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INTRODUCCIÓN
Ganoderma (Basidiomycota: Aphylloporales) es un género de hongos lignícolas, los cuales actúan como saprobios sobre la madera en descomposición y como parásitos de árboles en ambientes ruderales y urbanos. Algunas especies como G. boninense, G. applanatum, G. resinaceum y G. adspersum ocasionan grandes pérdidas económicas en la industria maderera, explotación palmícola y en diferentes tipos de cultivos arborícolas, al ser causantes de la pudrición basal del tallo (Schwarze y Ferner 2003). Además, poseen una distribución cosmopolita (Moncalvo y Buchanan 2008, Suárez-Medellín et al. 2012, Pinzón-Osorio y Pinzón-Osorio 2016). México cuenta con una amplia distribución de este género, existen más de 16 especies registradas en el territorio nacional. El estado de Sonora tiene el 50 % de las especies registradas para el país (Torres-Torres et al. 2015, López-Peña et al. 2016).
Las especies de Ganoderma han desarrollado distintas formas de vida que las hacen aptas para aprovechar los recursos de su entorno (Boddy y Hiscox 2016, Hiscox et al. 2017). Como organismos fúngicos, son capaces de degradar la materia orgánica a moléculas de agua, incluyendo las moléculas de lignina, celulosa y hemicelulosa. Esto gracias a su metabolismo, específicamente a la producción y acción de las enzimas ligninolíticas (EL) como la lacasa (EC 1.10.3.2), la lignina peroxidasa (LiP, EC 1.11.1.14), y la manganeso peroxidasa (MnP, EC 1.11.1.13, Xuan-Wei et al. 2013). La actividad de estas enzimas en el reino Fungi es una cualidad cepa-especie dependiente (Téllez-Téllez et al. 2012).
Sin embargo, se ha demostrado que los basidiomicetos, incluyendo Ganoderma (da Silva et al. 2010a, Maciel et al. 2013), pueden incrementar su actividad enzimática ligninolítica al estar expuestos a estresores (Piscitelli et al. 2011), cuya definición ecológica es cualquier actividad antrópica que resulte en un cambio ambiental que llevará al sistema u organismo estudiado fuera de su rango operativo normal (Sabater et al. 2019). Por lo tanto, el estrés asociado con la agricultura y la urbanización, por ejemplo, la sedimentación, el cambio en la composición nutrimental del suelo y la contaminación, pueden modificar la composición de la comunidad fúngica y con ello su actividad enzimática y metabólica (Hiscox et al. 2010, Boddy y Hiscox 2016, Juvigny-Khenafou et al. 2020). No obstante, además de los estresores como inductores de EL, las interacciones hongo-hongo en cocultivo también inducen la producción de enzimas y metabolitos secundarios (Bader et al. 2010, Yu et al. 2021). A nivel micelio, estas interacciones pueden resultar en bloqueos a distancia, bloqueos al contacto y reemplazos totales o parciales (Badalyan et al. 2002).
Por otra parte, algunos hongos microscópicos filamentosos como Trichoderma spp. pueden ser útiles como agentes de control biológico contra especies fitopatógenas de Ganoderma (Naher et al. 2012a, Lee-Pei et al. 2016). Sin embargo, en la naturaleza, ambos géneros se encuentran en interacción causándose mutuamente un estrés biótico, el cual resulta en el incremento o decremento de la actividad enzimática ligninolítica o proteolítica según las especies involucradas (Fang-Sim et al. 2019, Muniroh et al. 2019). Al respecto, Ijoma et al. (2018) reportaron que Trichoderma harzianum es capaz de reemplazar a Ganoderma lucidum en un cultivo dual, y en la interacción, G. lucidum aumentó la actividad de la lacasa y la MnP como respuesta al reemplazo.
La información sobre interacciones fúngicas entre cepas (o poblaciones) de Ganoderma spp. y Trichoderma spp. es escasa, más si se trata de cepas aisladas en diferentes ambientes con actividad antrópica. Por lo tanto, la presente investigación establece la siguiente hipótesis: la población de Ganoderma spp. aislada de un ambiente urbano (mayor perturbación) posee mayor actividad enzimática ligninolítica, en comparación con la población aislada de un ambiente ruderal (menos perturbado). Además, Trichoderma spp. posee habilidad para reemplazar a Ganoderma spp. bajo condiciones in vitro. En consecuencia, los objetivos del presente estudio fueron: 1) evaluar la actividad enzimática ligninolítica de cepas de Ganoderma spp. colectadas y aisladas de dos ambientes estresores (ruderal y urbano), 2) determinar el tipo de interacción fúngica de cada población de Ganoderma spp. con cepas de Trichoderma spp., como agentes de control biológico y 3) cuantificar la actividad de las EL en las interacciones entre las poblaciones de Ganoderma spp. y Trichoderma spp.
