INTRODUCCIÓN

Los agaves son plantas monocotiledóneas, siempre verdes, generalmente suculentas y endémicas de América; se distribuyen desde los 34° latitud norte hasta los 60° latitud sur, área que coincide con el centro de diversificación del género en México. La distribución del género abarca desde el sur de los Estados Unidos hasta Colombia y Venezuela; esta área incluye todas las islas del Caribe, desde las Bahamas a Aruba, Curaçao y Trinidad y Tobago (^{García, 2007}). Los agaves tienen una amplia distribución en México, encontrándose en más del 75 % de su territorio. Aproximadamente 150 de sus 200 especies se encuentran en este país y el 55 % crecen exclusivamente en México (^{CONABIO, 2006}; ^{García, 2007}). Las plantas de agave han sido utilizadas desde tiempos prehispánicos para una gran variedad de aplicaciones alimenticias, textiles, de la construcción y fines domésticos. En la actualidad los agaves o magueyes son explotados primordialmente para la producción de fibras y bebidas alcohólicas tales como tequila y mezcal (^{Colunga-GarcíaMarín y Zizumbo-Villarreal, 2007}), aunque más recientemente se ha buscado diversificar el uso de los agaves en la industria alimenticia; por ejemplo, para la fabricación comercial de inulina y jarabe a partir del agave azul (^{López y Urías-Silvas, 2007}).

Las prácticas agronómicas para la gestión del agave no han cambiado mucho en los últimos años, a pesar de los avances tecnológicos registrados en otros cultivos de importancia como el maíz, frijol, cebada y hortalizas, en particular aquellas relacionados con su manejo biotecnológico/microbiológico que tienen por objetivo aumentar la productividad y sanidad de las cosechas, minimizar la aplicación de agroquímicos y reducir su impacto en el ambiente. Actualmente existe una fuerte tendencia, no solo en México sino en todo el mundo, para modificar la manera en que se practica la agricultura (^{Dutta y Thakur, 2017}). La implementación de este nuevo modelo agrícola ha sido motivada por el aumento constante en los precios de los agroquímicos, por la concientización de los efectos perjudiciales del uso de estos productos en el ambiente y en la salud humana, pero principalmente por los precios que las comercializadoras extranjeras están dispuestas a pagar por los productos agrícolas libres de pesticidas químicos (alrededor de un 30 % más que por los productos convencionales). En esta nueva forma de practicar la agricultura el uso de microorganismos es fundamental para alcanzar las metas proyectadas en cuanto a sanidad, producción y calidad de las cosechas (^{Aguado-Santacruz, 2012}). Estudios previos en agave han logrado el aislamiento de diferentes microorganismos, pero la identificación de bacterias endófitas es un área que se ha abordado poco, a pesar de su importancia económica. Entre los trabajos realizados a la fecha se puede mencionar el de ^{Martínez-Rodríguez et al. (2014)}, quienes a partir de la base de pencas de Agave tequilana lograron aislar una gran diversidad de bacterias; parte de las cuales pudieron ser confirmados como bacterias promotoras de crecimiento por sus capacidades bioquímicas para fijar nitrógeno, producir auxinas, solubilizar fosfatos o por sus actividades de biocontrol contra Fusarium oxysporum; sin embargo, los autores no presentaron evidencia de las capacidades de promoción de crecimiento de los microorganismos in vivo.^{Desgarennes et al. (2014)} analizaron mediante un enfoque metagenómico las comunidades bacterianas diazotróficas presentes en la rizósfera, filósfera y la endósfera de raíz y hoja de las especies Agave tequilana y A. salmiana; los autores encontraron una diferencia clara entre las comunidades de bacterias presentes en el suelo, la filósfera y la endósfera de raíz y hoja. Estos autores lograron el aislamiento de 18 cepas bacterianas en un medio libre de nitrógeno, de las cuales ocho provinieron de la endósfera de raíz y rizósfera de A. tequilana, y 10 de la endósfera de raíz, la rizósfera y filósfera de A. salmiana. Los aislamientos de la endósfera de A. tequilana pertenecieron a la familia Enterobacteriaceae, mientras que en A. salmiana se identificaron dos miembros de Enterobacteriaceae y una bacteria del género Stenotrophomonas. Por su parte, ^{Coleman-Derr et al. (2016)}, también bajo un enfoque de metagenómica, analizaron las comunidades microbianas presentes en la rizósfera, filósfera y la endosfera de raíz y pencas de las mismas especies de agave, y de la especie A. deserti, encontrando que la composición de las comunidades procarióticas estuvo determinada principalmente por el propio hospedero, mientras que la estructura de las comunidades fúngicas estuvo influenciada primordialmente por la biogeografía de la especie hospedera. Aunque no encontraron diferencias en la riqueza microbiana de las tres especies de Agave, si detectaron menores niveles en la diversidad bacteriana en las plantas cultivadas de A. tequilana comparadas con la observada en los agaves nativos. El objetivo de la presente investigación fue conocer la endomicrobiota bacteriana del agave pulquero y su localización dentro de las pencas de agave y, con base en la identidad y las actividades de los microorganismos descritas previamente en la literatura, establecer algunos de los posibles mecanismos bacterianos que contribuyen al crecimiento y desarrollo de estas plantas.

