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Introducción
Desde un punto de vista económico, las frutillas, pertenecientes a los géneros Rubus, Fragaria y Vaccinium, tienen una demanda muy alta a nivel mundial. En relación con sus propiedades nutricionales, estos frutos tienen bajo contenido energético, son ricos en vitaminas, minerales y compuestos fitoquímicos como flavonoides, ácidos fenólicos, taninos y otros que les confieren características nutracéuticas (Foito et al., 2018; Nile et al., 2014; Shahidi y Ambigaipalan, 2015).
El género Rubus es uno de los más diversos del reino vegetal, se estima que alrededor del mundo existen más de 700 especies (Brennan et al., 2014). En gran parte del continente americano, desde México hasta Ecuador, las diferentes especies de zarzamoras crecen entre los 2000 y 3100 msnm (Cancino-Escalante et al., 2011). Tan solo en México, se presentan alrededor de 42 especies (Rodríguez-Bautista et al., 2021). Las zarzamoras y frambuesas pertenecen al mismo género, Rubus, pero difieren en el subgénero, ya que las zarzamoras pertenecen a Rubus y las frambuesas a Ideaobatus. Estas últimas son diploides (2n = 2x = 14) y las zarzamoras varían de diploides hasta dodecaploides (2n = 2x = 14 a 2n = 12x = 84) (Foster et al., 2019). Sus frutos están formados por drupeolas con diversas texturas y de forma globosa, se agrupan formando polidrupas, donde cada una de ellas contiene una semilla, pueden mantenerse unidas al receptáculo floral para el caso de las zarzamoras o desprenderse de él para el caso de las frambuesas (Romoleroux, 1996).
Entre los principales compuestos fenólicos en las especies del género Rubus se encuentran las antocianinas, predominando la cianidina-3-glucósido y la pelargonidina 3-rutinósido; otro tipo de flavonoides son la quercetina, el kaemferol y la epicatequina; también se encuentran presentes algunos ácidos orgánicos como el elágico y gálico y taninos hidrolizables como los elagitaninos (Bhatt et al., 2023; Schulz y Chim, 2019). La concentración de estos compuestos en los frutos puede estar determinada por factores como la especie, el cultivar, la fase de maduración y las condiciones edafoclimáticas en las que se desarrollan (Lee et al., 2012; Taiz y Zeiger, 2009).
Por otro lado, la síntesis de antocianinas es inducida por estrés biótico y abiótico, estos factores conducen a diferentes concentraciones y perfiles de antocianinas, ya que los tipos individuales tienen funciones distintas en la fisiología de las plantas (Chaves-Silva et al., 2018). La exposición a la luz es un factor ambiental que aumenta el contenido de antocianinas en los frutos al aumentar la expresión de genes biosintéticos de flavonoides en la piel de las bayas; sin embargo, las altas temperaturas conducen a una supresión de la biosíntesis de antocianinas (Di Vittori et al., 2018). Los compuestos fenólicos, encontrados en las moras y las frambuesas, están asociados con la capacidad antioxidante de dichas bayas (Yang y Choi, 2017). Otras propiedades biológicas estudiadas en diferentes especies del género Rubus son la anti-inflamatoria, la quimiopreventiva y la antimicrobiana. También se ha documentado que las concentraciones fisiológicas de polifenoles actúan sobre las vías de señalización celular para prevenir o retrasar la aparición de enfermedades relacionadas con la inflamación crónica, como la aterosclerosis y otras enfermedades cardiovasculares (Schulz y Chim, 2019).
Desde un punto económico, el cultivo de frutillas es altamente rentable y es una fuente de empleo por la alta demanda de mano de obra. El rápido equilibrio económico en inversión y su potencial exportador han hecho que México se ubique entre los primeros productores de arándanos, fresas, frambuesas y zarzamoras. Estos frutos se exportan a países como Estados Unidos y Canadá (González et al., 2019). En el año 2022, las frutillas fueron el segundo producto con mayor valor de exportación, generando ganancias de alrededor de cuatro mil 700 millones de dólares estadounidenses, con una producción de un millón 046 mil 264 toneladas, en una superficie sembrada de 37 mil 575 hectáreas, donde la fresa representó el 55.3 %, la zarzamora 21.3 %, la frambuesa 17.1 % y el arándano 6.4 % (SADER, 2023).
