Localización y muestreo de plantas enfermas

La investigación se realizó en el Laboratorio de Fitopatología del Centro de Estudios Profesionales del Colegio Superior Agropecuario del Estado de Guerrero (CEP-CSAEGRO), ubicado en el kilómetro 14.5 de la carretera Iguala-Cocula (18º 14’ 00’’ N y 99º 40’ 00’’ O), a 640 m de altitud. En esta región predomina un clima tropical seco Awo(w)(i)g. El muestreo de plantas se realizó en una parcela comercial (1 ha) de jitomate de la variedad Rio Grande de dos meses de edad, con alrededor de 12 % de plantas enfermas. Mediante recorridos en el cultivo se localizaron plantas con síntomas de enanismo, clorosis y marchitez del follaje y se colectaron al azar raíces de 10 plantas enfermas.

Aislamiento y purificación del hongo

Se seleccionaron raíces secundarias del total de la muestra, se lavaron con agua y jabón y se cortaron segmentos de 5 mm de largo, que contenían tejido sano y enfermo. Posteriormente, los segmentos se desinfectaron por inmersión en hipoclorito de sodio al 1 % por 30 a 60 segundos y se enjuagaron con agua destilada estéril. Cinco segmentos se depositaron sobre dos portaobjetos en cámara húmeda preparada en una caja Petri ^{(Keyworth, 1951)}. Se hicieron cinco repeticiones y se incubaron por cinco días en el laboratorio de Fitopatología a temperatura ambiente de 28 + 1 ^oC, fotoperiodo natural luz/oscuridad (12 h/12 h) y 45 % de humedad relativa.

De los segmentos de tejido colonizados con micelio y conidios se realizó el estriado de conidios sobre medio de cultivo agua-agar (A-A) y después de 24 h se transfirieron conidios individuales a nuevo A-A en caja Petri para obtener 10 cepas monospóricas del hongo ^{(Leslie y Summerell, 2006)}, las cuales se incubaron por 3 días y se preservaron en A-A en tubo de ensayo a 4-5 ºC.

Identificación morfológica y molecular del agente causal de la pudrición radical y marchitez en jitomate

Se utilizaron colonias de cinco días de incubación en medio de cultivo papa-dextrosa agar (PDA), a temperatura ambiente (28 ± 2 ºC) y fotoperiodo natural (12 h/12 h). Se hicieron preparaciones en lactofenol claro del micelio y esporas del hongo, tomando en cuenta las características morfológicas de los micro y macronidios, fiálides y presencia de clamidosporas observadas en el microscopio (objetivos 40X y 100X) y con las claves de ^{Leslie y Summerell (2006)} y ^{Watanabe (2010)} se realizó la identificación de los aislados monospóricos del hongo. Para la identificación molecular se utilizaron colonias fungosas cultivadas por siete días en PDA; con estas mismas colonias se realizó la extracción de ADN, siguiendo el procedimiento comercial del DNAzol ES (molecular research center). Se realizó la amplificación por PCR de las regiones internas transcritas ITS1 e ITS2 del ADN ribosomal y del fragmento del gen del factor de elongación de la traducción (TEF-1α), utilizando el par de oligonucleótidos de secuencia ITS1 (5´-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3´) e ITS4 (5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´) ^{(White et al., 1990)}; y EF-1 (5´-GTTAAGAGGCGCGGTGTCGGTGTG-3´) y EF-2 (5´-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3´) ^{(Hsuan et al., 2011)}. Se obtuvieron amplicones de 500 pb para ITS y 700 pb aproximadamente para TEF-1α. Las secuencias fueron comparadas con las secuencias reportadas en la base de datos del banco de genes del NCBI (National Center for Biotechnology Information) mediante el software BLAST-N (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) para la identificación del hongo.

