Producción de planta madre

Para producir las plantas madre se utilizaron cuatro genotipos de P. patula (G105, G106, G114 y G115) seleccionados en 2018 en el ejido Peñuelas Pueblo Nuevo, Chignahuapan, Puebla por su superioridad en altura, diámetro normal y rectitud del fuste. La fuente del G105 y G106 fue un ensayo de progenie (19° 57´ 43.14´´ LN, 98° 06´ 15.25´´ LO, 2574 m de altitud) y al momento de su selección tenían nueve años de edad y en promedio ٩.٦ m de altura y ٢٠.٧ cm de diámetro, mientras que G114 y G115 provienen de un huerto semillero sexual (19° 57´ 36.09´´ LN, 98° 06´ 18.92´´ LO, 2592 m de altitud), con 13 años de edad y en promedio 16.7 m de altura y 25 cm de diámetro.

En octubre de 2018 se recolectó semilla de polinización abierta de los cuatro genotipos seleccionados para producir la planta patrón. Enseguida, las semillas se colocaron para germinar en envases de 320 mL en un invernadero del Colegio de Postgraduados, Texcoco, México. En septiembre de 2019, las plantas producidas se trasplantaron a envases de plástico rígido (tubetes) de 1 L (18.5 cm de largo y 9 cm de diámetro) para permitir un mejor crecimiento y desarrollo de la raíz. El sustrato fue una mezcla de turba, perlita y vermiculita (60:20:20 %, respectivamente), incluyendo 8 g L^-1 de fertilizante de liberación controlada de ocho meses Multicote^® 18-6-12 N-P-K + 2MgO + microelementos para mejorar su crecimiento ^{(López et al., 2023)}. En marzo de 2020, a los 18 meses de edad, se seleccionaron 320 plantas vigorosas (60 cm de altura promedio y 8.1 cm de diámetro a la base del tallo) que fueron utilizadas como patrón para injertar y generar las plantas madre y 30 más para producir plantas madre sin injertar.

A principios de abril de 2020 se recolectaron las púas de la parte media superior de la copa de los árboles G105, G106, G114 y G115. Con tijeras de extensión se cortaron 120 púas por genotipo (sólo se injertaron 80) de los extremos terminales de las ramas, desde la base del crecimiento reciente. Las púas cortadas se asperjaron con agua, se colocaron dentro de bolsas de polietileno y se trasladaron en nevera con hielo el mismo día al Colegio de Postgraduados. Al llegar, los paquetes se colocaron en un refrigerador a 4 °C. Las púas contenían la yema (tejido meristemático) y el crecimiento inmediato anterior del último mes, ya que en esta especie la elongación inicia a principios de marzo; por lo tanto, las púas estaban en crecimiento activo, sin lignificación, antes de emitir acículas, vigorosas, sanas y con longitud promedio de 13 cm (se ajustó a 7 cm al injertar) y diámetro de 4.9 mm.

Al día siguiente de la recolecta de las púas se injertó con la técnica lateral a 10 cm de la base en el tallo principal del patrón, como se describe en ^{González-Jiménez et al. (2023)}. En vivero se dio riego de manera individual dos a tres veces por semana a los injertos prendidos y a la planta no injertada. El pH del agua se ajustó a 5.7 con ácido fosfórico. La fertilización se realizó una vez por semana con Peters Profesional^® 20-20-20 N-P-K en dosis de 1 g L^-1.

Inducción de brotes por poda

A los seis meses del injertado, en octubre de 2020, se seleccionaron las 30 mejores plantas injertadas de cada genotipo (altura, vigor y con dominancia apical definida) para conformar el grupo de plantas madre. Las plantas injertadas y las no injertadas se podaron 2 cm abajo de la yema apical para inducir el desarrollo de brotes adventicios. La altura promedio en cm de la planta injertada fue: G105 (36.1), G106 (26.7), G114 (32.7), G115 (35.8) y de la no injertada (76.8). La planta sin injertar estuvo constituida de patrones de dos años sin tratamiento alguno y con el mismo manejo que las injertadas.