Las plantas usadas para producir zarzamoras mejoradas pertenecen a las variedades Tupy y Brazos, mientras que para el mejoramiento de las frambuesas se han descrito los cultivares Roja Europea y Norteamericana (Rubus ideaus) y las especies Negra (Rubus occidentalis) y Ártica (Rubus arcticus) (Foster et al., 2019). Estas especies han generado un gran interés en emprendimientos comerciales y en investigación debido a su alto valor nutracéutico (Kempler et al., 2012; Titirică et al., 2023). Tomando en cuenta lo anterior, en México se cuenta con especies silvestres que se distribuyen en las zonas altas de las montañas, principalmente en los estados de Chiapas, Veracruz, Oaxaca, Puebla e Hidalgo, que podrían ser utilizadas para incrementar la diversidad genética. Algunos estudios han demostrado que las especies silvestres de Rubus cumplen con características fisicoquímicas y nutracéuticas para ser incorporadas en programas de fitomejoramiento o a la industria farmacéutica (Rubio et al., 2019); sin embargo, han sido poco estudiadas y desaprovechadas en la industria alimentaria. El objetivo de la presente investigación fue evaluar el potencial nutracéutico de frutillas silvestres de frambuesa y zarzamora de diferentes especies, mediante el análisis de sus propiedades antioxidantes, con el fin de identificar genotipos de mejor calidad nutracéutica que puedan ser incluidos en programas de mejoramiento genético.
Materiales y métodos
Material vegetal
Se colectaron plantas de 21 accesiones de zarzamora y frambuesa silvestres en los estados de Chiapas, México, Veracruz e Hidalgo. Estos materiales fueron llevados al campo agrícola experimental del Departamento de Fitotecnia de la Universidad Autónoma Chapingo ubicado en el municipio de Texcoco de Mora, Estado de México (19° 51' latitud norte y 98° 88' longitud oeste, altitud de 2258 msnm). Se trasplantaron a bolsas de vivero con suelo y peat moss en proporción 1:1, se tutoraron y se fertilizaron semanalmente con Bayfolan® (2 mL L-1) y Rootex® (1 g L-1). De estas accesiones solo cuatro alcanzaron su estado de fructificación, éstas fueron las zarzamoras Chiapas 1, Hidalgo 2.3, Hidalgo 2.4, y la frambuesa Rubus niveus, cuyos datos de colecta son: 16º 44’ latitud norte, 92º 47’ longitud oeste, 1991 msnm; 20º 34’ latitud norte, 98º 34’ longitud oeste, 1978 msnm; 20º 34’ latitud norte, 98º 34’ longitud oeste, 1975 msnm; y en Chiapas a 16º 25’ latitud norte, 92º 29’ longitud oeste, 1840 msnm; respectivamente.
Además de los materiales silvestres, se incluyeron las zarzamoras que hacen parte del campo experimental del Departamento de Fitotecnia en el Estado de México identificadas como Mora de Castilla (Rubus glaucus), la variedad Tupy y una muestra comercial de zarzamora de procedencia desconocida. Se cosechó en el verano de 2022, teniendo en cuenta el estado de madurez 6 (color morado oscuro) según la tabla de colores de la norma técnica colombiana NTC 4106 del ICONTEC.
Reactivos químicos
Los reactivos Folin-Ciocalteu, ácido gálico (GA), carbonato de sodio anhidro, ácido 6-hidroxi-2,5,7,8tetrametilcromano-2-carboxílico (Trolox), ácido 2,2›-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS) y 2,4,6-tri(2-piridil)-s-triazina (TPTZ), catequina, ácido acético glacial, acetato de sodio trihidratado, ácido clorhídrico y cloruro férrico hexahidratado fueron adquiridos de Sigma Aldrich.
