Material vegetal

Se utilizaron semillas híbridas de chile (Capsicum annuum) de las siguientes variedades: jalapeño emperador NUN 70030, poblano capulín y serrano coloso.

Desinfestación de semillas

Para eliminar la posible presencia de patógenos, las semillas se incubaron en una solución de hipoclorito de sodio al 2 % (0.33 mL/L) durante 15 min, y posteriormente se hicieron seis enjuagues con agua destilada estéril.

Tratamientos y diseño experimental

Se realizaron nueve ensayos independientes en los que se empleó un diseño experimental completamente al azar. Cada ensayo corresponde a uno de los metales evaluados a tres concentraciones por variedad (Cuadro I). Se utilizaron cloruro de cadmio (CdCl₂, CAS 10108-64, Sigma Aldrich), acetato de talio (CH₃COOTl, CAS 563-68-5, Sigma Aldrich), y metavanadato de amonio (NH₄VO₃, CAS 7803-55-6, Alfa Aesar) como fuentes de Cd, Tl y V, respectivamente.

Cada tratamiento tuvo cuatro repeticiones y la unidad experimental consistió en una caja de Petri con 10 semillas. Las cajas de Petri se distribuyeron de manera aleatoria dentro de una cámara de germinación (Thermo Scientific, modelo 310M, EUA) a 25 ºC en oscuridad (^{ISTA 2009}), donde se mantuvieron debidamente hidratadas con la solución correspondiente al tratamiento asignado (metal y concentración) durante 15 días. Las cajas de Petri de los tratamientos testigo fueron hidratadas con agua destilada.

Variables evaluadas

El estudio se condujo durante 15 días dado que el rango de germinación reportado para diversas variedades de chile varía de 3 a 12 días, con niveles de germinación máxima de 5 a 7 días (^{Demir et al. 2008}, ^{Aloui et al. 2014}, ^{Ayala-Villegas et al. 2014}, ^{García-Gaytán et al. 2017}). Asimismo, el periodo de ensayo de 15 días permitió la medición del crecimiento inicial de la plántula.

Porcentaje de germinación (PG)

Esta variable se midió 15 días después del establecimiento de las semillas y correspondió al valor porcentual real de todas las semillas germinadas durante el ensayo. Se consideró la semilla germinada cuando mostró una radícula de 2 mm de longitud.

Porcentaje relativo de germinación (PRG)

Se estimó de acuerdo a la fórmula siguiente (^{Tiquia 2000}):

Índice de germinación (IG)

Se calculó de acuerdo con lo descrito por ^{Tiquia (2000}) empleando la fórmula que relaciona el porcentaje relativo de germinación y el crecimiento relativo de la radícula, la cual ha sido empleada en estudios de fitotoxicidad por metales pesados (^{Walter et al. 2006}):

donde PRG es el porcentaje relativo de germinación, variable que fue descrita previamente y CRR el crecimiento relativo de radícula, cuya fórmula de cálculo se describe posteriormente.

Coeficiente de velocidad de germinación (CVG)

Se calculó con la fórmula descrita por ^{Kader (2005)} como sigue:

donde A es el número de semillas germinadas, T el tiempo en días correspondiente a A y los números 1, 2,..x corresponden al número de días desde el inicio (1) hasta la evaluación final.

Longitud de radícula (LR) y longitud de vástago (LV)

Las longitudes de la radícula y el vástago se midieron con una regla graduada de 20 cm.

Crecimiento relativo de radícula (CRR)

Se estimó empleando la siguiente fórmula (^{Tiquia 2000}):

CRR=Longitud de radículas en semillas tratadasLongitud de radículas en semillas del testigo × 100

Análisis estadístico

Con los resultados obtenidos se realizaron análisis de varianza y pruebas de comparación de medias (diferencia mínima significativa, p ≤ 0.05), independientes para cada metal y variedad, usando el software SAS (^{SAS 2011}).

Porcentaje de germinación (PG)

En plantas superiores, el Cd puede inhibir la germinación de semillas y el crecimiento de raíces, e inducir aberraciones cromosómicas y formación de micronúcleos (^{Aslam et al. 2014}). Las semillas de chile jalapeño tratadas con Cd (25 y 50 µM) presentaron una media de porcentaje de germinación de 96.3 %, mientras que la del testigo fue de 97.5 % (Cuadro II).

