Sitio y periodo experimental

El presente estudio fue realizado en condiciones de invernadero en el Colegio de Postgraduados Campus Montecillo, Edo. de México, México, durante los periodos de otoño 2020 e invierno 2020-2021.

Germoplasma evaluado y manejo agronómico

El germoplasma evaluado fue de diferente origen genético (Cuadro 1), compuesto por diferentes genotipos: progenitores, criollos y poblaciones originales que pertenecen a distintas regiones de la región Mixteca Poblana; así mismo, las variedades comerciales Flor de Mayo M38 y Negro Bola, que comúnmente son consumidas en la región centro-norte del país, y finalmente, germoplasma élite, que son genotipos derivados del Programa de Resistencia Horizontal en Frijol PREGEP-Genética, del Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo, México.

Las semillas se desinfestaron con hipoclorito de sodio 6 % por 3 min, se lavaron con agua destilada estéril y se colocaron en cámaras húmedas dentro de cajas petri; posteriormente, a los 10 días, se trasplantaron en vasos de unicel de 1 L de capacidad bajo condiciones de invernadero. Como sustrato se usó peat moss (Kekkilä^®, Vantaa, Finlandia), tezontle y tierra de monte en una relación de 1:2:1 (p/p/p), se monitoreó la humedad relativa (entre 70 y 85 %) y temperatura (entre 20 y 30 ^oC). Los riegos se suministraron cada tercer día. Para el primer experimento sólo se utilizaron las variedades Flor de Mayo M38 y Negro Bola. En el segundo experimento se evaluaron los 23 genotipos (Cuadro 1). En el primer experimento como testigo se utilizaron las mismas variedades (Flor de Mayo M38 y Negro Bola) en las cuales se inoculó sólo agua destilada estéril. En el segundo experimento se utilizaron las variedades Flor de Mayo y Negro Bola, como testigos por su resistencia alta-intermedia o susceptibilidad, reportada por varios autores.

Inoculación

El inóculo se preparó utilizando dos cepas de fitopatógenos causantes de tizón común, X. fuscans subsp. fuscans (Xff) y X. axonopodis pv. phaseoli (Xap), que presentan diferente grado de patogenicidad, las cuales fueron aisladas de frijol infectado en dos localidades de México (Cuadro 2). Los aislamientos se cultivaron por separado en medio agar nutritivo (AN), se incubaron a 28 ˚C durante 48 h y utilizando agua destilada estéril, se preparó por separado una suspensión acuosa con una concentración de 10⁹ UFC mL^-1 (escala de McFarland) de cada cepa bacteriana. Mediante infiltración con una jeringa estéril se inocularon 200 µL de suspensión acuosa en el envés de cada uno de los foliolos pertenecientes a una hoja por planta en la parte media del follaje. Este proceso se realizó de la misma forma en los dos experimentos. Para el primer experimento se inocularon las cepas bacterianas por separado, en el primer ambiente, la inoculación se realizó 40 días después de la germinación, mientras que en el segundo ambiente se inoculó a los 50 días después de la germinación.

La evaluación de genotipos de frijol inoculados con el patógeno, se condujo en invernadero a una temperatura media diaria que fluctuó de 25.7 a 31.5 ^oC, para lo cual se usaron calentadores eléctricos de las 22:00 h a las 5:00 h de la mañana siguiente. Este intervalo de temperatura se considera favorable para el desarrollo del patógeno. La humedad relativa se mantuvo arriba de 80 % mediante aspersión de agua al suelo durante el día y con humidificadores eléctricos durante la noche; el nivel de humedad en el ambiente se monitoreó con un psicrómetro tipo Assman. Estas condiciones ambientales fueron proporcionadas desde el momento de inoculación hasta la muerte o madurez fisiológica del órgano evaluado. La duración total a partir de la inoculación, hasta la última lectura, fue de 42 días.

Para el segundo experimento se elaboró una mezcla 1:1 de las cepas bacterianas en suspensión. En el primer y segundo ambiente la inoculación se realizó a los 40 días después de la germinación, mientras que en el tercer ambiente se inoculó a los 50 días después de la germinación. La distribución de tratamientos fue bajo un diseño experimental de bloques completos al azar con cuatro repeticiones por ambiente.

Evaluación de la severidad

Se realizaron seis evaluaciones de la severidad, una cada cinco días, después de que aparecieron los primeros síntomas, en algunas variedades éstos se observaron a los cinco días después de la inoculación. Se utilizó una escala visual modificada (Cuadro 3) de acuerdo con la propuesta del ^{CIAT (1991)}, con base en el daño expresado por unidad experimental útil, la cual consistió en los tres foliolos pertenecientes a una hoja de la parte media para cada planta inoculada.

