Recolecta de conos

Los conos se recolectaron de ocho poblaciones de los estados de México, Puebla, Tlaxcala y Ciudad de México (CDMX) (Cuadro 1, Figura 1). Se seleccionaron 10 árboles adultos sanos de entre 50 y 80 años de edad por población, con una distancia mínima de 50 m entre ellos. Se recolectaron 10 conos maduros cerrados de cada árbol durante el mes de diciembre de 2021. Los conos fueron sanos, sin deformaciones y sin agujeros en el exterior causadas por insectos; después, fueron almacenados temporalmente en bolsas de papel y secados a la sombra a una temperatura diurna media de 28 °C durante 10 días, luego se mantuvieron durante otras dos semanas en condiciones de invernadero (8-40 °C) donde abrieron por completo ^{(Herrera-Hernández et al., 2024)}. En la misma fecha y sitios de recolección de conos se establecieron sitios de muestreo de 17.84 m de radio (0.1 ha), donde se contaron los individuos de la especie mayores de 25 cm de diámetro, para después estimar la densidad de árboles por hectárea para relacionarla con la germinación y características de plántulas.

Figura 1 Distribución de las ocho poblaciones de Pinus montezumae en el centro de México. Los nombres de las poblaciones se muestran en elCuadro 1. 

Prueba de germinación

La prueba de germinación se estableció el 3 de febrero del 2022 en un invernadero de plástico calibre 720 con malla sombra de 50 % a 1 m sobre la siembra. La temperatura fluctuó de 6-8 a 24-29 °C diariamente, aumentando ligeramente al final de la prueba, con 11.3 a 12 h de luz. Se usaron rejillas de 54 tubetes de 310 cm³ (6 × 9 contenedores). Se evaluó la semilla de 80 árboles (10 por población); las poblaciones y los árboles se colocaron de forma aleatoria en cada repetición, los árboles anidados en sus poblaciones. Se establecieron seis repeticiones, cada una compuesta por 720 tubetes (80 árboles × 9 contenedores). Las semillas de cada árbol se sembraron en hileras de nueve tubetes, cuatro semillas por cada tubete, o sea 36 semillas por árbol en cada repetición. Por lo tanto, se utilizaron 17,280 semillas en total (6 repeticiones × 80 árboles × 9 tubetes × 4 semillas); 216 por cada árbol para la evaluación de la germinación.

Las semillas se desinfectaron con peróxido de hidrógeno (H₂O₂) 3 % por 20 min y se sometieron a imbibición en agua destilada por 20 h. El sustrato utilizado estuvo compuesto por una mezcla de corteza composteada, turba de musgo, perlita y vermiculita en proporción volumétrica 40-40-1010, respectivamente. La semilla se depositó a 4 mm de profundidad cubiertas por una capa de gravilla de tezontle esterilizado. Se regó diariamente en la primera semana y después cada dos días. El conteo de germinación se realizó diariamente hasta el día 30 después de la siembra. Se consideró como semilla germinada al momento de la emergencia aquella con las hojas cotiledonares visibles. Las variables evaluadas para la calidad de la semilla en la germinación fueron:

Donde n _i es el número de semillas germinadas al día i y t es el tiempo de germinación desde la siembra hasta la germinación de la última semilla.

Cuarenta días después de la siembra se extrajeron 30 plántulas de cada árbol para determinar el número y la longitud de hojas cotiledonares y la longitud del hipocótilo; las mediciones se realizaron con un vernier TRUPER-14388. Se contabilizó el número de plántulas albinas por árbol.

Análisis de suelo del sitio de recolecta

Se recolectaron submuestras de suelo 1 m de distancia del fuste de cada árbol, a 10-20 cm de la superficie después de remover la hojarasca. En la mayoría de los suelos forestales esa profundidad corresponde al horizonte A, donde la actividad microbiológica y la producción de raíces finas son importantes en la absorción de agua y nutrientes, comparada con profundidades mayores ^{(Binkley y Fisher, 2020}; ^{López-Escobar et al., 2018)}. Por otro lado, en suelos de origen volcánico, como los de este estudio, la vegetación forestal depende en gran medida del fósforo orgánico que se encuentra en mayores cantidades en el suelo superficial ^{(Schlesinger y Bernhard, 2020)}. Las submuestras se mezclaron para formar una muestra compuesta por población, las que se analizaron en el Laboratorio LANISAF de la Universidad Autónoma Chapingo siguiendo la NOM 021-SEMARNAT-2000, donde se determinó: pH con la relación 1:2, concentración de amonio (NH₄ ⁺) y nitrato (NO₃ ^-) cuantificado con un analizador por inyección de flujo, fósforo estimado en un espectrofotómetro ultravioletavisible y materia orgánica evaluada con el método Walker y Black ^{(Leeper et al., 2020)}. Se consideraron estas cinco variables edáficas debido a que se ha detectado una relación con la productividad de la vegetación arbórea en el bosque ^{(Dimkpa et al., 2017)}.