El desarrollo de los brotes se observó en el periodo de la semana 7 a la 16 (Figura 1). Las plantas se mantuvieron a la intemperie con temperatura promedio de 21.3, máxima de 36.6 y mínima de 6.1 °C. La humedad relativa promedio fue 51.8, la máxima de 72.9 y la mínima de 28.5 % y se registró mediante un sensor HOBO^® (Modelo U12-O12, Onset, Cape Cod, Massachusetts, USA) durante 16 semanas a partir de la poda.

Figura 1 Fenología de brotes a partir de plantas madre injertadas de P. patula. A) semanas 2-6, abultamiento en la base de algunos fascículos cercanos al área de poda, B) semana 7, inicio de la brotación, C) y D) semanas 8-14 crecimiento en longitud de los brotes y desarrollo de acículas primarias, E) semana 16 reducción de crecimiento e inicio de hojas secundarias (acículas unidas al fascículo). 

Enraizamiento de estacas

A la semana 18, después de la poda, los brotes adventicios generados en las plantas madre fueron cosechados. Las estacas obtenidas se sumergieron en agua corriente por 20 min para hidratarlas; luego, fueron lavadas en solución de jabón líquido comercial e hipoclorito de sodio (1 mL L^-1) y se enjuagaron con agua corriente; finalmente, se trataron con solución del fungicida Captán^® 1 g L^-1 durante 15 min y se pasaron a un recipiente con hielo para mantenerlos frescos e hidratados. Las estacas tenían 4.2 mm de diámetro promedio y la longitud se ajustó a 5 cm con un corte de 45° en la base. Para promover el enraizamiento, se aplicó en la base de la estaca auxina ácido indol-3-butírico (AIB) en polvo (Radix^®) 5000 ppm.

Se adaptaron cuatro cámaras de enraizamiento mediante contenedores de plástico redondo de 36 cm de diámetro y 15 cm de altura con orificios en la base y desinfectadas con sales cuaternarias de amonio (Pursue^®) 10 mL L^-1. En cada contenedor se utilizaron 8 L de sustrato perlita y turba de musgo (3:1) y 3.7 L de agua purificada. En el sustrato, dentro de los contenedores, se delimitó un cuadro de 20 × 20 cm donde se enterraron las estacas a 5 cm de manera equidistante a una profundidad de 1-1.5 cm, cada contenedor tenía 25 estacas (cinco estacas por tratamiento). Las cámaras fueron cubiertas con bolsas de polietileno transparente de 0.8 × 1.2 m y se mantuvieron en invernadero con temperatura promedio de 20.5, máxima de 26.4 y mínima de 14.8 °C durante seis semanas.

Diseño experimental y análisis de datos

Se utilizó un diseño experimental de bloques completos al azar. Para la etapa de inducción de brotes se usaron seis bloques y cuatro para la etapa de enraizamiento. Se establecieron cinco tratamientos, evaluando las plantas madre de injertos de cuatro genotipos superiores T1: G105, T2: G106, T3: G114, T4: G115 y T5: planta a partir de semilla y sin injertar. En la primera etapa, la unidad experimental constó de cinco injertos o plantas, respectivamente, y en la etapa de enraizamiento se usaron cinco estacas.

Las variables evaluadas en la inducción de brotes fueron: plantas madre que emitieron brotes adventicios (%) a la semana 7 y 16; número, longitud (cm) y diámetro (mm) de los brotes solamente a la semana 16. Las variables evaluadas en el enraizamiento de estacas fueron: estacas vivas (%) y estacas enraizadas (%) a las seis semanas de haberse colocado en las cámaras de enraizamiento.

De manera independiente se realizó análisis de varianza a los datos de las variables evaluadas en la etapa de inducción de brotes y enraizamiento, correspondientes a los cinco tratamientos, mediante el procedimiento Mixed del paquete Statistical Analysis System versión 9.4 ^{(SAS Institute, 2013)}. Posteriormente , a las variables que presentaron diferencia estadística se les aplicó la prueba de comparación múltiple de medias (Tukey, P ≤ 0.05). Los datos de la variable número de brotes y las evaluadas en porcentaje, al no cumplir con el supuesto de normalidad, se transformaron con la función [T = log10 (Y)] y [T = arcoseno (√ Y)], respectivamente, antes de realizar el análisis de varianza y prueba de Tukey; posteriormente, se retransformaron a las unidades originales con la función [Y = 10 ^T ] y [Y = 100 seno² (T)], respectivamente ^{(Bautista-Ojeda et al., 2022)}. Se utilizó el mismo modelo para las dos etapas del experimento:

Donde: i = 1, 2, … t, j = 1, 2, … r: t = número de tratamientos, r = número de bloques t= número de repeticiones; Y _ij = valor de la variable respuesta correspondiente a la repetición j del tratamiento i; µ = media general; τ _i = efecto del tratamiento i; B _j = efecto del bloque j; ε _ij = error experimental i = T1, T2, T3, T4 y T5; j = 1, 2, 3, … repeticiones.

