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INTRODUCCIÓN
En México y el mundo se ha incrementado el uso de plaguicidas como herramientas esenciales para el control de plagas agrícolas y enfermedades transmitidas por vectores; sin embargo, su uso representa un riesgo potencial para el ambiente y los seres humanos (Navarrete et al. 2018). Se han reportado varios efectos perjudiciales por el empleo de plaguicidas, tales como desequilibrio ecológico; toxicidad para organismos no objetivo; agotamiento de la capa de ozono; residuos de plaguicidas en alimentos, forraje, suelo y agua, y resistencia y resurgimiento de plagas (Zahirnia et al. 2019).
En la actualidad existe un gran interés sobre los contaminantes ambientales con relación a la seguridad alimentaria (Pérez et al. 2009). Debido a su uso indiscriminado, los plaguicidas de uso agrícola son una de las principales sustancias tóxicas en el ambiente que pueden contaminar los alimentos de consumo humano, representando un importante problema de inocuidad alimentaria y una grave amenaza para la salud (Thompson y Darwish 2019).
El malatión es uno de los plaguicidas más utilizados en el mundo, especialmente en países en desarrollo, donde se ha empleado desde 1956 hasta la fecha (Fuentes et al. 2010, Lasram et al. 2015). México es uno de los principales consumidores de este pesticida a nivel mundial y, de acuerdo con la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA, por su sigla en inglés), es el principal plaguicida detectado en los productos alimenticios, con una presencia del 23 % en alimentos con inspección sanitaria.
Muchos estudios toxicológicos realizados por la Agencia de Protección Ambiental (EPA, por su sigla en inglés) han clasificado al malatión como un plaguicida altamente tóxico (Arumugam et al. 2015). A pesar de que la toxicidad aguda por malatión es bien conocida, poco se sabe de la potencial toxicidad crónica causada por la exposición continua a residuos de este plaguicida en alimentos (Mostafalou y Abdollahi 2013).
Diversos estudios experimentales in vivo e in vitro apoyan la idea de que la exposición crónica a residuos de plaguicidas no persistentes como el malatión contribuye potencialmente a la alteración del metabolismo de la glucosa y los lípidos (Xiao et al. 2017, Svingen et al. 2018), el aumento de peso (Lukowicz et al. 2018), la resistencia a la insulina e hiperglucemia (Tuzcu et al. 2014, Lasram et al. 2015), el incremento del estrés oxidante y a múltiples cambios patológicos en macromoléculas celulares como ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos, proteínas y enzimas (Arab et al. 2018, Jalili et al. 2019), así como a trastornos del estado de ánimo y disbiosis de la microbiota intestinal (Roman et al. 2019).
La microbiota intestinal, definida como el conjunto de microorganismos vivos que habitan en el intestino, desempeña un papel clave en la homeostasis del hospedador y puede verse alterada, entre otros, por la presencia de residuos de plaguicidas en la dieta (Roman et al. 2019). Se ha demostrado que varios compuestos ambientales inhiben el crecimiento bacteriano gastrointestinal o inducen disbiosis, la cual se ha relacionado con una serie de enfermedades intestinales y sistémicas como diabetes tipo 2 y obesidad (Claus et al. 2017, Gao et al. 2017).
Lactobacillus es un género de bacterias grampositivas, anaeróbicas y aerotolerantes pertenecientes al filo de los Firmicutes que impacta funciones fisiológicas del hospedador a través de su actividad metabólica (Krishnan et al. 2015, Serra 2016). Muchos probióticos utilizados actualmente provienen del género Lactobacillus y su administración en forma de alimentos o suplementos confiere diversos beneficios a la salud del hospedador, como reducción del estrés oxidante (Tian et al. 2017) y disminución de la absorción y toxicidad de organofosforados (Trinder et al. 2016); asimismo, se han asociado con diferentes efectos en el cambio de peso (Million et al. 2012, Drissi et al. 2014, Kang y Cai 2018, Kim et al. 2018) y el control o mejora de pacientes con diabetes mellitus tipo 2 (Evivie et al. 2017, Palacios et al. 2017, Khalili et al. 2019, Niibo et al. 2019, Venkataraman et al. 2019). Estas propiedades pueden indicar que el género Lactobacillus es una herramienta potencialmente eficaz contra la toxicidad originada por el consumo de residuos de plaguicidas presentes en los alimentos. Por ello consideramos necesario determinar qué especies de Lactobacillus son resistentes al malatión, ya que pueden servir como agentes protectores ante los efectos nocivos de este pesticida.
