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INTRODUCCIÓN
La contaminación de suelos agrícolas con metales provenientes de las actividades antrópicas como la minería ha aumentado en los últimos años (Hormazábal et al. 2013). Si bien algunos metales como el cobre son nutrientes esenciales, forman parte de la estructura de proteínas y participan en diversas reacciones metabólicas (Navarro-Aviñó et al. 2007, Ferreira-Cravo et al. 2009), en altas concentraciones pueden ser tóxicos para los animales y vegetales que habitan el suelo (Barros-Amorim y Scott-Fordsmand 2012, Rodríguez et al. 2015). Entre estos se encuentran las lombrices de tierra, organismos que cumplen un rol fundamental en la descomposición de la materia orgánica, el ciclo de nutrientes y la aireación del suelo.
En la evaluación del riesgo ambiental de contaminantes ambientales se deben establecer tanto la exposición como los efectos sobre los organismos. La exposición tradicionalmente se determina mediante la estimación de concentraciones de los agentes químicos en el ambiente; sin embargo, ésta no es suficiente para establecer su biodisponibilidad y por lo tanto los potenciales efectos tóxicos. Por lo anterior, la determinación del efecto de estos agentes químicos sobre los organismos del suelo se lleva a cabo por medio de bioensayos de toxicidad agudos y crónicos de mortalidad, reproducción y crecimiento de la lombriz de tierra Eisenia foetida (Ávila et al. 2007), entre otras especies. Estos bioensayos de toxicidad crónicos requieren mucho tiempo (56 días) y son costosos (Udovic y Lestan 2010). Como alternativa, se ha propuesto el bioensayo de conducta de evasión con la lombriz E. foetida, (ISO 2007, Žižek y Zidar 2013). Esta prueba se usa como herramienta de monitoreo de alerta temprana de toxicidad de suelos, ya que permite evaluar en corto tiempo (48 h) el efecto de éstos sobre la capacidad de las lombrices para seleccionar un hábitat para sus procesos biológicos y ecológico. La variable respuesta de evasión se basa en la presencia de quimiorreceptores en el prostomio y en el segmento anterior, así como la distribución de tubérculos a lo largo del cuerpo, los cuales hacen a las lombrices muy sensibles a los agentes químicos en el ambiente y les permiten evitar condiciones ambientales desfavorables gracias a su capacidad locomotriz (Curry y Schmidt 2007, Udovic y Lestan 2010).
La cuenca del río Aconcagua en la región de Valparaíso (Chile central), se caracteriza por tener importantes asentamientos urbanos, además de ser una zona de gran relevancia agrícola y minera (MOP 2004). En algunas áreas de la cuenca, los suelos de uso agrícola presentan elevados niveles de metales como cobre y plomo, los cuales estarían asociados a las emisiones proveniente de fundiciones y termoeléctricas (Aguilar et al. 2011, Ginocchio et al. 2013, González et al. 2014). Los estudios de toxicidad en esta zona se han realizado mediante bioensayos de toxicidad de reproducción, crecimiento y biomarcadores moleculares. Entre ellos destacan los trabajos realizados por Ávila et al. (2007, 2009) y Cataldo et al. (2011). Sin embargo, se desconoce si estos suelos contienen agentes químicos que pudieran afectar la capacidad de selección del hábitat de las lombrices de tierra, lo que a su vez comprometería su reproducción. Por lo anterior, el objetivo de esta investigación fue determinar la toxicidad de suelos agrícolas en la cuenca del Río Aconcagua a través de bioensayos de toxicidad aguda de comportamiento de evasión y crónico de reproducción de lombriz E. foetida, y relacionarlos con las características físicas y químicas de los suelos estudiados.