Formación de brotes

En la evaluación a la semana 7 se observó que el inicio de la brotación fue heterogéneo entre genotipos de las plantas injertadas, lo que dificulta cosechar los brotes en una sola fecha. El 45.8 % de las plantas madre injertadas inició la formación de brotes adventicios a las siete semanas. Las plantas del T3: G114, produjeron de 20 a 40 % más brotes que las otras plantas injertadas, pero los valores fueron similares a los de las no injertadas, misma capacidad de respuesta a la poda (Cuadro 1). Para la evaluación final (semana 16) presentaron diferencias de 27 % más los tratamientos T3, T4 y T5, que desarrollaron brotes adventicios, con respecto al T2 (Cuadro 1). La mayoría de las plantas madre a partir de injerto lograron formar brotes (87 %), así como la planta no injertada (97 %) (Cuadro 1). Del 70 al 97 % de las plantas madre a partir de injerto formaron brotes, a pesar de que las púas injertadas provienen de árboles de 11 y 15 años de edad. En P. greggii se reportó la inducción de brotes en plantas injertadas con púas de árboles de 14 años ^{(Castro-Garibay et al., 2022)}, pero la información es escasa sobre el manejo de plantas madre a partir de especies de pino adultos.

De manera similar a los resultados de este trabajo, en plantas madre de P. taeda, pero a partir de semilla, las diferencias genéticas entre familias fueron evidentes en la formación de brotes ^{(Rowe et al., 2002)}. En P. jaliscana Pérez de la Rosa se encontró gran variación en la producción de brotes de acuerdo con el genotipo de la planta madre ^{(Aparicio-Rentería et al., 2006)}. Esta variación responde al factor genético, ya que existen genotipos con mayor capacidad de brotación con relación a otros dentro de una misma especie ^{(Rezende et al., 2014)}. También se ha señalado que influyen otros factores como la altura del tallo a la que se realiza la poda, nutrición, edad, fecha e intensidad de poda, balance hormonal de la planta madre, luz, temperatura y humedad ^{(Escamilla-Hernández et al., 2020)}.

El estímulo para la formación de brotes adventicios se da en respuesta a factores de estrés como defoliación, poda, fuego y sequía ^{(Jiménez-Casas y Zwiazek, 2014)}. Al podar el ápice de la planta madre se pierde dominancia apical y las yemas laterales pueden ser liberadas de la latencia por la reducción en los niveles de auxina, las citocininas producidas en las raíces se transportan hacia arriba y pueden actuar en las yemas para promover su excrecencia ^{(Read y Bavougian, 2013)}. Este proceso fisiológico se da como respuesta de la planta para mantener mayor biomasa viva ^{(Smith et al., 2018)}.

Los estudios se han enfocado en plántulas menores de dos años producidas por semilla, como en P. radiata y P. taeda ^{(Wu, 2019)}, P. leiophylla Schiede ex Schltdl. et Cham. ^{(Cuevas-Cruz et al., 2015)} y P. patula ^{(Bautista-Ojeda et al., 2022)}. Para árboles de cuatro años de edad se ha reportado la inducción de brotes adventicios con árboles del híbrido P. elliottii var. elliottii × P. caribaea var. hondurensis ^{(Cabrera et al., 2022)}. Es difícil que en coníferas adultas se produzcan brotes adventicios debido a la transición de la fase juvenil a la madura, que trae cambios progresivos en la capacidad de desarrollarlos ^{(Hartmann et al., 2014)}. Sólo algunas coníferas como P. leiophylla presentan capacidad de rebrote en etapa adulta ^{(Jiménez-Casas y Zwiazek, 2014)}. Posiblemente al injertar las púas de árboles adultos sobre patrones jóvenes se favoreció la formación de brotes. El rebrote es una característica de plántulas juveniles que se confiere del patrón a la púa al injertar ^{(Wendling et al., 2014)}. En este estudio se demuestra que se pueden establecer plantas madres injertadas de árboles adultos de P. patula con capacidad de producir brotes.