En Capsicum frutescens, la aplicación de Cd a concentraciones de 75 a 600 mg/kg de suelo ocasionó efectos fitotóxicos (^{Khan y Moheman 2006}). Si bien estas concentraciones son superiores a las aquí evaluadas, debe considerarse que el suelo tiene una capacidad amortiguadora que reduce en gran medida la disponibilidad de este elemento. Asimismo, los efectos negativos del Cd se han reportado sólo cuando éste se abastece a altas concentraciones, lo que ocasiona estrés oxidativo (^{Kranner y Colville 2011}).

Las semillas de chile poblano tratadas con Cd tuvieron un promedio de germinación de 96.3 %, mientras que en el testigo éste fue de 95 %. En el caso del chile serrano, la germinación fue del 100 %, tanto en el testigo como con las dos concentraciones de Cd evaluadas (Cuadro II). Entre especies, el efecto del Cd en la germinación es diferencial. Por ejemplo, al tratar semillas de acelga (Beta vulgaris var. cicla), lechuga y espinaca con 25 µM de Cd, se redujo el porcentaje de germinación en 46, 97 y 8 %, respectivamente (^{Bautista et al. 2013}). Asimismo, los tratamientos de 10, 30, 50, 70 y 90 μmol Cd/L disminuyeron la germinación de semillas de Albizia lebbeck, en comparación con el testigo, lo cual puede atribuirse a una posible degradación de sustancias nutritivas almacenadas en las semillas (^{Farooqi et al. 2009}).

A pesar de no existir diferencias estadísticas significativas, en las tres variedades tratadas con Tl se observaron los menores porcentajes de germinación a la concentración de 25 µM, con decrementos del orden de 7.7, 5.3 y 7.5 % en las variedades jalapeño, poblano y serrano, respectivamente, en comparación con sus respectivos testigos. Con la dosis alta de Tl (50 µM), el porcentaje de germinación registrado en las variedades poblano y serrano fue el mismo que en sus testigos (Cuadro II). En semillas de arroz, el tratamiento con Tl en el intervalo 0.1 a 10 mg/L no tuvo influencia en la germinación de las semillas (^{Yao et al. 2008}). Infortunadamente, los reportes acerca del efecto del Tl en la germinación de semillas son escasos en la literatura científica especializada.

En semillas de las tres variedades de chile tratadas con V no se observaron diferencias estadísticas significativas en el porcentaje de germinación (Cuadro II). No obstante, se aprecia la misma tendencia registrada en el tratamiento con Tl en dos variedades (jalapeño y serrano), dado que el porcentaje de germinación se redujo en mayor proporción con la dosis baja de V. Con 25 µM V, la reducción en la germinación fue de 7.5, 2.5 y 5 % en las variedades jalapeño, poblano y serrano, respectivamente, en comparación con los testigos (Cuadro II). Los estudios del efecto del V en la germinación son escasos y los existentes se han realizado en gran medida en cereales. En centeno (Secale cereale) y trigo se demostró que el tratamiento con 0.1 µM de V afectó ligeramente la germinación de semillas (^{Kasai et al. 1999}). Contrario a lo aquí observado, en arroz, bajos niveles de V aceleraron la germinación, en tanto que altas dosis la inhibieron (^{Zhao et al. 2007}). Semillas de garbanzo (Cicer arietinum) incubadas durante seis días con soluciones de NaVO₃ en concentraciones de 410 a 1640 µM, mostraron un porcentaje de germinación superior al 99 % (^{Zhang et al. 2012}).

Porcentaje relativo de germinación (PRG)

Las semillas de chile jalapeño tratadas con Cd presentaron una media de porcentaje relativo de germinación de 98.7 %, mientras que las de poblano y serrano tratadas con este mismo metal presentaron 100 % de germinación relativa. Destaca el hecho de que en la variedad poblano, el suministro de 25 µM Cd elevó a 102.6 % el PRG, como se observa en el cuadro III. En trigo, la aplicación de 250 µM de Cd disminuyó la germinación en 30 % y en 25 % en las variedades Galaxy y NARC-11, respectivamente (^{Idrees et al. 2015}). También se ha reportado que la aplicación de 1 y 6 mg de Cd/L (i.e., 8.9 a 53.4 µM Cd) inhiben de 18 a 88 % el porcentaje de germinación en Suaeda salsa, respectivamente (^{Liu et al. 2012}).

En las tres variedades de chile tratadas con Tl no se observaron diferencias significativas respecto a sus testigos, aunque se observó un menor porcentaje relativo de germinación en la concentración de 25 µM, con decrementos de 7.6, 5.2 y 7.5 % en las variedades jalapeño, poblano y serrano. Con la dosis alta de Tl (50 µM), el PRG registrado en las variedades poblano y serrano fue el mismo que en los testigos, aunque para la variedad jalapeño se observó una disminución del 2.5 % respecto al testigo (Cuadro III).