Con los datos de severidad obtenidos, se realizó el cálculo del área bajo la curva del progreso de la enfermedad (ABCPE) mediante la siguiente expresión:

Donde: Y es la intensidad de la enfermedad con base en la escala (Cuadro 3) y t es el periodo de evaluación después de la inoculación ^{(Campbell y Madden, 1990)}.

A partir de dicha información se generaron los parámetros cuantitativos de la enfermedad para el ABCPE total de cada variedad, que fue utilizada en el análisis estadístico de los datos.

Análisis de datos

Los datos fueron sometidos a análisis de varianza donde se examinó el efecto de las inoculaciones en los genotipos entre y dentro de cada ambiente. Los valores obtenidos de ABCPE para comparar ambientes fueron ajustados con respecto al testigo correspondiente y se realizó transformación de los datos utilizando la función log natural [ln (x)], debido a que los datos no se ajustaban al cumplimiento de los supuestos estadísticos para su análisis. La información presentada en los cuadros corresponde a los datos originales. La prueba de comparación múltiple de medias (Tukey, P ≤ 0.05) se realizó para las variables que resultaron con diferencias estadísticas significativas en el análisis de varianza. La información se analizó mediante el paquete de análisis estadístico RStudio v.1.2.1335 ^{(R Core Team, 2018)}.

Experimento I

En el primer experimento (Cuadro 6), el aislamiento de Xff fue estadísticamente mayor en ABCPE (valor de 120.3) que el de Xap.^{Kaltz y Shykoff (1998)} mencionaron que la adaptación local de un patógeno no es universal y que las tasas de evolución no difieren porque los tiempos de generación o las tasas de recombinación son similares, los patógenos no tienen ninguna ventaja evolutiva sobre sus hospederos, lo que concuerda con lo observado en este experimento, donde no existió algún tipo de ventaja ambiental para ninguna cepa, por lo que la cepa de Xff mostró más virulencia que la de Xap. Con similar comportamiento, la variedad Flor de Mayo mostró una mayor ABCPE total que Negro Bola, por lo que Flor de Mayo expresó susceptibilidad a ambos patógenos (Cuadro 6).

Las mayores pérdidas causadas por el tizón común, sin importar si el causante es Xff o Xap, ocurren a temperaturas de 27 a 28 °C, humedad relativa alta (mayor de 80 %) y lluvias frecuentes ^{(Fourie, 2002}, ^{Prudencio-Sains et al., 2008)}, las cuales son semejantes a las presentadas en los trabajos de ^{Navarrete et al. (2008)} y ^{Acosta-Gallegos et al. (2013)}; no obstante, en el presente experimento, para el ciclo otoño 2020, las condiciones en el invernadero fueron de temperaturas promedio de 20 °C y humedad relativa de 40 %, mientras que en el ciclo invierno 2020-2021 las condiciones climáticas promedio fueron de 26 °C de temperatura y 62 % de humedad relativa, lo que indica que el ambiente tiene un efecto importante en el desarrollo e infección del fitopatógeno. ^{Navarrete et al. (2008)} mencionaron que las variedades Flor de Mayo Sol, Negro 8025 y Flor de Mayo Bajío son consideradas susceptibles a tizón común con base en la reacción que presentan en el follaje en condiciones de campo, y en este experimento (Cuadro 7), a pesar de que las condiciones climáticas no fueron iguales, los resultados fueron semejantes a los descritos por dichos autores. De la misma manera, Negro Bola es considerado con resistencia intermedia a la enfermedad ante variedades de Flor de Mayo evaluadas.

En el caso de la interacción, Xff × Flor de Mayo se mantuvo con la mayor ABCPE en ambos ambientes, corroborando lo descrito por ^{Navarrete et al. (2008)}, que mencionaron la susceptibilidad de esta variedad a los patógenos causantes, mientras que Negro Bola presentó una respuesta variable en los dos ambientes para ambas cepas, en especial para Xff(Cuadro 8).

Experimento II

En los experimentos realizados por ^{Navarrete y Acosta (2000)} se utilizó la mezcla de distintos genotipos bacterianos con diferente patogenicidad causantes del tizón común para la evaluación de variedades y la diferencia en patogenicidad de los aislamientos, por lo cual en el presente estudio se evaluó la mezcla de las suspensiones acuosas buscando disminuir los mecanismos de defensa de las variedades y el posible acoplamiento hospederopatógeno; sin embargo, en las observaciones se presentó una resistencia media general para la mayoría de las variedades; no obstante, destacaron en el ambiente 1 con una menor ABCPE el genotipo Ejotero, en el ambiente 2 P. acutifolius y en el ambiente 3 nuevamente P. acutifolius y Ejotero, los cuales mostraron una mayor resistencia a la mezcla de los aislamientos bacterianos. Por otro lado, en el ambiente 1 PO-4, en el ambiente 2 Mixteco-1 y Negro Puebla y en el ambiente 3 PO-54 B4, PO-4, Negro Bola y 192-A presentaron una mayor ABCPE, y por consiguiente, menor resistencia a ambas cepas en comparación con las previamente descritas (Cuadro 9).