Extracción de los compuestos antioxidantes
Una muestra de 1 g de los frutos molidos previamente liofilizados a -53 °C y 0.046 mbar de presión (Labconco®, Kansas City, Missouri, EUA), se mezcló con metanol 80 % en una proporción 1:10 (p/v). La mezcla se acidificó a pH 3 ± 0.3 con HCl 1 N y se extrajo por agitación en vortex (1000 rpm, 3 min), sonicación (15 min) y agitación en incubadora (180 rpm, 30 °C, 30 min). Finalmente, la mezcla fue centrifugada a 4500 rpm por 15 min (Ohaus, FC5718R, Parsippany, New Jersey, EUA). El sobrenadante recuperado se llevó a un volumen final de 10 mL con metanol 80 %. Los extractos se almacenaron en refrigeración y fueron protegidos de la luz hasta su análisis. A partir de estos extractos, obtenidos de cada muestra procesada por triplicado, se determinaron los contenidos de fenoles, flavonoides y antocianinas totales, así como la capacidad antioxidante, aplicando los ensayos FRAP y ABTS.
Determinación de fenoles totales
El contenido de fenoles totales fue determinado por el método de Folin-Ciocalteu adaptado a microplacas (Hernández et al., 2016; Singleton y Rossi, 1965). Se construyó una curva patrón usando como estándar ácido gálico. El extracto se diluyó a niveles que se ubicaron dentro de la curva de ácido gálico en un intervalo de concentraciones de 0.001 a 0.011 mg mL-1. En cada pozo de una microplaca se colocaron 25 µL de la muestra a analizar, 125 µL de agua destilada, 20 µL del reactivo de Folin-Ciocalteu (diluído 1:10 con agua destilada) y 30 µL de Na2CO3 20 %. La mezcla fue agitada y se dejó reaccionar durante 30 min en oscuridad; la absorbancia frente al blanco fue medida a 760 nm en un multidetector de microplacas Synergy 2, equipado con el software de análisis de datos Gen5 (Biotek Instruments Inc., Winoosky, Vermont, EUA). Los resultados fueron expresados en mg equivalentes de ácido gálico por gramo de muestra en peso seco (mg EAG g-1 PS).
Determinación de flavonoides totales (CFT)
Los flavonoides totales se determinaron de acuerdo con Kubola y Siriamornpun (2011). Se preparó una solución stock con 29 mg de catequina y se llevó a 1 mL con metanol 80 %. De esta solución, se colocaron 250 µL en un matraz de 25 mL, que se aforó con metanol 80 %. A partir de esta disolución se tomaron alícuotas para obtener la curva de calibración en un intervalo de concentraciones de 0.001 a 0.032 mg mL-1. Se tomaron 0.5 mL del extracto y se mezclaron con 2.25 mL de agua destilada y 150 µL de solución de NaNO2 5 %. Después de 6 min, se añadieron 300 µL de una solución de AlCl3 6H2O 10 % y se dejó reposar durante otros 5 min antes de añadir 1.0 mL de NaOH 5 %. La mezcla se agitó utilizando un vórtex (Vortex Synergy, WVR International, Radnor, Pennsylvania, EUA) 3000 rpm por 3 min. La absorbancia se midió inmediatamente a 510 nm con un lector de microplacas equipado con el software de análisis de datos Gen5 (Biotek Instruments Inc., Winoosky, Vermont, EUA). Los resultados se expresaron en mg de equivalente de catequina (EC) por gramo de muestra en peso seco (mg EC g-1 PS).
Determinación de antocianinas totales
Las antocianinas se cuantificaron según el método de pH diferencial (Lee et al., 2015). Se prepararon dos muestras por separado con una alícuota de 0.15 mL del extracto. Una muestra se mezcló con 0.85 mL de buffer pH 1.0 y la otra, mezclando 0.15 mL de extracto con 0.85 mL de buffer pH 4.5. Ambas mezclas se agitaron por 3 min en un vórtex a 1000 rpm y posteriormente se midieron las absorbancias a 513 nm y 700 nm desde lector de microplacas Synergy 2, equipado con el software de análisis de datos Gen5 (Biotek Instruments Inc., Winoosky, Vermont, EUA). La concentración de antocianinas monoméricas se obtuvo con la siguiente ecuación, tomando como referencia los datos de la cianidina-3-glucósido (PM 449.2 g mol-1) y ε el coeficiente de extinción molar (26900 unidades):
Donde FD es el factor de dilución y A se calculó con la fórmula siguiente:
Finalmente, los resultados fueron expresados como miligramos equivalentes de cianidina-3-glucósido (EC3G) por gramo de muestra en peso seco (mg g-1 de EC3G en PS) (Gaviria et al., 2009).
