en un termociclador Peltier Thermal Cycler C1000 Touch™ (Bio-Rad, Hercules, California, EUA).

La amplificación de los productos de PCR se verificaron por electroforesis en gel de agarosa Seakem® (Lonza, Alpharetta, Georgia, EUA) 1.5 % teñido con GelRed® (Biotium, Fremont, California, EUA) y corrido a 80 V durante 1.5 h. Las bandas se visualizaron en un transiluminador (Vilver Lourmat, Eberhardzell, Alemania) y se documentaron con el sistema Infinity (http://www.vilber.de/en/products/gel-documentation/infinity/). Los amplicones se limpiaron con el método enzimático ExoSAP-IT™ (Affymetrix, Santa Clara, California, EUA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La reacción de secuenciación se realizó en placas MicroAmp Optical de 96 pozos con el BigDye™ Terminator v 3.0 (Applied Biosystems®, Foster City, California, EUA), en un volumen total de 20 µL que contenía 4.0 µL (2.5 X) de Ready Reaction Premix, 2.0 µL (5X) BigDye sequencing buffer, 4 pM de cada iniciador y 2.0 µL del producto de PCR como molde. Las placas se lavaron con el método de precipitación con acetato de sodio/etanol; posteriormente, se secaron e hidrataron con formamida. Finalmente, las placas se colocaron en un secuenciador Genetic Analyzer modelo 3130 (Applied Biosystems®).

Reconstrucción filogenética mediante inferencia bayesiana

Las secuencias se ensamblaron con el programa bioinformático DNA Baser Sequence Assembler 4.36 (www.DnaBaser.com) para obtener la secuencia consenso correspondiente a cada cepa, las que se compararon con la opción Basic Local Alignment Search Tools Nucleotide (BLASTN) (^{Zhang et al., 2000}) del National Center for Biotechnology Information (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) para determinar las secuencias relacionadas con base en los porcentajes de máxima identidad. De esta manera se identificaron las secuencias de referencia a incluirse para el análisis conjunto, las que se obtuvieron de la base de datos del Fungal Biodiversity Center's Fusarium Multilocus Sequence Typing (http://www.cbs.knaw.nl/Fusarium) y del GenBank.

Para la reconstrucción filogenética, las secuencias consenso junto con las secuencias de referencia se compilaron en un archivo Fasta y se alinearon con la opción Muscle (^{Edgar, 2004}), incluido en el programa MEGA 7 (^{Kumar et al., 2016}) con los parámetros por defecto.

El árbol filogenético se construyó con el método de inferencia bayesiana con el programa MrBayes v.3.2 (^{Ronquist et al., 2012}). Para el análisis se utilizó el modelo de sustitución nucleotídica Generalized Time Reversible (GTR), que considera que las tasas de sustitución, transiciones y transversiones son diferentes; además, el modelo incorpora diferentes tasas para cada cambio y diferente frecuencia de nucleótidos. En el presente estudio, el valor supuesto de cuatro caracteres implementado por defecto en el programa MrBayes se reemplazó por el valor de 6, que es la tasa de sustitución con la opción lset (^{Tavaré, 1986}); el muestreo de los árboles se realizó cada 1000 generaciones. El análisis concluyó cuando la desviación estándar fue menor que 0.01. Del total de árboles que se generó se eliminó el 25 % con la función burn-in phase; la probabilidad posterior se determinó con el resto de los árboles. La visualización del árbol se realizó con el programa FigTree (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/) y las secuencias resultantes se depositaron en la base de datos del GenBank.

Aislamiento y obtención de cultivos monoconidiales (cepas)

Se obtuvieron 439 cepas procedentes de las 84 mazorcas. El 54 % (237/439) de las cepas provino de semillas sintomáticas y el 46 % (202/439) de semillas asintomáticas (Cuadro 1); es decir, de una misma mazorca se pueden aislar colonias de Fusarium de ambos tipos de semillas; en consecuencia, es probable que el fitomejorador seleccione germoplasma susceptible a pudrición de la mazorca cuando elige fenotipos aparentemente sanos; es decir, plantas que producen mazorcas en las que coexisten ambos tipos de semilla.