En el caso de las variedades de semillas tratadas con V no se observaron diferencias estadísticas significativas en el porcentaje relativo de germinación; sin embargo, existió un decremento en esta variable de 7.6, 2.6 y 5.0 % en jalapeño, poblano y serrano, respectivamente, al tratarse con 25 µM V. De la misma manera, con la dosis alta de V (50 µM) se redujo el porcentaje relativo de germinación a 2.5 y 5.2 % en las variedades de jalapeño y poblano. Estos resultados evidencian que, de manera general, aun suministrado a bajas concentraciones el V reduce en mayor proporción el porcentaje relativo de germinación (Cuadro III).

Los estudios del efecto del V en la germinación son escasos, si bien se ha reportado que el tratamiento con 50 mg V/mL reduce el porcentaje de germinación de semillas de trigo, cebada, arroz y soya en 52, 65, 4 y 6 %, respectivamente. Además, el tratamiento con 100 mg V/mL redujo el porcentaje de germinación relativa en 90, 85, 5, y 6 %, respectivamente (^{Tham et al. 2001}).

Índice de germinación (IG)

El tratamiento con Cd no afectó de manera significativa el IG de semillas de las variedades jalapeño y serrano; por el contrario, en la variedad poblano este indicador disminuyó de manera significativa cuando las semillas se trataron con este elemento en todas las concentraciones evaluadas (Fig. 1a). El efecto del Cd observado en la variedad poblano es similar al reportado en Suaeda salsa, donde el IG disminuyó significativamente con la dosis de 0.1 mg Cd/L (^{Liu et al. 2012}). Asimismo, en semillas de Albizia lebbeck, el índice de vigor mostró una disminución gradual con el aumento de la concentración de Cd (de 10 a 90 μmol/L), en comparación con el testigo (^{Farooqi et al. 2009}).

Fig. 1 Índice de germinación (IG) de semillas de tres variedades de chile tratadas con (a) Cd, (b) Tl y (c) V. Medias ± desviación estándar con letras distintas en cada variedad por subfigura indican que existen diferencias estadísticas significativas (diferencia mínima significativa, p ≤ 0.05) 

Las semillas de las variedades jalapeño y serrano mostraron susceptibilidad diferencial al Tl. En jalapeño, el tratamiento con 50 µM Tl redujo el índice de germinación a 32.7 %. En serrano, los tratamientos con 25 y 50 µM Tl ocasionaron índices de germinación de solo 40.7 y 32.3 %, respectivamente. Por el contrario, el Tl no afectó el índice de germinación de las semillas de chile poblano (Fig. 1b).

El tratamiento con V no afectó de manera significativa el IG de las variedades jalapeño y serrano; empero, en ambas variedades se observan tendencias iguales. Por un lado, la concentración alta de V (50 µM) ocasionó índices de germinación superiores al 100 % (121 y 116.2 % en jalapeño y serrano, respectivamente). Por el contrario, la concentración baja de V (25 µM) redujo ligeramente los índices de germinación (92 y 96 % en jalapeño y serrano, respectivamente). En la variedad poblano, los índices de germinación fueron reducidos de manera significativa al aplicar 50 y 100 µM de V, con valores de 64.8 y 45.1 %, respectivamente (Fig. 1c).

El índice de germinación (IG) se utiliza en diversos estudios como indicador de fitotoxicidad. Los valores del IG menores al 50 % indican alta fitotoxicidad, valores de 50 a 80 % sugieren fitotoxicidad moderada, y valores superiores a 80 y menores a 100 % indican que no existe fitotoxicidad. Si el valor del IG excede el 100 %, se considera que el material o tratamiento empleado es un fitonutrimento o bien un fitoestimulante (^{Emino y Warman 2004}). Si bien el empleo del índice de germinación fue inicialmente reportado como parámetro útil para determinar la fitotoxicidad de las compostas, este parámetro se ha usado en estudios con otros objetivos, entre ellos la evaluación de la fitotoxicidad por metales. En arroz, la aplicación de 100 µM Cd redujo de manera significativa el índice de germinación, así como el índice de vigor y la longitud de raíces y vástago, respecto al testigo (^{He et al. 2014}). En trigo, la presencia de Cd afectó el IG, de manera que el metal resultó fitotóxico para esta especie (^{Ahmad et al. 2012}).

En nuestro estudio, el Cd resultó moderadamente fitotóxico en las concentraciones ensayadas en la variedad poblano. El Tl fue altamente fitotóxico en la variedad serrano. El V tuvo efectos diferenciales entre variedades: en jalapeño y serrano actuó como fitoestimulante; por el contrario, en la variedad poblano tuvo efectos moderadamente tóxicos cuando se suministró a 25 µM, y altamente tóxicos a 50 µM.