Determinación de la capacidad antioxidante
La capacidad antioxidante de los extractos de zarzamoras y frambuesa se determinaron por los ensayos FRAP (poder antioxidante reductor del hierro) (Benzie y Strain, 1996) y ABTS [ácido 2,2 ́-azino-bis(3etilbenzotiazolin)-6-sulfónico, A-1888] (Re et al., 1999), adaptados a microplacas. Se usó Trolox como curva de calibración para ambos ensayos. Para FRAP, el extracto se diluyó a niveles que se ubicaron dentro de la curva de Trolox en un intervalo de concentraciones de 0.1295 a 1.6526 mg mL-1, en cada pozo de una microplaca se colocaron 20 µL de la muestra a analizar, 60 µL de agua destilada, 180 µL de disolución FRAP para un total de 260 µL. La mezcla fue agitada y se dejó reaccionar durante 10 min en oscuridad. La absorbancia se midió a 595 nm. Para ABTS el extracto se diluyó a niveles que se ubicaron dentro de la curva de Trolox en un intervalo de concentraciones de 0.2085 a 1.1457 mg mL-1. Con al menos 16 h de anticipación se preparó una mezcla con solución 7.4 mM del reactivo ABTS (2,2’-azinobis-3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) con una dilución de persulfato de potasio 2.6 mM (K2S2O8). En cada pozo de la microplaca se adicionaron 180 µL de la solución ABTS y 20 µL del extracto de la muestra, se dejó reposar durante 10 min y se leyó la absorbancia a 734 nm. Para ambas lecturas se utilizó un lector de microplacas (software Gen5, Biotek Instruments Inc., Winooski, Vermont, EUA). Los resultados se expresaron como micromoles equivalentes de Trolox por gramo de muestra en peso seco (µmol g-1 ET en PS).
Análisis estadístico
Los resultados se presentaron como valor medio de tres réplicas por muestra y se analizaron mediante ANOVA unidireccional. Para la comparación de medias se utilizó la prueba de Tukey y las diferencias se consideraron significativas a P ≤ 0.05. El análisis estadístico se realizó utilizando el programa estadístico InsfoStat (Di Rienzo et al., 2020).
Resultados y discusión
Con el fin de comparar los valores obtenidos en este trabajo con aquellos de la literatura, en algunos casos fue necesario considerar el porcentaje de humedad. El contenido de fenoles totales se encontró entre 9.67 y 17.81 mg EAG por gramo de muestra en peso seco. Estos datos fueron estadísticamente diferentes, siendo las zarzamoras silvestres Hidalgo 2.3, Chiapas 1 y R. glaucus los que presentaron las concentraciones más altas de compuestos fenólicos. Valores superiores (285.06 a 592.61 mg 100 g-1 de EAG en PF) fueron encontrados por Rubio et al. (2019) en Rubus silvestres, mientras que en plantas cultivadas de zarzamora y fresa Wang y Lin (2000) reportaron valores similares a los de este estudio (204 a 268 mg 100 g-1 de EAG en PF). Los compuestos fenólicos son metabolitos secundarios biosintetizados por las plantas para su protección contra la radiación UV, plagas y enfermedades. Según Cheynier et al. (2013), estos compuestos han permitido la evolución de plantas terrestres y se acumulan en los tejidos para hacer frente a factores adversos, bióticos y abióticos, que puedan perturbar a las plantas en su ecosistema.