MATERIALES Y MÉTODOS
Área de estudio
En este estudio se analizaron suelos superficiales de áreas agrícolas históricamente contaminadas por las actividades mineras en Chile. Los puntos de muestreo fueron seleccionados con base en el conocimiento previo sobre la distribución espacial del Cu en los suelos agrícolas de la cuenca del río Aconcagua (Aguilar et al. 2011) y el Valle de Puchuncaví (González et al. 2014). Los sitios y puntos de muestreo se eligieron con el objetivo de obtener un gradiente de concentraciones totales de metales (Fig. 1, Cuadro I). En cada punto de muestreo se tomaron muestras de suelo en una superficie de 0.5 m2 hasta una profundidad de 20 cm. Las muestras de suelo se transportaron en bolsas plásticas al laboratorio para su caracterización física y química, y la realización de bioensayos de toxicidad (Cuadro I). Las muestras se tamizaron a través de una malla de 2 mm y luego se homogenizaron en un mezclador de cemento con cubierta de plástico. Posteriormente, se secaron en horno a una temperatura interior de 40 ºC durante 48 h. Con el fin de verificar la homogeneidad de los suelos mezclados, se obtuvieron y se analizaron cuatro submuestras de cada muestra.
Caracterización física y química de los suelos
La conductividad eléctrica se midió en solución 1:5 de suelo:agua. Los valores de pH y pCu+2 se midieron en solución de 0.1M KNO3 (1:2.5 suelo:solución) de acuerdo con Sadzawka et al. (2006). La determinación de pCu2+ (pCu2+ = -log [Cu2+], donde [Cu2+] es la actividad del ión Cu2+ libre), se realizó con un electrodo selectivo de ión Cu2+ (Rachou et al. 2007). La materia orgánica se determinó de acuerdo con Sadzawka et al. (2006). La textura de los suelos se determinó a través del método hidrométrico de Sheldrick y Wang (1993).
Las concentraciones de Cu, Zn, Pb y As se determinaron por espectroscopia de absorción atómica. Los límites de detección fueron los siguientes: Cu, 0.017 mg/kg; As, 0.086 mg/kg; Zn, 0.047 mg/kg, y Pb, 0.066 mg/kg. Las muestras de suelo se digirieron en ácido nítrico hirviendo, seguido de adición de ácido perclórico (Maxwell 1968). Se utilizaron tubos de refrigeración para evitar la volatilización del As. Para las determinaciones de las concentraciones solubles de Cu y As, se utilizó una solución de 0.1 M KNO3 como extractante (Stuckey et al. 2008). Los límites de detección fueron: Cu, 0.014 mg/L, y As, 0.005 mg/L. La calidad se aseguró mediante la digestión de forma similar en muestras de referencia certificadas: PACS-2 obtenida del Consejo de Investigación Nacional de Canadá, y GRX-2 obtenida de la United States Geological Survey. Los valores obtenidos estuvieron dentro del 10 % del valor certificado. La concentración de metales se expresa como peso seco.
Bioensayo de evasión
Los bioensayos se llevaron a cabo en recipientes de plástico de un litro de capacidad, los cuales se dividieron en dos secciones con una hoja extraíble de acuerdo con la norma ISO (ISO, 2007). En una sección se colocaron 300 g de suelo de prueba y en la otra 300 g de suelo control de una zona sin actividad minera. Los suelos fueron humedecidos antes de la realización de los bioensayos. Por cada suelo de prueba se consideraron cinco réplicas con diez lombrices cada una. Las lombrices se obtuvieron de un centro de lumbricultura Pachamama en la comuna de Quillota (V Región, Chile Central). Las lombrices presentaban el mismo tamaño y madurez sexual. Para iniciar el bioensayo, se extrajo la lámina de plástico y diez lombrices de E. foetida se colocaron en la línea media que separaba las dos secciones. Al final del tiempo de exposición de 48 h, se contó el número de lombrices en cada sección, con un régimen de 16 h luz/8 h oscuridad a una temperatura ambiental de 21 ± 2 ºC. Los suelos se consideraron tóxicos cuando el porcentaje de evasión era igual o mayor que 80 %. Para evitar que las lombrices se escapasen de los contenedores, se cubrieron con tapas de plástico transparente con agujeros para permitir el intercambio de gases y paso de la luz. La prueba se consideró inválida cuando se observó más de una lombriz por repetición muerta o desaparecida al final del periodo de prueba.