Número de brotes

El T5 mostró el valor más alto con 7.5 brotes, en promedio, por planta madre y tuvo diferencias con los otros cuatro tratamientos, correspondientes a plantas injertadas que emitieron entre 1.9 y 2.7 brotes (Cuadro 1). El número de brotes se vio influido por el origen de la planta madre (injerto); sin embargo, el genotipo dentro de este grupo no tuvo efecto. En contraste, plantas de 18 meses de P. jaliscana sí presentaron variación en el número de brotes (0 a 27) entre genotipos ^{(Aparicio-Rentería et al., 2006)}. En promedio se formaron 2.4 brotes por planta madre a partir de injertos. La baja productividad inicial de brotes pudiera incrementarse conforme el rameto se adapta al manejo como planta madre. ^{Hernández y Rubilar (2012)} obtuvieron de cuatro a 10 brotes totales por planta madre en P. radiata.

Aunque se logró multiplicar el material vegetal de los genotipos de interés, es necesario aumentar aún más el número de brotes, ya que en algunos casos las podas no son suficientes para producir la cantidad requerida ^{(Inoti et al., 2017)}. La fertilización, y particularmente el nitrógeno, en las plantas madre podría ayudar a incrementar el número de brotes, aunque previamente se debe analizar el estado nutricional de la planta para detectar insuficiencias y mejorar su vigor ^{(Cabrera et al., 2022}; ^{Ford et al., 2014)}. La fertilización con nitrógeno en plantas madre de P. taeda y P. radiata aumentó los niveles de carbohidratos, mejorando la producción de brotes ^{(Hernández y Rubilar, 2012}; ^{Rowe et al., 2002)}. El desarrollo y crecimiento de rebrotes depende en gran medida de las reservas de carbono existentes en los tejidos de la planta madre ^{(Smith et al., 2018)}.

El estrés producido a las plantas madre por la poda y su severidad también puede influir en el número de brotes ^{(Jiménez-Casas y Zwiazek, 2014)}. Podas constantes en plantas madre de P. jaliscana aumentaron progresivamente la producción de brotes ^{(Aparicio-Rentería et al., 2006)}; ^{Bautista-Ojeda et al. (2022)} podaron hasta tres veces plantas madre de P. patula para inducir mayor brotación.

Longitud de brotes

En promedio, se obtuvieron 5.3 cm de longitud del brote de plantas madre a partir de injerto y las de planta no injertada de 2.6 cm (Cuadro 1). En los brotes de plantas injertadas el promedio en longitud más alto lo presentó el T3 (6.0 cm), ya que inició su formación más rápido y tuvo diferencia solo con el T4 de 2.0 cm. ^{Martínez-Alonso et al. (2012)} no detectaron efecto del origen genético de las plantas madre en la longitud del brote de P. pinaster Ait. El bajo crecimiento de brotes del T5 pudiera atribuirse a que distribuyeron sus recursos en un gran número de brotes, afectando su crecimiento. ^{Bautista-Ojeda et al. (2022)} recomendaron eliminar los brotes débiles de cada planta madre para reducir la variabilidad en vigor y optimizar la distribución de recursos, favoreciendo el crecimiento de los remanentes.

Es importante considerar la longitud del brote de acuerdo con su objetivo final, sea púa para injerto, explante para cultivo in vitro o estaca para enraizamiento ^{(Castro-Garibay et al., 2022}; ^{Sodré y Gomes, 2019)}. ^{Escamilla-Hernández et al. (2020)} recomendaron para P. patula una longitud del brote de 7-9 cm si se va a utilizar para enraizamiento; ^{Rivera-Rodríguez et al. (2016)} obtuvieron para este mismo fin brotes de 8-10 cm y ^{Ford et al. (2014)} de 8 cm. Los brotes del G114 (T3) son los que se acercaron más a esta longitud recomendada. Se observó entre plantas madre de un mismo genotipo, e incluso dentro de una misma planta, brotes de diferentes tamaños, desde recién formados hasta los que ya habían detenido su crecimiento, lo que dificulta tener una cosecha en una sola fecha (Figuras 1D y 1E).