La distribución de las cepas por entidad fue la siguiente: Chiapas 35.6 % [(70 de semillas asintomáticas + 86 de sintomáticas)/439], Estado de México, Chihuahua y Jalisco 17.3 % y Guanajuato 12.5 %. Este número de aislamientos guarda paralelismo con la frecuencia de mazorcas provenientes de cada entidad: Chiapas 33.3 %, Estado de México 16.7 %, Guanajuato 12 %, Chihuahua y Jalisco 19 % (Cuadro 1). Lo anterior significa que no hubo una mayor frecuencia de aislamientos entre entidades; sin embargo, como se desconoce la nomenclatura varietal de las mazorcas, persiste la duda de si el número de muestras (mayor en Chiapas que en Guanajuato) se debe a que en la primera entidad existe mayor incidencia de Fusarium que en la segunda.

Dentro de cada entidad federativa no hubo predominancia del número de cepas aisladas de semillas asintomáticas con respecto al de semillas sintomáticas (i.e. Chiapas 70 vs. 86, Chihuahua 38 vs. 38). De éstas, sólo una de las muestras asintomáticas de mazorca (Cuautenango, Tenango del Valle, Estado de México) no presentó micelio (Cuadro 1).

En cuanto a la pigmentación de las cepas (Cuadro 1); el 49.6 % [i.e., (139 de semillas asintomáticas + 79 de sintomáticas)/439)] fueron blancas; 18.0 % color salmón (con mayor incidencia en Chiapas); 15.5 % moradas, con mayor incidencia en Chiapas y sin presencia en Guanajuato; 10.5 % rojas (sin presencia en Chiapas) y 6.4 % de color violeta, con mayor presencia en el Estado de México y ausentes en Jalisco; sin embargo, al agrupar las cepas en función de la sintomatología se observa que, en general, los colores blanco y salmón están presentes, aunque con diferente frecuencia en semillas sintomáticas y asintomáticas en casi todas las entidades, con excepción de las muestras provenientes de Chihuahua, y los colores violeta y rojo predominan en las semillas sintomáticas del Estado de México y Jalisco. En un estudio sobre la pigmentación de los micelios de Fusarium provenientes de semillas sintomáticas de maíz se observó predominancia del color morado y blanco, mientras que los de semillas asintomáticas fueron de color violeta, blanco o crema (^{Solano-Báez et al., 2011}).

Reconstrucción filogenética de los aislamientos usando el gen TEF-1α

Con base en los resultados de la amplificación del gen TEF-1α se observó la presencia de amplicones bien definidos de ~ 650 pb (Figura 1).

Figura 1 Bandas de 650 pares de bases (pb) correspondientes a la amplificación parcial del factor de elongación de la traducción 1α de Fusarium spp. Carriles 1 a 3: cepas de Chiapas 2.1.1a, 2.2.2s y 3.2.2s; carriles 4 a 6: cepas del Estado de México 26.1.1a, 26.5.1s y 27.3s; carriles 7 a 9: cepas de Guanajuato 32.5.1s, 33.1.1a y 33.5.1s; carriles 10 a 12: cepas de Jalisco 53.2.1s, 55.1.1a y 55.3.1s; carriles 13 a 14: cepas de Chihuahua 33.1.1a y 33.5.1s; carriles 15 a 17: cepas de Sinaloa 21.1.1a, 21.2.1a y 21.4.1s. a: asintomática; s: sintomática; MM: marcador molecular de 1kb. 