Dentro de los compuestos fenólicos se encuentran los flavonoides, siendo un grupo importante de metabolitos secundarios producidos por las plantas y genéticamente regulados e inducidos por factores ambientales (Gimeno, 2004). Estos compuestos tienen actividad antioxidante elevada, por lo que son capaces de reducir la producción de radicales libres (Garrido et al., 2013). Rubus glaucus tuvo la mayor concentración de flavonoides totales (10.27 mg g-1 de EC en PS), este valor es alto comparado con el reportado por Lee et al. (2014) (14.28 a 14.90 mg 100 g-1 PF); asimismo, se documentó en otras investigaciones para la misma especie una concentración de flavonoides de 43 mg 100 g-1 de EQ en PF (Rubio et al., 2019). En R. adenotrichus Martínez-Cruz et al. (2011) encontraron valores de 5.26 mg g-1 equivalentes de catequina (EC) en peso seco (PS) en esta especie silvestre de zarzamora.
Como se observa en el Cuadro 1, el contenido total de antocianinas mostró diferencias estadísticas significativas entre las especies estudiadas. La zarzamora silvestre Hidalgo 2.3 tuvo mayor concentración, con un valor medio de 19.19 mg g-1 equivalentes a cianidina 3-glucósido (EC3G) en PS, seguidas por frutos de Rubus silvestres junto con la comercial, seguida por R. glaucus y por último R. niveus. Estos resultados estuvieron por debajo de otras especies de Rubus donde se obtuvieron valores que van de 5.69 a 11.92 mg g-1 de materia fresca (Wada y Ou, 2002) y similares a los indicados por Zorzi et al. (2020) de 0.2 y 2.1 mg g-1 de EC3G en PF en R. fruticosus y R. ideaeus, respectivamente. Esta diversidad de resultados puede deberse a la complejidad varietal que se manifiesta en la composición de metabolitos secundarios incidiendo en la calidad de frutos (Lee et al., 2012).
Cuadro 1 Contenido de fenoles, flavonoides, antocianinas totales y capacidad antioxidante (CA) por poder antioxidante reductor del hierro (FRAP) y 2,2’-azinobis-(3-etil benzotiazolin-6-sulfonato de amonio) (ABTS) en frutos de especies del género Rubus.
| Cultivar | Fenoles totales (mg EAG g-1) | Flavonoides (mg EC g-1) | Antocianinas (mg EC3G g-1) | ABTS (μmol ET g-1) | FRAP (μmol ET g-1) |
| Hidalgo 2.3 | 17.81 ± 1.16 a | 3.48 ± 0.50 c | 16.16 ± 0.65 a | 1357.29 ± 20.76 a | 93.5 ± 6.03 a |
| Hidalgo 2.4 | 14.53 ± 0.72 b | 2.28 ± 0.20 c | 7.74 ± 0.72 b | 1192.47 ± 46.81 b | 68.1 ± 6.19 c |
| Chiapas 1 | 17.48 ± 0.54 a | 2.45 ± 0.08 c | 7.06 ± 0.42 b | 1276.07 ± 42.49 ab | 75.84 ± 2.89 bc |
| Tupy | 14.34 ± 1.39 b | 2.97 ± 0.05 c | 7.78 ± 0.09 b | 1190.6 ± 42.81 b | 73.09 ± 2.88 bc |
| Comercial | 13.88 ± 0.45 b | 2.95 ± 0.10 c | 6.65 ± 0.41 b | 1320.99 ± 46.64 a | 84.34 ± 10.40 ab |
| R. glaucus | 15.68 ± 0.38 ab | 10.27 ± 0.58 a | 3.71 ± 0.29 c | 1061.8 ± 23.32 c | 38.22 ± 2.17 d |
| R. niveus | 9.67 ± 0.47 c | 8.02 ± 1.05 b | 0.88 ± 0.05 d | 715.09 ± 25.22 d | 19.67 ± 0.94 e |
| DSH (0.05) | 2.27 | 1.39 | 1.24 | 103.32 | 15.08 |
Medias con letras iguales en la misma columna no son estadísticamente diferentes (Tukey, 0.05). EAG: equivalente de ácido gálico, EC: equivalente de catequina, EC3G: equivalente de cianidina-3-glucósido, ET: equivalente de trolox, DSH: diferencia significativa honesta. Datos expresados como medias ± desviación estándar.