MATERIALES Y MÉTODOS
El presente estudio se llevó a cabo en las instalaciones del Laboratorio de Micoplasmas del Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas del Instituto de Ciencias de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla (BUAP).
Productos químicos
Se utilizó insecticida de grado comercial malatión 1000 de Agroquímica Tridente (O,O-dimetil fosforoditioato de dietil mercapto succinato al 83.60 %, disolventes y emulsificantes ≤ 16.40 %).
Con el fin de conocer la resistencia de Lactobacillus spp. a malatión se prepararon seis soluciones a diferentes concentraciones de este insecticida (83.6, 50, 20, 10, 1 y 0.1 %) utilizando agua estéril como solvente. Las diluciones se elaboraron utilizando la fórmula C 1 V 1 = C 2 V 2 , donde C 1 y C 2 representan las concentraciones de las soluciones inicial y final, respectivamente, y V 1 y V 2 representan sus volúmenes. Las soluciones se catalogaron como dosis altas (83.6 y 50 %), dosis medias (20 y 10 %) y dosis bajas (1 y 0.1 %) de acuerdo con la cantidad de principio activo presente.
Medios y condiciones de cultivo
Los lactobacilos aislados se cultivaron en caldo o agar Mann-Rogosa-Sharp (MRS) a 37 ºC durante 24-48 h, en condiciones de aerobiosis.
Obtención y procesamiento de la muestra
Las especies de Lactobacillus fueron aisladas a partir de distintos suplementos alimenticios (probióticos) de marcas comerciales. Las muestras se sembraron en caldo MRS durante 24 h para activar los probióticos y posteriormente se sembraron en agar MRS a 37 ºC durante 24-48 h, para su aislamiento.
Las especies que presumiblemente pertenecían al género Lactobacillus se seleccionaron con base en las características morfológicas de sus colonias, observación microscópica y la prueba de la catalasa.
Prueba de catalasa
La presencia de la enzima catalasa fue verificada colocando una gota de peróxido de hidrogeno (H2O2) al 3 % en contacto con una colonia de cada aislado bacteriano. La catalasa descompone el H2O2 en agua y oxígeno, generando el desprendimiento de burbujas (Reiner 2010). La ausencia de burbujas indicó que las bacterias no presentaban actividad catalasa, característica del género Lactobacillus. Como control positivo se utilizó una cepa de Staphylococus aureus y como control negativo una cepa de Lactobacillus rhamnosus donadas por el Centro de Detección Biomolecular (CDB) de la BUAP.
Extracción de ADN e identificación mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Las muestras de ADN se extrajeron de los aislados que cumplían las características de Lactobacillus, utilizando el kit de extracción Quick-DNATM Universal Kit de Zymo Research y siguiendo las instrucciones del fabricante. Las especies de Lactobacillus se identificaron mediante la técnica de PCR punto final en un termociclador Techne TC-412, utilizando el kit DreamTaq PCR Máster Mix (2X) de Thermo Scientific y siguiendo las instrucciones del fabricante. Los iniciadores específicos para cada especie de Lactobacillus empleados en el presente estudio fueron descritos en trabajos previos (Kwon et al. 2005, Vergara 2018) y sintetizados por la empresa T4 Oligo (Cuadro I). Como controles positivos se utilizaron cepas donadas por el CDB de la BUAP. Para la conservación de los controles positivos y de cada aislado se utilizó caldo MRS y glicerol al 25 %, y fueron almacenadas a -80 ºC. Los productos fueron observados usando electroforesis en gel de agarosa al 2 %.
CUADRO I INICIADORES PARA Lactobacillus spp. UTILIZADOS EN ESTE ESTUDIO.