Análisis estadístico

En todas las variables de germinación y crecimiento inicial de las plántulas existió una distribución normal de los residuos estandarizados sobre el gráfico Q-Q, con valores de Shapiro-Wilk desde 0.9489 (capacidad germinativa) a 0.7977 (valor pico) Pr = W < 0.0001. Estas variables se analizaron con el paquete de análisis estadístico SAS 9.4 ^{(Khatun, 2021)}. Con un modelo lineal mixto generalizado se evaluó la significancia del factor población en cada variable (P ≤ 0.05) mediante el procedimiento GLIMMIX. La comparación de las medias se realizó con la opción LSMEANS del procedimiento anterior. Para conservar el nivel de significancia se aplicó un ajuste de Tukey-Kramer.

Las variables climáticas se calcularon con la elevación, latitud y longitud media de cada población utilizando el programa ClimateNA 6.4 ^{(Wang et al., 2016)}. Los valores medios se obtuvieron a partir de los datos de 2018, 2019 y 2020, correspondientes a los años donde el clima pudo influir en el desarrollo de las semillas ^{(Parker et al., 2013)}. Se emplearon cuatro variables anuales y 16 estacionales. Se obtuvo un dato por población para cada variable poblacional. Los valores promedio por población de las variables de germinación y características de plántulas se correlacionaron con las variables edáficas, climáticas y de densidad para determinar alguna asociación entre estas variables. Se empleó el método de Spearman con P ≤ 0.05 para determinar significancia. El análisis de realizó en R.4.0.3 ^{(Goszka y Snell, 2020)}.

Germinación y características morfológicas de las plántulas

Existieron diferencias significativas (P ≤ 0.05) entre poblaciones en las variables evaluadas (Cuadro 2). La germinación media global fue similar a la reportada por ^{Camacho (1994)}, de 72 a 90 % en semilla recién cosechada, pero menor al 99.5 % reportada en árboles ubicados en rodales del estado de Michoacán con semilla recién recolectada ^{(Delgado-Valerio, 1994)}. Es común observar diferencias entre procedencias debido a la variabilidad genética entre ellas y a la variabilidad ambiental en la producción de las semillas ^{(Ganatsas et al., 2008}; ^{Xu et al., 2015)}. El valor pico y la velocidad de germinación expresan la rapidez con que ocurrió el proceso de germinación y el nivel de vigor que tenían las semillas.

La semilla de P. montezumae emergió rápidamente, 3.6 días para germinar el 50 % de lo germinado (Figura 2). A pesar de la variación de temperatura de 6 a 29 °C que ocurrió en el mes de febrero en el invernadero, la germinación de la semilla evaluada fue rápida comparada con otros pinos. Especies del complejo Pseudostrobus-Montezumae, como Pinus devoniana Lindl. y P. pseudostrobus Lindl. necesitaron 5.5 días para alcanzar la mitad de la germinación total ^{(Romero-Rangel et al., 2017)}, o un mayor valor del pico germinativo que P. hartwegii Lind. ^{(Sánchez et al., 2023)}; en esta última especie se reportan de 12 a 16 días para lograr el 50 % de germinación entre ocho intervalos de altitud, sin tendencia entre elevaciones. En otras especies de distintos grupos taxonómicos del mismo género de semillas de menor tamaño, como P. leiophylla Schiede ex Schltdl. & Cham. la semilla germinó más lentamente ^{(Gómez et al., 2010)} o P. patula Schiede ex Schltdl. & Cham. que requirió de 15 a 30 días para iniciar la emergencia en condiciones de invernadero ^{(Fuentes-Amaro et al., 2021)}. En especies del subgénero Strobus, como los pinos piñoneros P. cembroides Zucc. y P. orizabensis (D.K. Bailey) D.K. Bailey & F.G. Hawksworth, el 50 % de germinación se alcanzó en 12.7 y 13.4 días, respectivamente ^{(Hernández-Anguiano et al., 2018)}, mientras que semillas de P. chiapensis (Martínez) Andresen en promedio tardaron 14 días para alcanzar 50 % de la germinación total, seis días de diferencia entre las siete poblaciones evaluadas ^{(Capilla-Dinorin et al., 2021)}; sin embargo, no se detectó que las poblaciones de P. montezumae con mayor porcentaje de germinación alcanzaron el 50 % del total germinado en menos días.