El análisis de las secuencias de los 439 aislamientos (202 procedente de semillas asintomáticas y 237 de semillas sintomáticas) indicó la presencia de las especies F. subglutinans (GenBank MN517841 y MN517842), F. temperatum (GenBank MN517843 y MN517844) y F. verticillioides (GenBank MN517845, MN517846 y MN517847); además, para el caso de F. verticillioides se detectó la presencia del Haplotipo 10 en las muestras procedentes de Chiapas (27 aislamientos de semillas asintomáticas, 32 de sintomáticas), Estado de México (27 de semillas asintomáticas, 42 de sintomáticas), Chihuahua (12 de semillas asintomáticas, 13 de sintomáticas) y Jalisco (23 de semillas asintomáticas, 20 de sintomáticas); y del Haplotipo 11 en Chiapas (11 aislamientos de semillas asintomáticas, 14 de sintomáticas) y en Chihuahua (3 de semillas asintomáticas, 3 de sintomáticas), los que representan un nuevo registro para México (Figura 2), más un grupo no definido en el mismo clado (Figura 3), que corresponden a lo propuesto por ^{Zhang et al. (2016)}, quienes se basaron en cambios de un solo nucleótido (SNP) en las posiciones 59 a 606 del gen TEF-1α. Los cambios en el Haplotipo 10 corresponden a las posiciones 591 (C/T) y 606 (C/T) (GenBank MN025470) y en el Haplotipo 11 en la posición 606 (C/T) (GenBank MN025471) (Cuadro 2). Otras evidencias de la diversidad genética de las poblaciones de F. verticillioides se han obtenido mediante el uso de microsatélites (^{Leyva-Madrigal et al., 2017}).

Figura 2 Porcentaje de los Haplotipos 10 y 11 de Fusarium verticillioides aislados de semilla de maíz por entidad federativa. Ambos haplotipos representan nuevos registros para México. 

Figura 3 Árbol filogenético construido mediante inferencia bayesiana con secuencias parciales del factor de elongación de la transcripción 1α, representativas de los Haplotipos 10 y 11 de Fusarium verticillioides. Fusarium solani cepa CBS 10229 se incluyó como grupo externo. La barra inferior (0.01) indica sustituciones por sitio. 

Fusarium temperatum es una subpoblación derivada de F. subglutinans, descrita por ^{Scauflaire et al. (2011)} dentro del complejo Fusarium fujikuroi, que se caracteriza por incluir especies que producen toxinas que constituyen un peligro para la bioseguridad agrícola, la inocuidad de los alimentos y la salud de las plantas y animales (^{O’Donnell et al., 2018}; ^{Wang et al., 2014}). Asimismo, esta especie se ha reportado causando tizón en plántulas, pudrición de tallo y pudrición de mazorca en España (^{Pintos et al., 2013}), Corea del Sur (^{Shin et al., 2014}), Polonia (^{Czembor et al., 2014}), China (^{Zhang et al., 2014}), América del Norte (^{Lanza et al., 2016}) e Italia (^{Venturini et al., 2016}). En México, F. temperatum se ha aislado también de suelo donde se ha cultivado previamente maíz (^{Robles-Barrios et al., 2015}) y F. subglutinans se ha encontrado en Chihuahua, Guanajuato y Estado de México.

En semillas sintomáticas procedentes de razas e híbridos de maíz en los Valles Altos Centrales de México, además de F. temperatum, F. subglutinans y F. verticillioides, se ha demostrado la presencia de F. chlamydosporum, F. napiforme, F. poae y F. pseudonygamai (^{Morales-Rodríguez et al., 2007}; ^{Rivas-Valencia et al., 2011}). En semillas procedentes de Sinaloa se obtuvieron 63 aislamientos de F. verticillioides, cuatro de F. andiyazi, dos de F. thapsinum y dos de F. nygamai (^{Leyva-Madrigal et al., 2015}). El mayor número de especies de Fusarium que estos autores mencionan, con respecto al número de especies del mismo género observado en el presente estudio, podría atribuirse a que las mazorcas aquí analizadas fueron producto de programas de mejoramiento genético enfocados a la selección de líneas resistentes a pudrición de mazorca; sin embargo, cuando estas líneas se siembran en localidades con presencia de haplotipos de F. verticillioides diferentes de los que fueron seleccionados, es posible observar el crecimiento miceliar de nuevos linajes.