| Especie de Lactobacillus | Iniciador | Secuencia (5´-3´) | Tamaño del fragmento (pb) |
| L. fermentum | Lfer-3F Lfer-3R | ACTAACTTGACTGATCTACGA TTCACTGCTCAAGTAATCATC | 192 |
| L. plantarum | Lpla-3F Lpla-3R | ATTCATAGTCTAGTTGGAGGT CCTGAACTGAGAGAATTTGA | 248 |
| L. reuteri | Lreu-4F Lreu-4R | CAGACAATCTTTGATTGTTTAG GCTTGTTGGTTTGGGCTCTTC | 303 |
| L. acidophilus | Laci-F Laci-R | AGCTGAACCAACAGATTCAC ACTACCAGGGTATCTAATCC | 210 |
| L. rhamnosus | Lrha-F Lrha-R | CAGACTGAAAGTCTGACGG GCGATGCGAATTTCTATTATT | 190 |
| L. casei | Lcas-F Lcas-F | CTCAAAGCCGTGACGGTC ACGTGGTGCTAATAATCCTAGTG | 742 |
| L. brevis | Lbre-F Lbre-R | GAAGCTAGTGGCGAACTGGT CTCCCAGTTTCCGATGCAC | 563 |
| L. salivarius | Lsal-F Lfsal-R | AGGTTCGAAAGCGTGGGTAG TCCCCGAAGGGAAAGCCTAA | 280 |
Nota: los iniciadores específicos para cada especie de Lactobacillus fueron descritos en trabajos previos (Kwon et al. 2005, Vergara 2018) y sintetizados por la empresa T4 Oligo.
Resistencia de Lactobacillus al malatión
Para determinar la resistencia de las distintas especies de Lactobacillus aisladas al pesticida malatión 1000, se hicieron bioensayos mediante la técnica de Kirby-Bauer (Hudzicki 2009), impregnando discos estériles de 6 mm de diámetro con 5 µL del pesticida a seis diferentes concentraciones de ingrediente activo (83.6, 50, 20, 10, 1 y 0.1 %). Se establecieron dos controles: el primero, con cada uno de los Lactobacillus sin plaguicida con el fin de monitorizar el crecimiento del microorganismo durante el tiempo del ensayo; el segundo, con cada una de las seis concentraciones del insecticida sin inóculo para garantizar que no estuviesen previamente contaminadas por microorganismos.
Las suspensiones de Lactobacillus se prepararon en caldo MRS y se incubaron durante 24-48 h a 37 ºC. Las suspensiones se ajustaron al estándar 0.5 en la escala de McFarland equivalente a 1.5 × 108 unidades formadoras de colonias (UFC)/mL, se sembraron en placas Petri con agar MRS y se procedió a colocar los discos a diferentes concentraciones de malatión. Las placas se incubaron a 37 ºC durante 24-48 h y se procedió a medir el diámetro de los halos de inhibición (Hudzicki 2009). De acuerdo con el tamaño en milímetros de los halos de inhibición, se determinó si las diversas especies de Lactobacillus eran sensibles (S), intermedias (moderadamente sensibles) (I) o resistentes (R) a las distintas concentraciones de malatión. Todas las pruebas se realizaron por duplicado.
RESULTADOS
Se aislaron e identificaron un total de ocho especies del género Lactobacillus (L. acidophilus, L. brevis, L. casei, L. fermentum, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus y L. salivarius) presentes en los suplementos alimenticios (probióticos). La selección de especies se realizó de acuerdo con las características fenotípicas del género (Cuadro II) y la identificación a nivel de especie se realizó por medio de la técnica de PCR punto final. Los productos de PCR se observaron usando electroforesis en gel de agarosa al 2 % (Fig. 1a-d).
CUADRO II CARACTERÍSTICAS DEL GÉNERO Lactobacillus.
| Prueba | Resultado |
| Colonias | Pequeñas, circulares, convexas, suaves y blancas |
| Tinción de Gram | Bacilos grampositivos |
| Catalasa | Negativa |
Fig. 1 Electroforesis en gel de agarosa al 2 % de productos obtenidos mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de ocho especies del género Lactobacillus aisladas de productos alimenticios (probióticos). (a) Carril 1: marcador de peso molecular de 100 Pb; carril 2: muestra; carril 3: control positivo (Lactobacillus fermentum); carril 4: control negativo; carril 9: muestra; carril 10: control positivo (Lactobacillus reuteri). (b) Carril 1: marcador de peso molecular de 100 Pb; carril 2: control negativo; carril 3: muestra; carril 4: control positivo (Lactobacillus salivarius); carril 6: muestra; carril 7: control positivo (Lactobacillus brevis). (c) Carril 1: marcador de peso molecular de 100 Pb; carril 2: control negativo; carril 7: muestra; carril 8: muestra; carril 9: control positivo (Lactobacillus rhamnosus); carril 10: muestra; carril 11: control positivo (Lactobacillus casei). (d) Carril 1: marcador de peso molecular de 100 Pb; carril 2: muestra; carril 3: control positivo (Lactobacillus acidophilus); carril 4: control negativo; carril 6: muestra; carril 7: control positivo (Lactobacillus plantarum).