Para este estudio, el crecimiento de los brotes fue menor que el reportado en otras especies de pino de 7-12 cm ^{(Cuevas-Cruz et al., 2015}; ^{Escamilla-Hernández et al., 2020)}. Esta menor longitud puede estar relacionada con la fecha de poda de las plantas madre (octubre), cuando están en un periodo de latencia y no hay alargamiento visible del brote ^{(González-Jiménez et al., 2022)}. ^{Rowe et al. (2002)} obtuvieron el mayor número de brotes con ≥ 9 cm de longitud en primavera y la menor longitud en invierno; además, ^{Hernández y Rubilar (2012)} sugirieron desarrollar esquemas de fertilización con nitrógeno para optimizar la elongación de los brotes, ya que ésta influye en características morfológicas de planta injertada ^{(López et al., 2023)}. Este efecto se debe a que los niveles elevados de nitrógeno promueven una rápida división y elongación celular ^{(Martínez-Alonso et al., 2012)}.

Diámetro de brotes

En promedio, el diámetro en los brotes a partir de injertos fue 4.5 mm y para T5 (planta no injertada) de 3.0 mm. El valor promedio más alto se presentó en T2 (5.1 mm), con diferencia de 0.9, 1.3, 0.3 y 2.1 mm con respecto a T1, T3, T4 y T5 (Cuadro 1). ^{Escamilla-Hernández et al. (2020)} recomendaron para P. patula brotes con diámetro promedio de 2.5-3.0 mm para fines de enraizamiento. Los brotes del T5 tuvieron un crecimiento similar a lo reportado por estos autores, ya que ambos fueron originados de plantas provenientes de semilla. Dentro de las plantas madre a partir de injerto, los brotes del T3 tuvieron el valor promedio más cercano al diámetro recomendado para enraizamiento. En otras especies de pino se han obtenido brotes ≤ 3 mm a partir de plantas madre, como en P. leiophylla de 1.5-2.0 mm ^{(Cuevas-Cruz et al., 2015)} y en P. radiata de 2.4-2.9 mm ^{(Hernández y Rubilar, 2012)}.

Los diámetros medios de brote obtenidos de las plantas madre del T1, T2, T3 y T4 fueron superiores a los que se han reportado, lo que quizás se deba a que se trata de púas de árboles adultos injertadas, condición que influyó en la formación de brotes más gruesos en comparación con los que genera la misma especie, pero en estado de plántula originada de semilla. Es preciso considerar que habrá brotes de genotipos morfológicamente más adecuados para enraizamiento y otros como el T2 (5.1 mm) que no sean favorables. Asimismo, se deben tomar en cuenta las relaciones entre las características morfológicas del brote en su enraizamiento, ya que los estudios se han enfocado en aspectos fisiológicos, hormonales y del ambiente.

Supervivencia y enraizamiento de brotes

A los tres meses después de establecidas las estacas, la supervivencia de los brotes procedentes de plantas madre no injertadas (T5) fue 100 % y presentó diferencias de 25 a 50 % con respecto a las de plantas madre injertadas (T1, T2, T3 y T4), que en promedio fue 63.8 % (Cuadro 2). El T3 (G114) presentó el valor más alto de supervivencia en plantas injertadas con diferencia de 25 % respecto al T1 (G105). La mejor respuesta en la supervivencia de las estacas del G114 quizás sea resultado de la capacidad específica de cada genotipo ^{(González-Jiménez et al., 2023)}. Se carece de información acerca de la supervivencia de estacas de plantas madre a partir de injerto en especies del género Pinus, solamente existen antecedentes de estacas a partir de plantas menores de dos años originadas de semilla. ^{Escamilla-Hernández et al. (2020)} y ^{Rivera-Rodríguez et al. (2016)} reportaron supervivencia ≥ 90 % de estacas de P. patula de 3-5 meses después de que se colocan a enraizar. Estos resultados son similares a los obtenidos en este estudio por el T5 por tener mismo origen (plántulas de semilla).