Durante este experimento el genotipo Flor de Mayo presentó una resistencia intermedia (Cuadro 7). ^{Robinson (1987)} mencionó que el proceso de activación de mecanismos de resistencia en el hospedero y de patogenicidad en el fitopatógeno ocurre cuando éstos han coevolucionado en un mismo ambiente, y para que pueda presentarse la reacción de compatibilidad, el patógeno necesita tener los genes que le permitan vencer la resistencia del hospedante e inducir el acoplamiento; por consiguiente, si hospedero y patógeno no han coevolucionado juntos, es posible que este acoplamiento no se presente, por lo que las variedades que presentan menor ABCPE pudieran tener diferentes factores de resistencia en comparación con las variedades locales de las regiones originarias de las cepas, y por lo tanto, pueden ser útiles como fuentes de resistencia en programas de mejoramiento genético de las zonas en cuestión.

Las ABCPE totales de los ensayos 2 y 3 no presentaron diferencias estadísticamente significativas, lo que muestra que en este caso no existió una respuesta de resistencia relacionada con la edad visible en plantas con 10 días de diferencia. También se observó que en estos ambientes la media de ABCPE fue mayor que la media obtenida en el ensayo 1. Por otra parte, aunque las plantas del ambiente 1 y 2 eran de la misma edad, se observa que existe un efecto del ambiente en el carácter evaluado (Cuadro 10).

^{Arce-Espino et al. (2016)} mencionaron que al realizar mejoramiento genético por resistencia horizontal en frijol es posible acumular niveles de resistencia altos, aunque los padres sean susceptibles, siendo un proceso común en muchas variedades comerciales que se han mejorado a lo largo de varios ciclos de exposición a los patógenos. Se ha demostrado que P. acutifolius y P. coccineus L., parientes cercanos del frijol común, poseen resistencia oligogénica para X. c. pv. phaseoli, por lo que algunos genes de estas especies han sido transferidos al frijol común para mejorar su estabilidad frente a los patógenos causantes de la enfermedad ^{(Cruz et al., 2004}; ^{Opio et al., 1996)}, lo que explicaría por qué las variedades que en el presente experimento presentan las ABCPE más bajas son de origen comercial, como es el caso del frijol Ejotero, que presenta el ABCPE más baja en dos ambientes, sin superar lo observado en las plantas inoculadas con agua destilada estéril (Cuadro 11).

En la Figura 1 se muestra la interacción de las variedades en los tres ambientes de evaluación. Se observa que existen variaciones en las ABCPE totales, ocasionados por el efecto del ambiente en el fenotipo observado debido a que estas condiciones ambientales pueden modificar la acción de los genes de resistencia ^{(Arnaud-Santana et al., 1994}; ^{Navarrete y Acosta, 2000)}; sin embargo, ^{Kaltz y Shykoff (1998)} mencionaron que ciertos ambientes pueden favorecer las estrategias de defensa de los hospederos. La ausencia de una interacción estable en los ambientes evaluados indica la naturaleza horizontal o poligénica de este tipo de resistencia ^{(Cruz et al., 2004)}.

Figura 1 ABCPE totales de cada uno de los genotipos de Phaseolus spp. observadas en la interacción en el experimento ll con la mezcla de cepas bacterianas en cada uno de los tres ambientes evaluados. 

Este análisis es útil en los programas de mejoramiento genético para enfermedades, debido a que la resistencia monogénica a patógenos altamente especializados puede ser muy eficaz cuando se desarrolla por primera vez, pero generalmente es específica de la raza y no duradera, especialmente cuando se caracteriza por reacciones hipersensibles del hospedero. En cambio, la resistencia parcial condicionada por varios o muchos genes con efectos aditivos suele ser más duradera, sobre todo cuando implica cambios morfológicos o de desarrollo en la planta, y aunque se presentan excepciones a la regla de resistencia monogénica no duradera y resistencia poligénica duradera, se ha observado en la mayoría de los casos ^{(Navarrete y Acosta, 2000}; ^{Stuthman et al., 2007)}.

Con base en los resultados obtenidos los posibles genes de resistencia de los genotipos evaluados que presentaron una ABCPE mayor y más consistente en ambientes podrían ser piramidados mediante hibridación utilizando estos genotipos como progenitores para lograr una resistencia más duradera y así reducir la dependencia a plaguicidas en sistemas de producción de alto insumo, evitar el riesgo de pérdida de rendimiento por plagas en sistemas de bajo insumo, así como permitir una producción de frijol más estable en ambientes diversos ^{(Miklas et al., 2006)}.