El cuadro III muestra la resistencia de las ocho especies de Lactobacillus aisladas de suplementos probióticos a distintas concentraciones de malatión 1000 mediante la técnica de Kirby-Bauer. Los resultados se expresan como: sensible (S) si el diámetro del halo es mayor de 11 mm, intermedio o moderadamente sensible (I) si el diámetro del halo es de 7-11 mm, y resistente (R) si el diámetro del halo es menor de 7 mm.
CUADRO III RESISTENCIA DE Lactobacillus A DISTINTAS CONCENTRACIONES DE MALATIÓN 1000.
| Especie de Lactobacillus | Concentración de malatión 1000 (%) | |||||
| 83.6 | 50.0 | 20.0 | 10.0 | 1.0 | 0.1 | |
| L. reuteri | I | R | R | R | R | R |
| L. plantarum | S | I | R | R | R | R |
| L. brevis | S | I | I | R | R | R |
| L. salivarius | S | S | S | S | I | R |
| L. acidophilus | S | I | I | I | R | R |
| L. fermentum | S | I | I | R | R | R |
| L. casei | S | I | R | R | R | R |
| L. rhamnosus | S | S | S | I | R | R |
Nota: los resultados se obtuvieron por duplicado mediante el método de Kirby-Bauer y se expresan como: sensible (S), intermedio o moderadamente sensible (I) y resistente (R).
Todas las especies de Lactobacillus evaluadas, a excepción de Lactobacillus salivarius (Fig. 2b), fueron capaces de crecer en presencia de malatión a dosis bajas (0.1, 1 %); sin embargo, la resistencia a dosis medias (10, 20 %) varía entre especies, mientras que a dosis altas (50, 83.6 %) no hubo crecimiento o el número de colonias fue visiblemente menor con relación al grupo control.
DISCUSIÓN
Debido a la preocupación existente por la presencia de residuos de plaguicidas en los alimentos y a sus diversos efectos sobre la salud, se investigó la resistencia de Lactobacillus spp. a distintas concentraciones de malatión. La agricultura convencional utiliza plaguicidas para reducir las pérdidas debidas al ataque de determinados organismos vivos convertidos en plagas, por lo que no es extraña la presencia de estos compuestos en diversos alimentos. Expertos como la comisión del Codex Alimentarius, la EPA y la FDA establecen límites máximos de residuos de plaguicidas en los alimentos más comunes, los cuales garantizan que el riesgo a corto y a largo plazo sea insignificante para la gran mayoría de los consumidores; sin embargo, diversos estudios (p. ej., Thompson y Darwish 2019) destacan que la contaminación por sustancias provenientes del ambiente es un problema mundial importante de inocuidad alimentaria y que incluso a dosis muy bajas estos pesticidas pueden representar una grave amenaza para la salud.
Estudios sobre el consumo de probióticos, en particular especies del género Lactobacillus, han demostrado que estas bacterias disminuyen la absorción y toxicidad de plaguicidas organofosforados como el malatión (Trinder et al. 2016) e influyen en las funciones fisiológicas del hospedador a través de su actividad metabólica, mejorando su salud (Krishnan et al. 2015). La capacidad probiótica de las bacterias del género Lactobacillus y sus múltiples beneficios citados en la literatura permiten inferir que su ingesta podría ofrecer un efecto benéfico ante el consumo de alimentos contaminados con residuos de plaguicidas organofosforados como el malatión. Consideraciones de este tipo nos han motivado a llevar a cabo el presente estudio para identificar las especies probióticas de Lactobacillus que puedan ser resistentes a dosis bajas del malatión.
Los resultados obtenidos muestran que la resistencia a malatión entre especies de Lactobacillus es diferente y varía de acuerdo con la concentración a la que son expuestas. De las ocho especies investigadas, L. reuteri, L. plantarum y L. casei mostraron una mayor resistencia a concentraciones elevadas de malatión, mientras que L. rhamnosus, L. acidophilus, L. brevis, y L. fermentum resistieron concentraciones menores y el crecimiento de L. salivarium se vio afectado ante las concentraciones más bajas del pesticida.