MATERIALES Y MÉTODOS

RESULTADOS

Después de colocar los fragmentos de cada tipo de agave muestreados en los medios de selección, fue posible observar colonias bacterianas entre 5 y 8 d después de la incubación a 30 °C. Se aisló un total de 103 bacterias a partir de los cinco tipos de agave; de éstos, 30 correspondieron a Bacillus putativos aislados en medio BS, 12 a Pseudomonas y 61 a bacterias diazotróficas; la cantidad de bacterias diazotróficas aisladas en medio Rojo Congo (30) fue muy semejante a la cantidad de bacterias diazotróficas aisladas en medio Elmarc (31). Debido a que tanto el medio ELMARC como el Rojo Congo están diseñados para lograr el aislamiento de bacterias fijadoras de nitrógeno, se pudo reducir la cantidad total de microorganismos aislados a sólo 72, al considerar solamente las bacterias diazotróficas aisladas en medio Rojo Congo. El mayor número de aislamientos bacterianos se obtuvo a partir de los tipos Carricillo (31) y Ayoteco (26), y el menor en Manso (13). En forma global, la mayor cantidad de aislamientos bacterianos se obtuvieron a partir de las porciones superiores de las pencas (44), mientras que de las secciones media e inferior se obtuvieron 35 y 24 microorganismos, respectivamente. Las secuencias obtenidas del gen para ARNr 16S de cada aislamiento se analizaron y se llevó a cabo su comparación en la base de datos del NCBI para establecer la identidad de las bacterias endófitas y su redundancia por origen; es decir, por su procedencia de una misma penca, logrando reducir el número inicial de 72 aislamientos a 35 especies de bacterias, las cuales son enlistadas en el Cuadro 1 para cada tipo de agave. Considerando esta depuración de microorganismos se pudo observar que la frecuencia de especies de bacterias endófitas en cada tipo de agave se redujo a 7, 11, 3, 5 y 9 para Ayoteco, Carricillo, Chalqueño, Manso y Púa Larga, respectivamente (Cuadro 1); asimismo, esta reducción de microorganismos cambió la frecuencia de especies bacterianas de tal modo que las secciones media (15) y superior (14) mostraron un número semejante de especies entre ellas, pero mayor al detectado en la parte inferior de las pencas (seis) (Cuadro 1). El número total de especies bacterianas únicas detectadas en los cinco tipos de agave fue de 19, siendo el endomicrobioma de Carricillo el más diversificado (nueve especies), mientras que el de Chalqueño presentó una menor riqueza bacteriana (tres especies). Ayoteco, Manso y Púa Larga presentaron cinco especies bacterianas únicas (Cuadro 2). En forma global, los géneros mayormente representados en los cinco tipos de agave fueron Bacillus con 12 entradas y Enterobacter y Leclercia con siete entradas cada uno (Cuadro 2). Bacillus subtilis y Leclercia sp. fueron las especies más representadas en los agaves muestreados, encontrándose en tres de los cinco tipos analizados; B. subtilis fue parte del endomicrobioma de Ayoteco, Carricillo y Púa Larga, mientras que Leclercia sp. se presentó en Carricillo, Manso y Púa Larga (Cuadro 2).