Bioensayo de reproducción
El bioensayo de reproducción en E. foetida (ISO 2012, OECD 2004) permite determinar el efecto de suelos sobre la reproducción y supervivencia de las lombrices adultas E. foetida. Para el bioensayo se colocaron 500 g de suelo en recipientes de vidrio experimentales de 750 ml. El suelo se humedeció con agua desionizada para alcanzar 60 % de su capacidad de retención de agua. La prueba se realizó a una temperatura controlada de 20 ºC ± 2 ºC, con iluminación de 400 lx. Al comienzo del bioensayo, las lombrices de tierra se lavaron con agua destilada, se secaron con papel secante y se pesaron. Diez lombrices adultas con clitelo visible (peso de 3.4 ± 0.1 g) se incubaron en cada contenedor y fueron alimentadas con estiércol humedecido. Se consideraron ocho réplicas por cada suelo; el diseño fue aleatorio. El fotoperiodo fue de 12 h de luz y 12 h de oscuridad. Después de cuatro semanas de exposición, las lombrices de tierra fueron retiradas del suelo y se determinó la supervivencia, el número de capullos y el número de juveniles.
Análisis estadístico
Para comparar las variables de respuesta entre los suelos, se aplicó una prueba de Kruskal-Wallis, utilizando un nivel de significancia de 5 %. Para normalizar los datos, éstos fueron transformados mediante la siguiente fórmula:
Después se realizó un análisis de componentes principales. Todas las pruebas se realizaron usando el programa Minitab 17.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados de las características físicas y químicas de los suelos estudiados, pH, porcentaje de materia orgánica, conductividad eléctrica, granulometría y concentración total de metales (As, Cu, Zn, Pb, solubles de As y Cu, y pCu+2, pueden observarse respecto a sus valores mínimos, máximos, media y desviación estándar en el cuadro II.
CUADRO II CONCENTRACIONES DE As, Cu, Zn Pb Y PROPIEDADES FÍSICAS Y QUÍMICAS DE LOS SUELOS DE LAS TRES LOCALIDADES ESTUDIADAS
pCu+2 logaritmo negativo de la actividad de cobre libre Cu+2
El orden de abundancia de los metales basados en el promedio de concentraciones totales de los metales considerando todos los suelos de las tres localidades fue Cu > Zn > Pb > As.
Las concentraciones de los metales están dentro de los valores reportados por Ávila et al. (2009), de 65 kg a 1579 mg/kg de cobre total y 14 a 35 mg/kg de As total; asimismo, de los encontrados por Aguilar et al. (2011) para el cobre que son de 70 mg/kg y alrededor de 700 mg/kg en zonas con y sin actividad minera, respectivamente. A diferencia de estos autores, que también trabajaron con suelos en la misma zona de estudio, el pH en este estudio fue cercano a la neutralidad y la materia orgánica fue menor, lo cual se debe a las diferencias entre puntos y épocas de muestreo. Al comparar las concentraciones de metales totales con la directiva de Kelley en Acevedo et al. (2005) para la clasificación de suelos contaminados, éstos se clasifican de acuerdo con las concentraciones de cobre total en ligera y altamente contaminados, ya que dichas concentraciones van desde los 100 mg/kg. En cuanto a las concentraciones de zinc y plomo en los suelos, éstas corresponden a valores típicos de suelos no contaminados, en tanto que los valores de arsénico representan suelos no contaminados y con contaminación ligera.