Esto podría indicar que lo mismo ocurre con las especies que se desarrollan en el intestino del hombre, lo cual nos conduciría a sugerir el uso de probióticos para controlar o contrarrestar los posibles efectos tóxicos y comorbilidades ocasionadas por el consumo crónico de plaguicidas presentes en los alimentos, ya que la exposición a éstos a través de sus residuos no puede evitarse por completo. En este sentido, los controles efectuados por la FDA (2017), descritos en el resumen de residuos de plaguicidas presentes en alimentos, demuestran que cerca del 48 % de los productos analizados contienen uno o más residuos y el 4 % supera los límites permisibles, ya sea por exceso de residuos o bien por haberse detectado la presencia de un plaguicida no autorizado para ese producto alimentario.
Diversos autores concuerdan en que algunos microrganismos pueden utilizar los plaguicidas organofosforados como fuente de carbono y fosforo (Subramanian et al. 1994, Zhang et al. 2014) y que las enzimas aisladas de estos microorganismos, como la carboxilesterasa y la fosfatasa, presentes en Lactobacillus, pueden reducir las concentraciones de estos compuestos y por lo tanto sus efectos tóxicos (Zhou y Zhao 2015, Trinder et al. 2016).
Nuestros resultados concuerdan con investigaciones previas en las que se han utilizado bacterias acidolácticas, entre ellas L. casei y L. plantarum, para disminuir las concentraciones de diversos plaguicidas organofosforados en leche descremada (Zhao y Wang 2012, Zhang et al. 2014, Zhou y Zhao 2015).
Singh et al. (2013) y Sirajuddin et al. (2019) demostraron la eficiencia de la enzima carboxilesterasa en la degradación de malatión por microorganismos que lo utilizan como fuente de energía, por lo que probablemente la resistencia de Lactobacillus spp. a distintas concentraciones de malatión dependa de la cantidad de fosfatasa y carboxilesterasa producida por cada especie.
Cabe mencionar que las concentraciones de malatión empleadas en este estudio se definieron como altas o bajas conforme a la cantidad de principio activo presente en cada solución; asimismo, la concentración más baja empleada en el estudio (0.1 %) supera el límite máximo de residuos (LMR) permitido en alimentos y en algunos casos es mayor a concentraciones utilizadas en estudios previos. Sin embargo, no consideramos necesario realizar pruebas de resistencia a concentraciones más bajas, dado que las ocho especies de lactobacilos evaluadas fueron resistentes a esta concentración.
Hoy en día existe un interés creciente por disminuir los efectos tóxicos a la salud motivados por el consumo de alimentos contaminados con plaguicidas. La eficacia limitada y los efectos adversos de diversos medicamentos han detonado el interés por generar nuevos tratamientos para prevenir o disminuir los problemas a la salud con el uso de bioterapias como el consumo de microorganismos probioticos (Arumugam et al. 2015, Trinder et al. 2016, Tian et al. 2017) y otros antioxidantes naturales (Kotb et al. 2016, Ghorbani et al. 2020, Gupta et al. 2020).
Nuestro estudio puede conducir a la caracterización del potencial de diversas especies de Lactobacillus spp. resistentes al malatión (y probablemente a otros plaguicidas organofosforados) para contrarrestar los efectos del consumo de alimentos contaminados con plaguicidas, mediante el estudio de un modelo in vivo que demuestre la utilidad de este género de bacterias probióticas.
Aunque el objetivo fundamental de la presente investigación es determinar la resistencia de Lactobacillus spp. a malatión, se sugiere determinar la resistencia de diversas especies de microorganismos probióticos a plaguicidas organofosforados, con el fin de contrarrestar los efectos a la salud y las comorbilidades asociadas al consumo de alimentos contaminados con residuos de estos compuestos.
CONCLUSIONES
No todos los individuos del género Lactobacillus presentan la misma resistencia a las concentraciones de malatión, las cuales varían de acuerdo con la especie. Siete especies de Lactobacillus (L. acidophilus, L. brevis, L. casei, L. fermentum, L. plantarum, L. reuteri y L. rhamnosus) podrían presentar un efecto benéfico ante el consumo de alimentos contaminados con residuos de malatión y otros plaguicidas organofosforados.
La evaluación de la resistencia de Lactobacillus spp. a las diferentes concentraciones de malatión 1000 permitirá seleccionar aquellas especies que tengan posible actividad protectora ante el consumo de residuos de plaguicidas; sin embargo, se requieren estudios in vivo para validar sus efectos benéficos.