Postulados de Koch

Se utilizaron 22 plantas de la variedad Río Grande, cultivadas previamente en almácigo por 30 días en arena de río estéril en vasos de poliestireno Nº 12. La multiplicación de inóculo del hongo se realizó en glumas de avena esterilizadas en matraces Erlenmeyer de 500 mL, en los cuales se inocularon por separado discos de A-A (Ø = 5 mm) de tres aislamientos monospóricos del hongo, de 10 días de incubación previa en A-A. Se hicieron dos repeticiones y se utilizó un testigo de cada aislado, lo cuales fueron incubados a ± 28 ºC por 15 días, hasta que el hongo colonizó las glumas. Previo a la inoculación se preparó sustrato infestado, mezclando 30 g de arena esterilizada con 30 g de glumas + el hongo (3.5 × 10⁸ ufc g^-1), mezcla utilizada para llenar vasos de poliestireno (N° 12) en los que se trasplantó la planta sana de jitomate de 30 días de cultivo en el almácigo. De cada cepa monospórica se hicieron cinco repeticiones y se utilizaron dos plantas como control. Las plantas se mantuvieron en invernadero y se inspeccionaron en forma continua hasta la manifestación de síntomas de marchitez. Se realizó el reaislamiento del hongo para finalizar los postulados de Koch ^{(Agrios, 2005)}.

Ensayo I. Efecto de Trichoderma spp. contra el hongo fitopatógeno

El primer ensayo consistió en evaluar la antibiosis de los metabolitos secundarios de Trichoderma, difusibles en medio de cultivo papa-dextrosa-agar (PDA), contra el hongo patógeno; para lo cual se utilizaron los siguientes tratamientos: T1: Testigo, T2: Trichoderma sp. (Cepa nativa de Iguala), T3: Trichoderma asperellum (Cepa nativa de Cocula), T4: Trichoderma virens G-41 (PHC^® ROOTMATE^®), T5: Trichoderma harzianum (LABRADOR^®). Los tratamientos se distribuyeron en un diseño completamente al azar con cuatro repeticiones. Cada una de las 20 unidades experimentales fue una caja Petri con 20 mL de PDA mezclado con los metabolitos secundarios difusibles producidos por Trichoderma spp. Las cepas comerciales de este hongo se mantuvieron en PDA a 4-5 ºC en el laboratorio de Fitopatología.

Las cepas de Trichoderma nativas de Iguala y Cocula se obtuvieron en cultivo monospórico (Waller et al., 2002), mediante la técnica de dilución en placa, las cuales se identificaron morfológicamente ^{(Watanabe, 2010)} y se transfirieron a PDA en tubos de ensayo para la preservación del hongo. Todas las cepas de Trichoderma se reactivaron transfiriéndolas del PDA en tubo de ensayo a PDA en cajas Petri, dos días antes de iniciar el bioensayo. Para medir la efectividad de metabolitos secundarios extracelulares difusibles en el medio de cultivo producidos por las cepas de Trichoderma spp. se utilizó la técnica de la membrana de celofán ^{(Hoda et al., 2016)}, en un diseño experimental completamente al azar con cinco repeticiones. La unidad experimental fue la caja de Petri con 20 mL de PDA, que contenía los metabolitos secretados por las cepas de Trichoderma. En el centro de la caja se sembró el hongo patógeno de ocho días de incubación en PDA. Las cajas se incubaron a ± 28 ºC y fotoperiodo natural en el laboratorio. Diariamente se midió el diámetro de la colonia del hongo durante 144 horas (seis días) y con estos datos se obtuvo el porcentaje de inhibición del crecimiento micelial del patógeno ^{(Patil et al., 2014}; ^{Barari y Foroutan, 2016)}, al cual se le realizó el análisis de varianza y prueba de Tukey ^{(SAS Institute, 2019)}.

Ensayo II. Efecto in vitro de pesticidas químicos y botánicos sobre el hongo fitopatógeno

En este ensayo se evaluaron en 20 mL^-1 de PDA seis fungicidas químicos, tres compuestos botánicos y un testigo: T1: Testigo, T2: oxicloruro de cobre 0.06 g (Cupravit^®), T3: captan 0.044 g (Captan^®), T4: carbendazim 0.03 g (Bavistin^®), T5: mancozeb 0.05 g (Manzate^®), T6: Ditiocarbamato de zinc 0.05 g (Zineb^®), T7: benomilo 0.009 g (Promyl^®), T8: extracto de canela Cinnamomun zeylanicum 0.05 mL (Qanum^®), T9: extracto de ajo Allium canadense 0.01 mL (Edoca Allium^®), T10: extracto de neem Azadirachta indica 0.01 mL (Niimax^®).