Coeficiente de velocidad de germinación (CVG)

El Cd afectó de manera significativa al CVG sólo en las semillas de chile serrano. En esta variedad, las concentraciones de 25 y 50 µM Cd redujeron el CVG en 19.2 y 18.4 %, respectivamente, en comparación con el testigo (Fig. 2a).

Fig. 2 Coeficiente de velocidad de germinación (CVG) de semillas de tres variedades de chile tratadas con (a) Cd, (b) Tl y (c) V. Medias ± desviación estándar con letras distintas en cada variedad por subfigura indican que existen diferencias estadísticas significativas (diferencia mínima significativa, p ≤ 0.05) 

Al aplicar dosis bajas de Tl (25 µM), el CVG disminuyó en las variedades de jalapeño y serrano en 7.1 y 15.5 % respectivamente, comparado con los testigos de cada variedad. En el caso del suministro de la dosis alta de Tl (50 µM), el CVG disminuyó en 14.2 y 12.1 % en las variedades jalapeño y serrano, respectivamente, en comparación con el testigo y se observó que estas reducciones fueron significativas. En la variedad poblano, el tratamiento con Tl no afectó el CVG (Fig. 2b).

La aplicación de V en las variedades de chile evaluadas afectó de manera diferencial al CVG. En la variedad poblano, el V no afectó los CVG de las semillas. En las semillas tratadas con V se observó que a dosis bajas (25 µM) el CVG disminuyó en 7.4, 2.4 y 8.5 % en las variedades de jalapeño, poblano y serrano, respectivamente, comparado con sus testigos, aunque estas reducciones no fueron significativas. Por otra parte, con la dosis alta de V (50 µM), aumentó aproximadamente en 22 % el CVG de semillas de la variedad jalapeño en comparación con el testigo, y tal aumento fue significativo (Fig. 2c).

La velocidad de emergencia es de suma importancia, dado que define el tiempo de establecimiento en campo de las plántulas provenientes de semilleros o viveros (^{Sobrevilla-Solis et al. 2013}). El CVG es un indicador que permite definir si la germinación de una semilla es lenta o rápida. El CVG varía de 0 a 1, valores que corresponden a la no germinación y a la rápida germinación, respectivamente (^{Sánchez et al. 2015}). Asimismo, es importante considerar que el CVG es el recíproco del tiempo promedio de germinación (^{Ranal y García 2006}), por tanto es independiente del porcentaje de germinación final (^{Kader 2005}). En este sentido se concluye que en las semillas testigo (no expuestas a Cd, Tl ni V), el tiempo de germinación tiene el orden siguiente: serrano < jalapeño < poblano, lo cual indica que las semillas de la variedad poblano tardaron mayor tiempo en germinar que las semillas de las otras dos variedades. Asimismo, los resultados muestran que la velocidad de germinación de las semillas de jalapeño no fue afectada por los tratamientos con Cd: el Tl la retrasó y el V la incrementó. La velocidad de germinación de las semillas de poblano no fue influenciada por la aplicación de Cd, Tl o V. Por el contrario, la variedad serrano fue más sensible a los metales probados, al reducirse significativamente el CVG en presencia de éstos.

Longitud de radícula

Las plántulas de chile jalapeño y serrano tratadas con Cd no presentaron cambios significativos en la longitud de radícula en comparación con el testigo. Por el contrario, la longitud de la radícula de la variedad poblano fue severamente afectada por el tratamiento con Cd, ya que los tratamientos con 25 y 50 µM Cd la redujeron en 46 y 38 %, respectivamente, en comparación con el testigo (Cuadro IV). En Albizia lebbeck, la aplicación de 10, 30, 50, 70 y 90 µmol Cd/L provocaron reducción significativa del crecimiento de raíces, al compararlo con el grupo testigo. Esto puede deberse a la afectación del metabolismo celular de las raíces, lo que ocasiona una reducción en la formación de nuevas células y en la elongación de la región de extensión de la raíz (^{Farooqi et al. 2009}).