DISCUSION

En la presente investigación se lograron identificar, mediante un enfoque molecular, bacterias endófitas cultivables in vitro, aisladas a partir de cinco tipos de agave pulquero. Hasta donde se conoce, éste es el primer estudio realizado en variedades de agave pulquero para conocer el microbiota endófito existente en este cultivo. Anteriormente, ^{Martínez-Rodríguez et al. (2014)} analizaron el microbiota endófito de A. tequilana a partir de bases de pencas; estos autores identificaron en este agave 11 especies bacterianas: Acinetobacter sp., A. baumanii, A. bereziniae, Cronobacter sakazakii, Enterobacter hormaechei, Bacillus sp., Klebsiella oxytoca, Pseudomonas sp., Enterococcus casseliflavus, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides y Gluconobacter oxydans. Las coincidencias en cuanto a los géneros bacterianos encontrados en la presente investigación con la realizada por ^{Martínez-Rodríguez et al. (2014)} incluyeron a Acinetobacter sp., Enterobacter sp., Pseudomonas sp. y Bacillus sp. En el presente estudio destacaron los tipos Carricillo y Púa Larga por poseer la mayor cantidad de bacterias endófitas; sin embargo, Carricillo, con nueve, fue el tipo que sobresalió por presentar la mayor diversidad de especies bacterianas (Cuadro 1). Siete de las 19 especies encontradas en los agaves se ubicaron en el grupo de las Enterobacterias (Enterobacter spp., Erwinia tasmaniensis y Leclercia spp.), cinco en el orden Bacillales (Bacillus spp. y Brevibacillus brevis), tres dentro de los Pseudomonadales (Pseudomonas spp. y Acinetobacter sp.), tres en el orden Actinomycetales (Brevibacterium spp., Curtobacterium flaccumfaciens) y una en el orden Aeromonadales (Aeromonas caviae). Estos resultados concuerdan con el estudio de ^{Yaish et al. (2015)}, en el cual el género Bacillus y el grupo de las Enterobacterias conformaron las bacterias más representativas encontradas dentro del microbioma de palma datilera (Phoenix dactylifera L.). Las enterobacterias conforman un grupo de microorganismos en el cual confluye una gran variedad de mecanismos de promoción de crecimiento, que incluyen la fijación biológica de nitrógeno, la producción de AIA, la producción de sideróforos y la solubilización de fosfatos (^{Lin et al., 2012}); estas bacterias se encuentran entre los endófitos predominantes en distintos cultivos, por ejemplo, en caña de azúcar (^{Taulé et al., 2012}). Por otro lado, en la rizósfera de algunos cultivos como arroz, trigo y ginseng, el género Bacillus tiende a ser el taxón predominante (^{Fan et al., 2016}). Derivado del presente estudio, es claro que el microbioma de agave pulquero incluye una gran diversidad de bacterias que le confieren una multiplicidad de mecanismos de acción potenciales con gran valor en la agricultura; en este contexto, es importante destacar el hecho que las 19 especies de bacterias endófitas encontradas (Cuadro 2) han sido consignadas con anterioridad como promotoras de crecimiento.

Algunas de las bacterias encontradas en los agaves pulqueros tienen el potencial para fijar nitrógeno atmosférico como Acinetobacter sp. (^{Kuan et al., 2016}), Bacillus halotolerans (^{Slama et al., 2019}), Brevibacillus brevis (^{Nehra et al., 2016}), Enterobacter cloacae (^{Ryu et al., 2003}), Erwinia tasmanensis (^{Clavijo et al., 2012}) y Leclercia adecarboxylata (^{Laili et al., 2017}); para producir compuestos antimicrobianos como Acinetobacter sp. (^{Rokhbakhsh-Zamin et al., 2011}), Pseudomonas putida (^{Hassan et al., 2011}), Enterobacter ludwigii (^{Shoebitz et al., 2009}), Brevibacterium halotolerans (^{Slama et al., 2019}), Bacillus tequilensis (^{Li et al., 2018}) y Bacillus subtilis (^{Caulier et al., 2019}); para producir compuestos promotores de crecimiento (hormonas, compuestos volátiles, entre otros) como Bacillus subtilis (^{Wagi y Ahmed, 2019}), Bacillus tequilensis (^{Li et al., 2010}), Bacillus halotolerans (^{Slama et al., 2019}), Brevibacillus brevis (^{Nehra et al., 2016}), Erwinia tasmaniensis (^{Clavijo et al., 2012}), Leclercia adecarboxylata (^{Kang et al., 2019}), Pseudomonas hunanensis (^{Dutta y Thakur, 2017}) y Pseudomonas putida (^{Patten y Glick, 2002}); y para reducir los niveles de etileno en las plantas, el cual interfiere con el crecimiento de las mismas bajo condiciones de estrés, como Acinetobacter sp. (^{Indiragandhi et al., 2008}), Bacillus halotolerans (^{Sgroy et al., 2009}), Enterobacter kobei (^{Pramanik et al., 2018}), Leclercia adecarboxylata (^{Kang et al., 2019}), Pseudomonas hunanensis (^{Maroniche et al., 2016}) y Pseudomonas putida (^{Jacobson et al., 1994}). Algunas de las capacidades de promoción de crecimiento, o de biocontrol de microorganismos fitopatógenos, de las bacterias referidas han sido documentadas desde hace tiempo, como en el caso de Bacillus subtilis o Pseudomonas putida, y otras, cuyas competencias de promoción de crecimiento han sido descubiertas más recientemente, como el caso del género Leclercia y las especies Curtobacterium flaccumfaciens, Pseudomonas hunanensis y Enterobacter kobei. El primer informe de Leclercia sp. como PGPR se publicó en 2014 (^{Naveed et al., 2014}), mientras que Curtobacterium flaccumfaciens es una bacteria de hábito endófito cuyo papel en la agricultura resulta paradójico, ya que es un patógeno bien conocido en diferentes especies de plantas como frijol, soya, remolacha, nochebuena y tulipán, pero recientemente se le descubrieron capacidades de promoción de crecimiento en cebada (^{Cardinale et al., 2015}). Por otro lado, destaca la presencia de la bacteria Erwinia tasmaniensis en el tipo de agave Ayoteco, la cual ha sido referida como una bacteria epífita con potencial para el control de Erwinia amylovora en cultivos de manzana y pera (^{Polsinelli et al., 2019}).