Los 10 tratamientos se distribuyeron completamente al azar con cinco repeticiones. Cada una de las 50 unidades experimentales fue una caja de Petri como la utilizada en el Ensayo I. Los productos químicos y orgánicos, adquiridos en el mercado de agroquímicos. se evaluaron con la técnica del medio de cultivo PDA envenenado ^{(Kumar y Mane, 2017)}, por lo que se preparó el PDA repartido en tubos de ensayo (dosis: 20 mL/tubo). Posterior a la esterilización se dejó enfriar el medio (+ 40 ^oC) y los 20 mL de PDA se vaciaron sobre el producto vegetal o químico vertido antes en el fondo de la caja, la cual se agitó suavemente para homogenizar la mezcla. Después de solidificar a temperatura ambiente en el centro de la caja se sembró un disco de PDA (Ø = 5 mm) con F. solani, de 11 días de edad, incubado antes en PDA. Las cajas se sellaron con cinta parafilm y se incubaron a ± 28 °C con fotoperiodo 12/12. El diámetro de la colonia del hongo se midió diariamente durante 144 horas, con lo cual se obtuvo el porcentaje de inhibición del crecimiento micelial del patógeno. En este ensayo también se realizó el mismo análisis estadístico realizado en Ensayo I.

Identificación morfológica y molecular del agente causal de la pudrición radical y marchitez en jitomate

Se identificó a Fusarium solani como responsable de la infección de raíz de jitomate. El aislamiento monospórico del hongo creció 0.05 cm dia^-1, desarrolló micelio septado, hialino, con crecimiento blanco algodonoso, que se tornó de color rosa pálido o morado suave al madurar. El hongo produjo microconidios hialinos, elipsoides y con una a dos células, macroconidios con tres a cinco células, que se adelgazaron gradualmente y se encorvaron hacia los extremos; las clamidosporas fueron marrones, globosas y usualmente solitarias. Las características morfológicas fueron similares a las descritas para Fusarium solani, por ^{Watanabe (2010)} y ^{Leslie y Summerell (2006)}. Los productos obtenidos de la región intergénica interna ITS y del factor de elongación de la traducción (TEF-1α) presentaron fragmentos de 500 y 700 pares de bases, respectivamente, con los siguientes números de acceso KY923274.1 y KY923280.1. La comparación de estas secuencias a través del banco de datos de genes (NCBI) indicó que tuvieron 99 y 100% de similitud con Fusarium solani.

Prueba de patogenicidad

Se comprobó que el aislamiento monospórico de Fusarium solani es patogénico, porque provocó síntomas de pudrición de raíz y marchitez en las plantas sanas de jitomate a los ocho días después de la inoculación. Las plantas utilizadas como testigo permanecieron sanas, mientras que en las inoculadas hubo reducción del crecimiento y amarillamiento del follaje. El reaislamiento del hongo presentó los mismos síntomas que provocó el aislamiento originalmente inoculado, con lo que se cumplieron los postulados de Koch ^{(Agrios, 2005)}.

Ensayo I. Efecto de metabolitos extracelulares de Trichoderma spp. sobre Fusarium solani

En el diámetro de las colonias del hongo hubo diferencias altamente significativas (P<0.0001) en todas las horas de medición de esta variable, con excepción de la evaluación realizada a las 24 h. El hongo creció a una tasa promedio de 1.33 cm dia^-1. En los tratamientos con los metabolitos producidos por Trichoderma sp. (nativa de Iguala) y T. virens G-41 se presentó el menor crecimiento de F. solani (Cuadro 1); el testigo presentó el mayor promedio del diámetro. Las dos cepas mencionadas provocaron el máximo porcentaje de inhibición, con 79.19 y 77.81 %, respectivamente. T. asperellum y T. harzianum inhibieron 39.06 y 49.37 % el crecimiento de F. solani. En el testigo, el hongo tuvo 100 % de crecimiento (Cuadro 1). ^{Ommati y Zaker (2012)} observaron que T. asperellum y T. harzianum inhiben el crecimiento de F. solani en 44.33 y 34.33 %, respectivamente. Por otro lado, ^{Da Silva et al. (2014)} observaron que T. asperellum y T. harzianum inhiben a F. solani entre 51.9 a 69.8 % y 49.5 a 64.9 %, respectivamente, resultados superiores a los obtenidos en el presente estudio.