La variable de cobre total en el análisis de componentes principales no se asoció con las variables de plomo, arsénico y zinc (Fig. 2), lo cual sugiere que proviene de diferentes fuentes, tales como emisiones de material particulado desde las fundiciones y termoeléctricas cercanas a la zona de estudio, y el uso de plaguicidas con cobre en la actividad agrícola. Al respecto, se ha estimado que con una tasa recomendada de 3 kg de cobre aplicados como fungicida (Aguilar et al. 2011), con cuatro aplicaciones por año durante 40 años, en un suelo de 20 cm de profundidad y con una densidad de 1200 kg/m3, en ausencia de escorrentía de cobre en el suelo, aproximadamente 50 % de cobre aplicado en los cultivos se acumula en los suelos, en tanto que el resto es retenido por el propio cultivo. En estas condiciones, los fungicidas podrían contribuir a concentraciones de cobre de alrededor de 100 mg/kg.
Fig. 2 Distribución de las variables definidas por el análisis de componentes principales: C.E, conductividad eléctrica; M.O., materia orgánica; pCu, actividad de cobre; AsS, arsénico soluble; CuS, cobre soluble; AsT, arsénico total; CuT, cobre total; PbT, plomo total; ZnT, zinc total
El porcentaje de sobrevivencia fue de alrededor de 90 % en todos los suelos estudiados. El porcentaje de comportamiento de evasión fue significativamente más alto (superior a 80 % de evasión) en los suelos 5 y 14, donde la toxicidad fue aguda. Por el contrario, los suelos 1 y 26 son los que mostraron menor porcentaje de evasión (inferior a 20 %). La producción de capullos fue significativamente menor en los suelos 14 y 26 (p < 0.05). Respecto a la producción de juveniles, a excepción del suelo 14, no hubo diferencias significativas entre las muestras (Cuadro III).
CUADRO III COMPARACIÓN DE LOS RESULTADOS DE LOS BIOENSAYOS CRÓNICOS Y AGUDOS CON E. foetida ENTRE LOS SUELOS
Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas (p < 0.05)
Los análisis químicos de suelos muestran información de las concentraciones y extractabilidad de metales, pero no ofrecen información directa sobre la biodisponibilidad de los contaminantes para la biota (Langdon et al. 2005, Cataldo et al. 2011). Los resultados del presente estudio muestran que la mayoría de los suelos no presentan toxicidad aguda. No se encontraron diferencias significativas en el porcentaje de evasión entre suelos, con excepción de dos de ellos que presentaron las concentraciones más altas de cobre total. Respecto a la sobrevivencia y reproducción, sus valores concuerdan con los resultados reportados por Ávila et al. (2009), quienes no observaron efectos en la sobrevivencia de E. foetida a concentraciones similares encontradas en el presente estudio, lo cual sugiere que los agentes químicos en estos suelos no están en concentraciones biodisponibles o no son suficientes para provocar un efecto sobre la selección de hábitat, sobrevivencia y reproducción de E. foetida.
Respecto a las concentraciones de cobre en los suelos, éstas fueron menores a las descritas como tóxicas para lombrices de acuerdo con Barros-Amorim y Scott-Fordsmand (2012), quienes reportaron que la toxicidad de CuCl2 en ensayos de comportamiento de evasión tuvo un EC50 de 400 (378-573) mgCu/kg, valor superior al encontrado en la mayoría de las muestras del presente estudio. Otra variable que puede explicar la baja toxicidad es la capacidad de las lombrices para inducir la producción de proteínas que ligan cationes libres de metales, como es el caso del cobre, denominadas metalotioneinas (Mosleh et al. 2007). Al respecto, Cataldo et al. (2011), reportaron una correlación entre las concentraciones de cobre y metalotioneinas en E. foetida expuesta a suelos con similares niveles de concentraciones de cobre que en el presente estudio.