Aunque previamente ^{Ramírez-Bahena et al. (2016)} lograron aislar una bacteria endófita de papa a la que denominaron Erwinia endophytica por su hábito de colonización de las plantas, hasta donde se conoce, este es el primer reporte de Erwinia tasmaniensis como microorganismo endófito. Bacillus tequilensis es una especie muy relacionada con B. subtilis que fue descrita primera vez por ^{Gatson et al. (2006)}, y que al igual que Curtobacterium flaccumfaciens, aparentemente puede ser transmitida por semilla (^{Beltrán-García et al., 2014}). Su hábito endófito y capacidad para controlar la enfermedad conocida como piricularia del arroz y del trigo, provocada por Magnaporthe oryzae, fueron descritos originalmente por ^{Li et al. (2018)}, quienes lograron aislar esta bacteria a partir de la planta Angelica dahurica. Las actividades de promoción de crecimiento mencionadas son potenciales, por lo que será importante confirmar mediante las pruebas pertinentes la existencia real de las rutas bioquímicas involucradas en su biosíntesis, y posteriormente, llevar a cabo las pruebas de funcionalidad in planta, ya que la presencia de las capacidades bioquímicas in vitro no siempre correlaciona con un aumento en el crecimiento de las plantas (^{Cardinale et al., 2015}). Las evaluaciones de campo serán siempre indispensables para establecer de manera contundente la factibilidad de uso de las cepas microbianas, por lo que las capacidades bioquímicas in vitro de las cepas microbianas aisladas están en proceso de análisis, así como también su potencial agronómico en campo. Estudios como el presente constituyen el primer paso para la apropiación y establecimiento de tecnologías de manejo microbiológico acordes con las necesidades particulares de cada explotación agrícola local (^{Compant et al., 2019}). El análisis de los microbiomas existentes en las plantas es importante no solo para la generación de información sobre aspectos agronómicos aplicados, sino también en el estudio de la participación de los microorganismos en la coevolución de las plantas y que han llevado a diferentes investigadores al planteamiento de la existencia de microbiomas núcleo y satélites de microorganismos, los cuales han sido determinantes en la aptitud y sobrevivencia de las plantas a través de tiempos evolutivos (^{Compant et al., 2019}).

CONCLUSIONES

El análisis de la endomicrobiota de cinco tipos de agave pulquero demostró que el número de aislamiento obtenidos corresponde a 7, 11, 3, 5 y 9 a partir de Ayoteco, Carricillo, Chalqueño, Manso y Púa Larga, respectivamente. La endomicrobiota bacteriana de Carricillo fue la más diversificada (nueve especies), mientras que Chalqueño presentó una menor riqueza bacteriana (tres especies); Ayoteco, Manso y Púa Larga presentaron cinco especies bacterianas únicas. Los géneros con una mayor representación en los cinco tipos de agave fueron Bacillus spp. con 12 entradas y Enterobacter spp. y Leclercia spp. con siete entradas cada uno. Bacillus subtilis y Leclercia sp. fueron las especies mayormente representadas en los agaves al encontrarse en tres de los cinco tipos analizados. Con base en el conocimiento más reciente, este es el primer estudio realizado en variedades de agave pulquero para conocer el microbiota endófito existente en este cultivo.