De acuerdo con ^{Vargas-Hoyos et al. (2012)}, la antibiosis ejercida por Trichoderma spp. se debe a la producción de metabolitos tóxicos y antibióticos, como la gliotoxina, trichodermina, viridina, suzakacilina, alamectina, demadina, trichotecenos y trichorzianina, los cuales son responsables de inhibir el crecimiento de hongos patógenos. También, la inhibición del crecimiento de los hongos fitopatógenos por Trichoderma spp. se debe a que este biocontrolador se adapta pronto a condiciones de crecimiento in vitro y coloniza rápidamente el espacio ^{(Vargas-Hoyos et al., 2012}; ^{Singh et al., 2014}; ^{Ruano-Rosa et al., 2014)}. Por otro lado, ^{González et al. (2012)} indican que la actividad enzimática quinolítica y glucanolítica de Trichoderma asperellum actúa contra un amplio rango de hongos y es efectiva para inhibir totalmente la germinación de esporas de Botrytis cinerea, Fusarium solani, Fusarium graminearum y Phytium sp.

Ensayo II. Efecto de pesticidas químicos y botánicos contra Fusarium solani

Se encontraron diferencias altamente significativas (P<0.0001) provocadas por efecto de los tratamientos sobre el crecimiento de las colonias de F. solani (Cuadro 2). Todos los tratamientos químicos tuvieron efecto fungicida, a excepción del zineb, que junto con los extractos orgánicos presentan actividad fungistática sobre el patógeno. En los tratamientos con los fungicidas químicos oxicloruro de cobre, captan, carbendazim, mancozeb y benomilo se obtuvo 100 % de efectividad biológica en el control de F. solani, con zineb 33.8 % y con los pesticidas botánicos de 30 a 43.8 % (Cuadro 2).

En condiciones in vitro ^{Fareed et al. (2015)} evaluaron la efectividad de oxicloruro de cobre sobre F. oxysporum f. sp. cucumerinum, causante de la marchitez en pepino, y encontraron como mayor inhibición 49.65 %, porcentaje menor que el 100 % obtenido en el presente estudio, con el mismo ingrediente activo probado contra F. solani. El efecto fungitóxico obtenido con este fungicida se debe a que los iones de cobre reaccionan con componentes de ciertos aminoácidos, provocando la desnaturalización de las proteínas y enzimas, lo que altera los sistemas de transporte de energía y la integridad de la membrana en la célula fungosa ^{(FRAC, 2018)}. Asimismo, el benomilo fue utilizado por ^{Amini y Sidovich (2010)} en condiciones in vitro contra F. oxysporum f. sp. lycopersici y reportaron que este producto químico inhibió 94 y 100 % al patógeno, respectivamente. Estos resultados son similares a los obtenidos en la presente investigación, en donde el fungicida también suprimió 100 % el crecimiento del hongo, quizá porque este compuesto benzimidazol penetra a la célula fúngica y reacciona con las proteínas formando quelatos y desalojando metales esenciales e hidrógeno ^{(Pemán et al., 2009)}. En otra investigación, ^{Da Silva et al. (2014)} estudiaron in vitro el efecto del mancozeb sobre F. solani y reportaron que este pesticida inhibió 42.5 % el crecimiento del micelio del patógeno, valor inferior al 100 % obtenido en el presente trabajo con el mismo tratamiento. De acuerdo con la ^{FRAC (2018)}, el mancozeb tiene un modo de acción multisitio, por lo que es de amplio espectro y protector; actúa formando compuestos que se unen con grupos sulfhidrilo de aminoácidos y provoca desnaturalización de las proteínas y enzimas y, consecuentemente, suprime el crecimiento del patógeno. El captan es fungitóxico, debido a que afecta el transporte de energía en las mitocondrias y el funcionamiento fisiológico de las membranas en las células fungosas y obstruye la actividad de las enzimas sulfhídricas, con lo que ocurre liberación de tiofosgeno que mata al patógeno ^{(FRAC, 2018)}. ^{Türkkan y Erper (2015)} observaron que en condiciones in vitro el captan inhibió 100 % a Fusarium spp., resultado similar al promedio de 100 % obtenido con este tratamiento en el presente experimento. Bolívar et al. (2009) evaluaron la antibiosis ejercida por diferentes compuestos botánicos contra Colletotrichum gloeosporioides y encontraron porcentajes de inhibición entre 19.9 y 37.1 %, inferiores a los obtenidos en la presente investigación. Por su parte, ^{Joseph et al. (2008)} reportan al extracto de neem como un tratamiento efectivo y recomendado como preventivo para el manejo de la marchitez de la berenjena causada por F. solani.