Figura 2 Curva de germinación acumulada de Pinus montezumae Lamb. en ocho poblaciones del centro de México. 

De las 14,515 semillas germinadas, solo en tres poblaciones se detectaron plantas albinas, nueve en Tlacotenco, 10 en San Bartolo y una en Altamira; es decir, 0.14 % del total. En especies forestales se ha identificado que este fenómeno es resultado de la autofecundación relacionada con una baja densidad de árboles ^{(Takeuchi et al., 2020)}. De cualquier forma, la frecuencia relativa de plantas albinas fue inferior al 0.5 % de las plantas germinadas por población, y en la mayoría de los casos no se detectaron.

En las características morfológicas de plántulas existieron diferencias significativas (P ≤ 0.05) entre poblaciones (Cuadro 3). El 72 % de las plántulas muestreadas presentó seis o siete cotiledones (Cuadro 4). El número de cotiledones producidos en plántulas de P. patula fue 5.2 y el largo del hipocótilo 21 cm ^{(Fuentes-Amaro et al., 2020)}. Plántulas evaluadas en otro estudio en P. cembroides, P. elliottii Engelm., P. virginiana Mill. y P. echinata Mill. presentaron 11, 6.6, 5.6 y 7.5 cotiledones, respectivamente ^{(Mann, 1979)}. La diferenciación puede deberse a una adaptación al medio, ya que las especies de ambientes con estrés hídrico y nutricional podrían presentar más hojas cotiledonares de mayor tamaño debido a que funcionan como reservas durante el crecimiento ^{(Zhang et al., 2008)}.

Análisis de correlación de los indicadores de germinación

No se observó correlación entre el peso de semilla y longitud del hipocótilo (r = 0.20, P = 0.07; Cuadro 5). En plántulas de P. strobus L. el peso de la semilla influyó sobre la longitud del hipocótilo, siendo mayor cuando la semilla fue más pesada ^{(Parker et al., 2006)}. El mayor crecimiento en las primeras semanas se debe a que estas semillas poseen un embrión más grande y mayor cantidad de reservas ^{(Parker et al., 2006)}. En P. sylvestris L. se determinó una relación entre el peso de semilla y el número de cotiledones ^{(Castoldi y Molina, 2014)}, mientras que en estas poblaciones de P. montezumae no existió relación entre ambas variables (r = 0.10, P = 0.3). Aunque la diferencia en el peso de semilla fue mayor entre árboles, sí las hubo entre poblaciones (datos no mostrados), factor que puede reflejarse en el desarrollo inicial de las plántulas entre poblaciones ^{(Carles et al., 2009)}. No se encontró relación significativa de la altitud con las variables de germinación evaluadas. En el caso de P. patula, las poblaciones de mayor altitud (600 m de diferencia) produjeron semillas con mayor porcentaje y velocidad de germinación en comparación con las poblaciones de menor De las variables climáticas, la temperatura media anual se asoció con la longitud de cotiledones (r = 0.87) y el número de cotiledones (r = 0.84). Esta relación entre las características de las semillas y plántulas podrían deberse a un proceso adaptativo local (genético), en el que los árboles generan semilla más grande con el fin de generar plántulas vigorosas con capacidad de resistir el estrés ambiental que genera la temperatura; o bien, podría ser un proceso de variación morfológica (fenotipo) a causa de la fluctuación anual del ambiente. Para determinar la causa es necesario evaluar distintos ciclos reproductivos y relacionarlos con las variables climáticas. La precipitación es una variable ambiental que muestra alta influencia sobre el desarrollo de plántulas en coníferas, por lo que ha sido empleada en la construcción de modelos de predicción para producción de semilla y su capacidad germinativa ^{(Almqvist et al., 1998)}. En P. montezumae se observó correlación positiva de germinación con precipitación media anual de la localidad (r = 0.75, Cuadro 5).

En P. chiapensis la capacidad germinativa no se asoció significativamente con las variables ambientales o de densidad de árboles, aunque la velocidad de germinación lo hizo positivamente con la altitud y, por tanto, de manera negativa con la temperatura; esto es, la semilla de sitios más fríos germinó más rápido ^{(Capilla-Dinorin et al., 2021)}, lo que no ocurrió con las poblaciones de P. montezumae en estudio.