Los tratamientos con Tl no afectaron de manera significativa la longitud de radícula en plántulas de la variedad poblano. Por otra parte, la radícula de plántulas de chile jalapeño mostró inhibición significativa de su crecimiento sólo con la concentración alta de Tl (50 µM), con decrementos del 66.2 % respecto al testigo. La variedad serrano fue la más afectada por la aplicación de Tl, dado que se redujo significativamente el crecimiento de la radícula, lo cual fue dependiente de las dosis de Tl probadas, siendo éstas del orden de 56.6 y 67.7 % con 25 y 50 µM Tl, respectivamente, en comparación con el testigo (Cuadro IV). Este efecto inhibitorio se ha reportado en col, lechuga, mijo, rábano (Raphanus sativus), nabo y trigo tratados con soluciones de Tl y V a concentraciones de 0 a 40 mg/L, encontrándose que ambos elementos reducen la elongación de la raíz (^{Carlson et al. 1991}). Asimismo se ha reportado que el Tl a concentración de 510 mg/L disminuye significativamente la longitud de la radícula y del eje embrionario de semillas de arroz (^{Yao et al. 2008}).

Los tratamientos con V incrementaron la longitud de radícula en plántulas de las variedades jalapeño y serrano, aunque estos incrementos no fueron estadísticamente significativos. En el caso de la variedad poblano, se observaron efectos negativos del tratamiento con V, al reducirse la longitud de la radícula en 33.3 y 52.3 % cuando recibieron las dosis de 25 y 50 µM, respectivamente, en comparación con el testigo (Cuadro IV).

Longitud de vástago

El Cd no tuvo efecto en la longitud de vástago de las variedades jalapeño y serrano. De manera interesante, el crecimiento del vástago en la variedad poblano fue estimulado por la adición de Cd a dosis de 25 y 50 µM, en 67.7 y 96.8 %, respectivamente, en comparación con el testigo (Cuadro V).

El Tl afectó de manera diferencial la longitud de vástago en las tres variedades de chile probadas. En las variedades jalapeño y poblano, el tratamiento con 25 µM Cd estimuló el crecimiento del vástago en 46.2 y 31.2 %, respectivamente, en comparación con sus correspondientes testigos. En contraste con lo anterior, se reporta que tratamientos de 10 a 90 µmol Cd/L afectan el crecimiento de las plántulas de Albizia lebbeck, en comparación con su grupo testigo (^{Farooqi et al. 2009}). Por otra parte, tratamientos de 0.25 mM Cd inhiben significativamente el crecimiento de la plúmula de semillas de chícharo (Pisum sativum) (^{Chugh y Sawhney 1996}).

En las dos concentraciones suministradas, el Tl redujo de manera significativa el crecimiento de la parte aérea de las plántulas de chile serrano; estas reducciones fueron de 61.2 % con 25 µM Tl y de 65.5 % con 50 µM Tl, en ambos casos respecto al testigo (Cuadro V). En pepino (Cucumis sativus), plántulas con deficiencia de potasio resultan más sensibles al tratamiento con Tl, en tanto que la aplicación de 10 µM Tl afectó la multiplicación celular de manera más evidente que la elongación y la diferenciación celular (^{Siegel y Siegel 1976}).

En las semillas tratadas con V, no se encontraron diferencias significativas en la longitud de vástago de las variedades jalapeño y serrano. Por el contrario, en chile poblano, a la dosis de 25 µM la longitud de vástago fue mayor en 56.3 % a la registrada en el testigo, y superior en 45.8 % al tratamiento con 50 µM V (Cuadro V).

Crecimiento relativo de la radícula (CRR)

El suministro de Cd a ambas dosis probadas redujo de manera significativa el crecimiento relativo de la radícula sólo en la variedad poblano. En promedio, el CRR con los tratamientos con 25 y 50 µM Cd fue de 57.9 % respecto al testigo (Fig. 3a).

Fig. 3 Crecimiento relativo de radícula (CRR) de plántulas obtenidas de semillas de tres variedades de chile tratadas con (a) Cd, (b) Tl y (c) V. Medias ± desviación estándar con letras distintas en cada variedad por subfigura indican que existen diferencias estadísticas significativas (Diferencia mínima significativa, p ≤ 0.05) 

En la variedad jalapeño, el CRR fue menor al 40 % con el tratamiento con 50 µM Tl, mientras que en la variedad serrano, con la aplicación de 25 y 50 µM Tl los valores de CRR fueron menores al 50 y 40 %, respectivamente. En la variedad poblano se observa que el Tl reduce ligeramente el CRR, pero dichas reducciones no son significativas (Fig. 3b).

En semillas tratadas con V, solamente se observaron diferencias estadísticas significativas en el valor del CRR con la variedad poblano, registrándose decrementos del 33.3 y 52.3 % a las dosis de 25 y 50 µM, respectivamente; lo anterior indica que esta variedad es más susceptible a los efectos fitotóxicos del V (Fig. 3c).