El 20 % de las estacas a partir de plántula no injertada correspondientes al T5 lograron desarrollar raíces adventicias, con longitud de raíz primaria de 13.9 cm y 4.8 raíces secundarias promedio (Figura 2D). Las estacas que desarrollaron raíces adventicias se transfirieron a tubete individual de 320 mL en condiciones de invernadero para su aclimatación (Figura 2E). Ninguno de los cuatro genotipos evaluados logró desarrollar raíces (Cuadro 2). Es escasa la información de enraizamiento de estacas de planta injertada. Los resultados obtenidos por el T5 son similares a lo reportado por ^{Rivera-Rodríguez et al. (2016)} que lograron enraizar brotes de P. patula entre 10 y 35 %, aunque recientemente se han reportado valores cercanos a 80 % de enraizamiento ^{(Escamilla-Hernández et al., 2020)}.

Figura 2 Cosecha y enraizamiento de brotes de plantas madre de Pinus patula. A) brotes de plantas madre injertadas, B) brotes de planta no injertada, C) callo de brotes a partir de injerto, D y E) raíces adventicias y aclimatación de brotes a partir de planta no injertada de P. patula. 

Las estacas a partir de injerto que permanecieron vivas a los tres meses solo formaron un abultamiento (callo) en la base del tallo de la estaca, resultado de la división celular (Figura 2C) ^{(Hartmann et al., 2014)}. La mezcla y proporción de sustrato utilizada para este estudio fue perlita y turba (proporción 3:1), la cual incrementa la aireación y se ha relacionado con la formación de callo, como se demostró en estacas de P. patula ^{(Escamilla-Hernández et al., 2020)}. El factor de mayor influencia en el nulo enraizamiento de las estacas de injerto fue la edad de los árboles originales (11 y 15 años), que ya se encontraban en la etapa de madurez fisiológica con la producción de estructuras reproductivas. La capacidad para formar raíces tiende a disminuir con la edad debido al aumento de inhibidores del enraizamiento ^{(Inoti et al., 2017)}. Se ha demostrado que se producen brotes más vigorosos y menos lignificados de plantas madre injertadas de árboles de P. greggii de 14 años de edad ^{(Castro-Garibay et al., 2022)}; por ello, se esperaba que al injertar las púas de árboles adultos de P. patula sobre patrones jóvenes se pudieran inducir características juveniles como la capacidad de desarrollar raíces adventicias ^{(Vidoy-Mercado et al., 2021)}; sin embargo, esto no sucedió.

Si bien los brotes obtenidos de injerto son morfológicamente similares a los del T5 (Figuras 2A y 2B), solo los de plántula no injertada desarrollaron raíces; esto indica que existen otros factores de tipo hormonal, nutrimental o ambiental que impiden su enraizamiento ^{(Inoti et al., 2017)}. Las auxinas juegan un papel central en el enraizamiento adventicio, y aunque se aplicaron de forma exógena (5000 ppm) no se logró inducir su formación; por ello, en futuros estudios se pudieran probar más concentraciones y tipos de auxinas que promuevan el enraizamiento. La nutrición de las plantas madre influye en procesos de morfogénesis relacionados con la capacidad de formar raíces adventicias. Es necesario aplicar un plan de fertilización a las plantas madre ^{(Bautista-Ojeda et al., 2022)}. Otra alternativa para tratar de solucionar este problema es realizar más ciclos de injerto previos ^{(Read y Bavougian, 2013)}; se ha documentado que el injerto en serie es el método más consistente para restaurar gradualmente características juveniles en coníferas adultas por el recurrente injerto de púas sobre patrones juveniles ^{(Wendling et al., 2014)}. En Sequoia sempervirens (D. Don) Endl., al hacer injertos sucesivos con púas de árboles, se restableció la juvenilidad del tejido, el cual tuvo un decremento de isoenzimas peroxidasas y esterasas, así como alteraciones en los patrones de fosforilación de proteínas, moléculas relacionadas con tejido juvenil ^{(Vidoy-Mercado et al., 2021)}. A través de injertos sucesivos se ha podido obtener enraizamiento de brotes de árboles adultos y los ciclos de injerto han variado (2 a 6), dependiendo de la especie, pero fueron suficientes tres ciclos para obtener brotes capaces de formar raíces en P. oocarpa Schiede ex Schltdl. y P. caribaea Morelet ^{(Santin et al., 2015}; ^{Wendling et al., 2014)}.