De las variables edáficas, existe relación positiva del fósforo con la germinación (r = 0.94) y el número de cotiledones (r = 0.77; Cuadro 5). Este elemento normalmente se ha relacionado con el aumento en el número de estructuras reproductivas en huertos semilleros ^{(McCavour et al., 2014)}. En el presente estudio las poblaciones de sitios con mayor precipitación se ubican en suelos más ricos en este mineral. El incremento de fósforo en el suelo promueve la producción de semilla con mejor calidad, incrementando significativamente la concentración de lípidos y proteínas en el material de reserva, necesarios en el desarrollo inicial de plántulas ^{(Taliman et al., 2019}; ^{White y Veneklaas, 2012)}. También, se observó correlación positiva entre el nitrato y la longitud del hipocótilo (r = 0.80). La correlación observada puede deberse al aumento del área foliar de los árboles al incrementarse el contenido de nitrato en el suelo, lo que a su vez representa un incremento en la eficiencia fotosintética ^{(Liu et al., 2012)}. Los fotosintatos producidos suelen distribuirse en mayor proporción en la parte aérea de los árboles ^{(Albaugh et al., 2004)}, lo que genera mayor disponibilidad de azúcares que pudieran ser utilizados en la formación de semillas con mejor calidad.

Además, la longitud de los cotiledones mostró una correlación negativa con el contenido de materia orgánica en el suelo (r = -0.94; Cuadro 5); esto muestra que los cotiledones son más largos en las poblaciones con menor contenido de materia orgánica. Se esperaba que la relación fuera positiva debido a que la materia orgánica mejora las propiedades físicas y químicas del suelo ^{(Grigal y Vance, 2000)}; sin embargo, la relación podría explicarse más como adaptación a suelos pobres donde semillas grandes darían mayor ventaja para que las plántulas se puedan establecer, tal como ocurre con la adaptación al déficit hídrico ^{(Calama et al., 2017)}. Este efecto contrario podría deberse además a la interacción con otros elementos y la densidad de árboles, este último mantiene un efecto directo en las propiedades del suelo ^{(Lei et al., 2019)}, aunque el número de árboles de P. montezumae rodeando a los árboles muestreado (densidad) no mostró correlaciones significativas con las variables evaluadas.

Implicación

Una de las especies más abundantes de los bosques del centro de México es P. montezumae. Estos macizos forestales son esenciales para más de 25 millones de personas que habitan en esta zona por su aportación de servicios ambientales y aprovechamiento maderable. Además del cambio climático y de uso de suelo, la fragmentación y la baja densidad de árboles en estos bosques podrían reducir su capacidad de regeneración natural. Un trabajo previo reciente en estas poblaciones mostró que es aceptable la producción de semilla llena por cono ^{(Herrera-Hernández et al., 2024)}, por lo que, dados los valores de germinación obtenidos, se estima que la capacidad de regeneración está en niveles aceptables.

La diferenciación morfológica de plántulas determinadas entre las poblaciones muestreadas parece ser el resultado de adaptación local a las condiciones climáticas y edáficas al encontrarse relaciones entre el desarrollo de las plantas y las variables ambientales estudiadas; por ejemplo, las poblaciones difieren en la velocidad con que sus semillas emergieron, lo que puede darle ventajas competitivas, como se ha señalado en especies que germinan más rápido ^{(Verdú y Traveset, 2005)}. La relación con los contenidos de fósforo en el suelo puede ser considerada en el manejo de las unidades productoras de germoplasma forestal, caso particular de los huertos semilleros donde se aplica fertilización alta en niveles de este nutrimento, por lo que deberían establecer estudios de fertilización y sus efectos en la producción de semillas, controlando otros factores. La densidad de árboles no presentó correlación significativa con ninguna variable, por lo que la fragmentación no es todavía limitante para la repoblación; sin embargo, al realizar la recolecta de conos para obtener semilla no se observaron muchos renuevos en las poblaciones, particularmente en las de menor elevación. Esto pudiera agravar el problema de pérdida de bosque por la extracción ilegal de madera y el cambio de uso de suelo, más los efectos de la reducción en los niveles de precipitación que han ocurrido con el cambio climático. Además de la protección a los rodales fragmentados, sería recomendable la repoblación artificial a través del uso de semilla local de árboles que crezcan alrededor de cada población muestreada.