Características de cladodios

Cladodios frescos de 16 a 20 cm de largo (50 a 100 g) de las variedades Atlixco, Copena V1, Milpa alta y Villanueva se cosecharon de plantas de nopal verdura (Opuntia ficus-indica) crecidas en invernadero durante el ciclo primavera-invierno de 2018. Normalmente, los cladodios con esas características son los que se comercializan y consumen en fresco como “nopalitos” (^{Feugang et. al., 2006}). Inmediatamente después de la cosecha, los cladodios se lavaron con agua de la llave, se les retiraron las espinas con un cuchillo estéril, se enjuagaron con agua destilada estéril y secaron con toallas estériles de papel Sanitas^®.

Preparación del inóculo de Salmonella

Se utilizaron cuatro cepas de Salmonella enterica subespecie enterica (^{Beuchat et al., 2001}): dos cepas (N4 y N14) de Salmonella serotipo Javiana (S. Javiana) y dos cepas (N16 y Sal4) de Salmonella serotipo Typhimurium (S. Typhimurium). Las cepas N4, N14 y N16 se aislaron de cladodios de nopal verdura (Hernández-Anguiano et al. 2009 Com. Pers.)1, y la cepa Sal4 fue una cepa certificada control de S. Typhimurium (ATCC23564). Todas las cepas de Salmonella fueron resistentes a 50 µg mL^-1 de Kanamicina (Km⁵⁰, Sigma-Aldrich^®). Para la preparación del inóculo, por separado, cultivos de N4, N14, N16 y Sal4 se sembraron sobre agar soya tripticaseina (AST, BD Bioxon^®) suplementado con Km⁵⁰ (AST + Km⁵⁰). Transcurridas 72 h, las células bacterianas se suspendieron en 0.1 % de agua peptonada amortiguada (APA, DifcoTM) estéril y se transfirieron a tubos de ensayo esterilizados. Previo a la preparación del inóculo, la densidad óptica de cada suspensión se ajustó a un valor de 0.520 de absorbancia a 560 nm en un espectrofotómetro (Génesis^® UV, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA). Una lectura de 0.520 correspondió a 8.6 log₁₀ UFC mL^-1. De cada suspensión se tomaron 2 mL, los cuales se depositaron en un tubo de ensayo esterilizado y la mezcla obtenida se agitó por 10 s en un vortex (Mixer^®, Heatwrow Scientific, Vernon Hills, Illinois, EUA).

Inoculación de cladodios con Salmonella

Se depositaron 100 μL (7.6 log₁₀ UFC) de mezcla bacteriana o 100 μL de APA 0.1 % en el centro del cladodio. Para ésto se definió superficialmente una sección (“rodaja”) de 4.5 cm de diámetro sobre la cual se distribuyó el inóculo en pequeñas gotas sobre la superficie del tejido (^{Beuchat et al., 2001}). En total se inocularon 21 cladodios con la mezcla de Salmonella y tres cladodios con APA 0.1 % por variedad. Después de la inoculación, los cladodios se mantuvieron en una cámara de bioseguridad (Thermo Forma^® Class II Biological Safety Cabinet, Marshall Scientific, Hampton, NH, EUA) a temperatura ambiente (22 ± 2 °C) por 18 h para permitir el secado y adherencia del inóculo al tejido.