La menor producción de capullos se observó en el suelo que presentó una concentración de 898 mg/kg de cobre total (Cuadro III), lo cual difiere de lo reportando por Zhou et al. (2013), quienes encontraron un efecto sobre la producción de capullos en una menor concentración de cobre total (50 mg/kg). Estas diferencias se deben probablemente a que estos autores utilizaron suelos con pH más ácido y menor contenido de materia orgánica. Al respecto, se sabe que a pH ácido y bajo contenido de materia orgánica aumenta la biodisponibilidad de metales en suelos (Ávila et al. 2009). Van Gestel et al. (2009) encontraron efectos de suelos contaminados con metales en lombrices a nivel celular, pero no a nivel de organización superior, como abundancia y diversidad de especies. Estos autores atribuyen la respuesta anterior a las características de los suelos que presentaron pH alcalino y altos niveles de materia orgánica. De ahí que no necesariamente altas concentraciones de metales generen efectos tóxicos, al igual que se reporta en el presente estudio.
Por otra parte, la baja toxicidad de los suelos estudiados concuerda con los resultados obtenidos por Spurgeon et al. (1994), quienes encontraron una CL50-56-días para E. fetida de 555 mgCu/kg y 745 mgZn/kg en suelo artificial acorde con la clasificación de la Organización de Cooperación y Desarrollo Económicos (OECD, por sus siglas en inglés). Neuhauser et al. (1985) reportaron una CL50-14-días de 643 mg Cu/kg y 662 mgZn/kg en suelo artificial. Aunado a lo anterior, la baja toxicidad de los suelos en el presente estudio podría deberse a la capacidad de las lombrices de regular internamente los metales como zinc y cobre (Tiago Natal-da-Luz et al. 2014).
En el análisis de componentes principales, el primer factor explica 41 % y el segundo factor 24 % de la varianza total. En el primer factor, las variables con mayor carga fueron textura, cobre soluble, arsénico y porcentaje de evasión (Cuadro IV). La distribución de las variables en los dos factores se observa en la figura 2, donde se identifican tres grupos: a) características granulométricas, b) evasión, arena (%) y cobre total, c) plomo total, arsénico total y soluble. También se destaca aisladamente la materia orgánica (M.O.). No obstante la ausencia de diferencias significativas en la toxicidad entre suelos (p > 0.05), la concentración de cobre total es la variable que más se relaciona con la variación en el porcentaje de evasión de E. foetida entre suelos, lo que concuerda con la relación encontrada por Ávila et al. (2007) en la variable de reproducción. Lo anterior sugiere que el cobre podría ser un factor que afecta la selección del hábitat de las lombrices de tierra.
CUADRO IV CARGAS DE LAS VARIABLES FÍSICAS, QUÍMICAS Y BIOLÓGICAS EN LOS DOS PRIMEROS FACTORES DEFINIDAS EN EL ANÁLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES
C.E.: conductividad eléctrica; M.O.: materia orgánica; pCu: actividad de cobre; AsS: arsénico soluble; CuS: cobre soluble; AsT: arsénico total; CuT: cobre total; PbT: plomo total; ZnT: zinc total
Por otra parte, la variable materia orgánica contribuyó a disminuir el efecto tóxico potencial de los metales, ya que en el presente estudio se relacionó inversamente con el comportamiento de evasión, sugiriendo un efecto protector. Otro factor que pudo haber reducido la biodisponibilidad fue el contenido de arcilla, debido a su alta capacidad de intercambio catiónico.
CONCLUSIÓN
La mayoría de los suelos estudiados no contiene agentes químicos en concentraciones biodisponibles que provoquen toxicidad, tanto aguda como crónica, en E. foetida. Sin embargo, la concentración de cobre total fue la variable que más se relacionó con el porcentaje de evasión. Las variables de comportamiento de evasión y reproducción se relacionaron inversamente. Es decir, los suelos con mayor evasión tuvieron menor reproducción. Se sugiere el uso de bioensayos de comportamiento de evasión como alternativa a los de reproducción, ya que permiten tener respuestas de manera más temprana.