La capacidad antioxidante se determinó por los ensayos ABTS y FRAP. En la primera metodología el persulfato de potasio generó un radical al reaccionar con el ABTS, por lo cual, se evaluó la capacidad de los extractos de las muestras para atrapar el radical generado por la reacción de oxidación; posteriormente, hay una disminución en la absorbancia a una longitud de onda de 732 nm. La metodología del FRAP permite medir la capacidad que tiene el extracto para reducir el ión férrico (Fe+3) presente en una solución con la 2,4,6-tri(2-piridil)-s-triazina (TPTZ) a la forma ferrosa (Fe+2), que presenta un máximo de absorbancia a una longitud de onda entre 590 y 595 nm (Rojano et al., 2011). Los valores de capacidad antioxidante fueron similares para las tres primeras muestras, siendo R. glaucus y R. niveus las que tuvieron los valores más bajos. Aquí sobresalieron las muestras silvestres colectadas en los estados de Hidalgo y Chiapas (Cuadro 1). Los frutos de la planta Hidalgo 2.3 mostraron la concentración de antocianinas totales más alta; sin embargo, en la capacidad antioxidante comparte el mismo grupo con las otras dos muestras silvestres, esto puede deberse a las diferencias en el perfil de los diferentes tipos de antocianinas de cada especie (Lee et al., 2015). Deighton et al. (2000) analizaron las propiedades antioxidantes de especies de Rubus domesticadas y silvestres y encontraron valores entre 0 y 25.3 µmol ET g-1, valores similares a los reportados en este estudio (19.67 a 93.5 µmol ET g-1). Estas diferencias entre especies y genotipos pueden corresponder a factores genéticos que influyen en la capacidad antioxidante de un cultivo, puesto que existen procesos de hibridación que llevan a la variabilidad genética y a diferente nivel de ploidía, que va desde diploides hasta dodecaploides (Meng y Finn, 2002).
Los resultados obtenidos en cada una de las pruebas son diferentes, lo cual posiblemente se deba al tipo de especie evaluada. Así, por ejemplo, las zarzamoras presentan mayores concentraciones de flavonoides y antocianinas que las frambuesas y, por consiguiente, mayor capacidad antioxidante (Sariburun et al., 2010). Esto concordó con el estudio de Zorzi et al. (2020) donde evaluaron diferentes tipos de frutillas, como grosellas, arándanos, zarzamoras y frambuesas, siendo estas últimas las de menor cantidad de antocianinas. En este estudio se encontró que R. niveus, la única frambuesa, tuvo los valores más bajos en las variables evaluadas. También influyen las condiciones ambientales del lugar de procedencia de las plantas silvestres, tal como lo documentaron Rubio et al. (2019), quienes evaluaron las mismas variables en frutos silvestres de Rubus. Hernández et al. (2019) obtuvieron diferencias significativas en materiales procedentes de la región de la Sierra Norte de Oaxaca, México y cultivares comerciales; las frutillas correspondientes a las plantas silvestres tuvieron mayor concentración de metabolitos secundarios y una mayor capacidad antioxidante.
Resultados semejantes se obtuvieron en el presente estudio, las frutillas de las plantas silvestres fueron las que destacaron, como el caso de la muestra de Hidalgo 2.3. Esto puede deberse a las condiciones ecológicas en que se desarrollan, por la necesidad de producir metabolitos secundarios en defensa ante depredadores, en comparación con los frutos comerciales (Hernández et al., 2019).
Conclusiones
En este estudio destacaron las especies silvestres del género Rubus colectadas en los estados de Hidalgo y Chiapas, México por su mayor potencial nutracéutico, atribuido principalmente a su contenido fenólico. Esta característica es de interés para la selección de materiales élite en programas de mejoramiento genético para obtener frutillas con atributos sensoriales más atractivos y propiedades antioxidantes superiores que contribuyan a tolerar las condiciones ambientales adversas.