Soluciones desinfectantes y tratamientos

Se utilizaron cinco soluciones con actividad antimicrobiana. Una solución de ácido láctico (Fermont® 85 %) al 1.5 % (T1); tres soluciones que contenían extractos de cálices de jamaica: extracto metanólico seco (1 %) (T2), extracto acetónico seco (1%) (T3), y extracto acuoso seco (1 %) (T4). Cada una de estas soluciones (T2, T3 y T4) formulada con ácido acético (0.1 %), polisorbato 80 (aceite derivado de coco) (2 %), hipoclorito de sodio (50 ppm) y preparada como se describe en los documentos técnicos respectivos de cada patente (^{Castro-Rosas y Gómez-Aldapa, 2019a}; ^b; ^c). Se evaluó además el efecto de una mezcla de vinagre blanco (La Costeña^®) y jugo fresco de limón 1:1 (v/v) (T5). El vinagre fue una presentación comercial de alcohol de caña al 5 % de acidez y metabisulfito de sodio. El jugo de limón se extrajo con un exprimidor de limones lavados con agua de la llave. La solución de ácido láctico se preparó diluyendo un volumen de ácido en un volumen de agua destilada estéril. Tanto la mezcla de vinagre y jugo de limón como la solución de ácido láctico se prepararon al momento de su utilización. En el Cuadro 1 se indican los tratamientos (T) establecidos, así como las características de concentración y pH de los desinfectantes. Los tratamientos T1 a T6 se aplicaron por inmersión del tejido a las 18 h después de la inoculación con Salmonella o APA 0.1 %; para ésto, la rodaja del tejido (5 g) inoculado se extrajo con un sacabocado estéril (4.5 cm de diámetro) y se sumergió en un recipiente de plástico nuevo de 100 mL (Bosco^®, México) con 45 mL de desinfectante (T1, T2, T3, T4 o T5) o agua destilada estéril (T6) por 10 min; después, el tejido tratado se sumergió en un recipiente nuevo con 45 mL de agua destilada estéril por 3 s para enjuagar el tejido. Los tratamientos T6, T7 y T8 (testigos) se incluyeron para conocer el efecto de arrastre durante el proceso de enjuague del tejido (T6), el número de células viables de Salmonella al momento de aplicar el desinfectante (T7) y la presencia de Salmonella en los cladodios previo a la inoculación (T8).

Diseño y unidad experimental

Se estableció un diseño en bloques completos para contrastar el efecto de la variedad (bloque) y del desinfectante (tratamiento). Así mismo, se establecieron dos diseños completamente aleatorios; uno para la comparación del pH, donde se comparó el efecto de las variedades, y otro para la comparación del color, donde para cada variedad se hizo la comparación en comento. En total se establecieron dos experimentos por tratamiento y por variedad de nopal; se utilizaron tres repeticiones y la unidad experimental consistió de un cladodio. Previo a la aplicación de los tratamientos, se estimó el pH del tejido en tres diferentes puntos (punta, centro y base) del cladodio de cada variedad de nopal (n = 12), con un potenciómetro portable (Modelo 213 HI 98230, Hanna Instruments, Nusfalau, Rumania). La efectividad del desinfectante se definió mediante la diferencia entre los valores (log₁₀ de UFC mL^-1) obtenidos con el tratamiento T7 sin desinfectante y el tratamiento respectivo con desinfectante (T1, T2, T3, T4 o T5).

Cuantificación de la población de Salmonella

Inmediatamente después del tratamiento, cada rodaja de tejido se colocó en una bolsa de plástico Ziploc^® estéril (17.7 × 19.5 cm) con 45 mL de APA 0.1 % y se maceró en un molino (Seward^® 400 Circulator, Bohemia, NY, EUA) a 300 unidades g por 120 s. Del macerado obtenido se tomaron dos muestras, una de 100 μL para siembra directa en agar entérico Hektoen (BD Bioxon^®) adicionado con Km⁵⁰ (AEH- Km⁵⁰) y otra de 1 mL para hacer diluciones seriales en APA 0.1 %. De cada dilución, se tomaron 100 μL para siembra en AEH-Km⁵⁰; transcurridas 72 h a 33 ± 2 °C se realizó el conteo de colonias típicas de Salmonella; asimismo, se tomaron muestras de los tratamientos residuales T1 a T5 y del agua de enjuague para siembra directa; sin embargo, en estas muestras no se detectaron colonias de Salmonella en AEH-Km⁵⁰.

Efecto de los desinfectantes en el color del tejido

Se registraron cambios en el color (L*, índice de oscurecimiento o luminosidad) del tejido de cada cladodio, de cada variedad, con un colorímetro (Serie 5348, Modelo XE Plus No. 45, HunterLab, MiniScan™, Mentor, OH, EUA), antes y después de aplicar los tratamientos T1 a T6 (^{McGuire, 1992}).

Análisis estadístico

Los datos en UFC mL^-1 se analizaron con el paquete estadístico R × 64 3.4.1, la regresión de Poisson y la comparación de efecto de tratamiento (P ≤ 0.05). Las diferencias de pH entre variedades se analizaron por Kruskal-Wallis. El efecto del desinfectante en el color del tejido se determinó con un análisis de varianza y la prueba de comparación de medias de Tukey (P ≤ 0.05).

Efecto del desinfectante en la población de Salmonella

Es práctica común utilizar mezclas de cepas de un mismo género, especie, o como en este trabajo, de diferentes serotipos de un mismo género para realizar estudios del comportamiento de los microorganismos en alimentos o para evaluar procesos de desinfección de productos hortofrutícolas (^{Beuchat et al., 2001}). La información del comportamiento de la mezcla de cepas bacterianas proporciona información robusta, con la ventaja de ahorro de tiempo y material, al realizar un estudio con la mezcla que al realizar estudios individuales. Por otro lado, la evidencia científica disponible muestra que, en diferentes casos, no es necesario realizar estudios del comportamiento de bacterias patógenas con cepas de manera individual para diferentes estudios en alimentos.

Los tratamientos por inmersión con desinfectante T1 ácido láctico, T2 extracto metanólico, T3 extracto acetónico, T4 extracto acuoso y T5 mezcla de vinagre y jugo de limón, redujeron significativamente (P ≤ 0.05) la población de Salmonella en el tejido de nopal verdura fresco sin espinas en comparación con el tratamiento T6 agua destilada estéril; sin embargo, entre los tratamientos con desinfectante no se observaron diferencias (P > 0.05) (Cuadro 2). Al comparar la media de la población registrada con los tratamientos T6 agua destilada estéril y T7 sin desinfectante ni agua destilada estéril se observaron diferencias (P ≤ 0.05) (Cuadro 2). Estas diferencias entre los tratamientos T6 y T7 pueden estar relacionadas con un efecto de “arrastre” de células no adheridas (0.3 log₁₀ mL^-1, en promedio) durante la inmersión del tejido en el agua destilada estéril del T6. Con el tratamiento T8 sin desinfectante ni agua destilada estéril no se detectaron células presuntivas de Salmonella. Estos resultados indican que los cladodios utilizados en este estudio estaban libres de células de Salmonella y que las poblaciones recuperadas con los tratamientos T1 a T6 corresponden a las del inóculo aplicado.

En el análisis estadístico donde se contrastaron los tratamientos T1 a T7, la regresión de Poisson y la prueba de comparación de efectos de tratamientos encontraron y diferenciaron (P ≤ 0.05) tres grupos (Cuadro 2). Los Grupos 1 y 2 conformados por los tratamientos T7 y T6, respectivamente, se caracterizaron por presentar numerosas colonias (4.05 log₁₀ UFC mL^-1 en promedio) de Salmonella; en contraste, el Grupo 3, tratamientos T1 a T5, presentó menos de la mitad de las colonias (1.98 log₁₀ UFC mL^-1) registradas entre los Grupos 1 y 2.

Al estimar la media de reducción por tratamiento (T1 a T5) en la población de Salmonella, ésta se encontró entre 2.06 ± 0.5 log₁₀ UFC mL^-1 (T4 extracto acuoso de jamaica) y 2.85 ± 1.0 log₁₀ UFC mL^-1 (T5 mezcla de vinagre y jugo de limón) (Cuadro 3). Estos resultados contrastan con la media en reducción obtenida con el T6 agua destilada estéril (0.3 log₁₀ mL^-1). Lo anterior revela la importancia de incluir un desinfectante en el proceso de lavado y enjuague de los cladodios de nopal, previo a su consumo en fresco, para reducir el riesgo de enfermedad por Salmonella, en caso de contaminación accidental (^{Zhang et al., 2020}).

Por otra parte, al comparar las medias de la población de Salmonella (Cuadro 2) y las medias de la reducción de la concentración de Salmonella (Cuadro 3), en ambos casos se encontraron diferencias (P ≤ 0.05) entre variedades de nopal. Estas diferencias en la población y en la reducción de la concentración después de la desinfección entre variedades se explica principalmente por las diferencias (P ≤ 0.05) de pH (Cuadro 2). En Milpa Alta y Villanueva, con pH promedio de 4.1, se registró mayor reducción (0.7 ± 0.2 log₁₀) en la población de Salmonella que en Atlixco y Copena V1, con pH promedio de 4.7 (Cuadro 2). Todas las soluciones desinfectantes utilizadas en el presente estudio contenían ácidos orgánicos (láctico, acético o cítrico); en éstos, la forma activa es la forma no disociada del ácido, cuya concentración se incrementa al disminuir el pH del medio (^{Fernández, 2008}), por lo que es de esperar que a pH 4.1 se tenga mayor concentración de formas no disociadas que a pH 4.7, y en consecuencia, se registre mayor efecto antimicrobiano de las soluciones a pH 4.1 que a pH 4.7 (Cuadros 2 y 3).

En este estudio, los resultados obtenidos con el tratamiento T1 ácido láctico en la reducción en la población de Salmonella son semejantes a los previamente reportados para nopal verdura fresco sin espinas (^{Hernández-Anguiano y Landa-Salgado, 2016}); así mismo, los resultados registrados con los desinfectantes patentados de los tratamientos T2, T3 y T4 son semejantes a los obtenidos sólo con extractos de jamaica cuando se aplicaron a rodajas de zanahoria y hojas de cilantro (con poco o ningún exudado vegetal), donde la población de Salmonella se redujo entre 2.0 y 2.5 log₁₀ mL^-1 (^{Gutiérrez-Alcántara et al., 2016}; ^{Rangel-Vargas et al., 2017}). En el presente estudio, los tres desinfectantes patentados aplicados a los cladodios de nopal contenían cuatro veces menos concentración de extracto de jamaica (1 %) que las soluciones de extracto de jamaica (5 %) previamente utilizadas para desinfectar zanahoria y cilantro (^{Gutiérrez-Alcátara et al., 2016}; ^{Rangel-Vargas et al., 2017}). Lo anterior indica que aún en tejido con alta producción de exudados vegetales, como lo es el del nopal verdura, los tres desinfectantes patentados y con mucho menor concentración de extracto de jamaica que lo reportado en otros estudios, mantuvieron su actividad antimicrobiana.

Por otra parte, con el tratamiento T5 mezcla de vinagre blanco y jugo de limón se recuperaron células de Salmonella (1.85 ± 0.6 log₁₀ UFC mL^-1, en promedio) en todas las variedades de nopal, con excepción de Villanueva (Cuadro 2). Se ha reportado (^{Sengun y Karapinar, 2005}; ²⁰⁰⁴) que la mezcla de vinagre de uva y jugo fresco de limón ocasiona reducción a nivel indetectable en las poblaciones de S. Typhimurium en arúgula y cebolla a los 15 min de tratamiento, y en zanahoria a los 30 min. Las diferencias en la actividad antimicrobiana entre los estudios se puede atribuir al tiempo de inmersión del tratamiento, así como a las características propias del tejido tratado (con poca o ninguna producción de exudados vegetales).

Efecto del desinfectante en el color del tejido de nopal

Con excepción del tratamiento T5 mezcla de vinagre y jugo de limón, los tratamientos T1 a T4 no afectaron significativamente (P ≤ 0.05) la luminosidad o el índice de oscurecimiento del tejido de nopal verdura, en comparación con la luminosidad registrada en el testigo T6 agua destilada estéril (Figura 1).

Figura 1 Luminosidad del tejido de nopal verdura después del tratamiento con desinfectantes (T1 a T5) o agua destilada estéril (T6). Las barras refieren la media de la diferencia (± D.E.) de los valores de L* antes y después de la aplicación del tratamiento: (T1) ácido láctico 1.5 %, (T2) extracto metanólico, (T3) acetónico, y (T4) acuoso de cálices de jamaica, (T5) mezcla de vinagre y jugo de limón 1:1 (v/v) y (T6) agua destilada estéril. Medias con letras iguales no son estadísticamente diferentes (Tukey, P ≤ 0.05). 

En contraste, el tratamiento T5 afectó significativamente (P ≤ 0.05) la luminosidad del tejido en comparación con la luminosidad registrada en los tratamientos con desinfectante T1 a T4 y T6 agua destilada estéril (Figura 1). La superficie del tejido de los cladodios con T5 se observó con aspecto blanquecino. Es sabido que tiempos prolongados de sanitización pueden afectar componentes de calidad como son el color, textura y sabor de los productos hortofrutícolas frescos (^{Sagong et al., 2011}; ^{Ramos et al., 2013}). El problema de la alteración del color del tejido con el tratamiento T5 se podría superar si se reduce el tiempo de exposición o bien se exploran otras concentraciones de la mezcla sin afectar su efecto antimicrobiano, debido a que la mezcla de vinagre y jugo de limón resultó ser una solución antimicrobiana natural y de fácil preparación para la desinfección de los cladodios de nopal verdura sin espinas.

Para la inocuidad del nopal verdura es importante contar con un desinfectante efectivo como medida preventiva; sin embargo, la implementación de buenas prácticas agrícolas y de manejo durante la producción, cosecha y empacado o en la distribución y comercialización de este cultivo es altamente recomendable para la prevención de enfermedades ocasionadas por microorganismos patógenos que pudieran alojarse en este producto de consumo en fresco (^{Angeles-Núñez et al., 2014}).