MATERIALES Y MÉTODOS
Sitios de colecta
Se colectaron carpóforos de dos poblaciones de Ganoderma spp. relacionadas con diferentes actividades antrópicas. Se consideró población urbana a las cepas aisladas de carpóforos colectados dentro de la ciudad de Colima, Colima, México. Mientras que las cepas aisladas de carpóforos colectados de árboles situados dentro áreas de cultivos agrícolas [p. e. palma de coco (Cocos nucifera L.), limón (Citrus aurantifolia (Christm.) Swingle) y papaya (Carica papaya L.)] se les denominó población ruderal. Los sitios de colecta se situaron entre los meridianos 103º 29’ 20’’ y 104º 41’ 42’’ de longitud O y entre los paralelos 18º 41’ 12’’ y 19º 31’ 00’’ de latitud, en el municipio de Tecomán, Colima, México.
Aislamiento de cepas de Ganoderma spp.
Los cuerpos fructíferos se desinfectaron como lo describe Chaparro et al. (2009). Los carpóforos se cortaron en trozos pequeños (0.5 x 0.5 cm) y se lavaron con: 1) hipoclorito de sodio 5 % (3 min), alcohol etílico 70 % (3 min) y agua destilada estéril (ADE) (3 min). Una vez desinfectados, en campana de flujo laminar, se colocaron hasta cinco trozos por caja de Petri en agar dextrosa papa (ADP, MCD Lab., Tlalnepantla, Edo. de México), suplementado con 100 ppm de cloranfenicol (97.0-103.0 % de pureza). Las cajas de Petri sembradas se incubaron por 10 días bajo condiciones de laboratorio a 26 ± 3 ºC, 75 ± 5 % de humedad relativa y 10:14 h luz:oscuridad. El micelio se purificó en nuevas cajas de Petri. Se aislaron veinte cepas de Ganoderma spp. en cada uno de los ambientes (urbano y ruderal). Sin embargo, para los experimentos se emplearon siete cepas de cada ambiente, las cuales presentaron actividad enzimática ligninolítica. La pertenencia al género Ganoderma y al orden Polyporales (Basidiomycetes, Fungi) se corroboró con el micelio de los aislamientos al detectar fíbulas, estructuras que se producen entre dos células binucleadas en el Phylum Basidiomicetes.
Tasa de crecimiento diaria (TCD)
La TCD de las cepas de las poblaciones urbana y ruderal se determinó en medio de cultivo Sivakumar (Sivakumar et al. 2010). El medio se preparó disolviendo: glucosa (20 g/L), extracto de levadura (2.5 g/L), KH2PO4 (1.0 g/L), (NH4)2SO4 (0.05 g/L), MgSO4 (0.5 g/L), CaCl2 (0.01 g/L), FeSO4 (0.01 g/L), MnSO4 (0.001 g/L), ZnSO4 (0.001 g/L), CuSO4 (0.001 g/L) y agar bacteriológico (20 g/L). En el centro de cajas de Petri (100 mm de Ɵ) con medio Sivakumar se resembró un disco de agar micelio, la TCD se obtuvo midiendo el crecimiento de los micelios empleando una escuadra milimétrica cada 24 h durante 10 días. Se emplearon seis repeticiones por cada cepa aislada. El bioensayo se desarrolló en las condiciones de laboratorio descritas anteriormente. La TCD se calculó con la fórmula: TCD = [(R1 - R0) / (T1 - T0) / n], donde n = número de evaluaciones, R1 y R2 fueron el crecimiento radial del hongo (mm) en los tiempos T1 y T2 en días (Baldrian y Gabriel 2002).
Actividad enzimática ligninolítica de cepas urbanas y ruderales de Ganoderma spp.
Se determinaron las actividades de EL (lacasa, MnP y LiP) en la población urbana y ruderal de Ganoderma spp. Para ello, se preparó un extracto enzimático libre de micelio. Se extrajeron diez discos (6 mm de Ɵ) de micelio agar de cajas de Petri con 12 días de crecimiento. Los discos micelio-agar se colocaron en un tubo Falcon de 25 mL, se les adicionó 10 mL de ADE. Los tubos se agitaron en vórtex (Ika, modelo Vortex Genius 3, Staufen, Alemania) por cinco minutos, después el extracto resultante se filtró con papel Whatman No. 1 por succión en bomba de vacío. El filtrado resultante se utilizó para determinar la actividad enzimática ligninolítica (Arámbula-Zúñiga 2017). Todos los reactivos que se utilizaron en el presente estudio fueron de Sigma-Aldrich®, San Luis, Missouri, EUA.
Actividad de la lacasa
Se cuantificó por la oxidación de ABTS [ácido 2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico)]. El volumen total de la mezcla de reacción fue de 1 mL, se le agregaron 500 µL de extracto enzimático, 400 µL de acetato de sodio como amortiguador (0.1 M, pH 4.5) y 100 µL de ABTS (5 mM). La oxidación del sustrato se monitoreó por tres minutos en un espectrofotómetro (Luzeren®, LS6, EUA) a una longitud de onda de 420 nm, una mezcla de reacción sin ABTS se empleó como testigo. Una unidad de actividad enzimática de lacasa se definió como la cantidad de la lacasa que oxida 1 µmol de sustrato (ABTS)/mL/min. La actividad de la lacasa se expresó como unidad de actividad volumétrica (U/L, Sunil et al. 2011).
Actividad de la manganeso peroxidasa (MnP)
Se cuantificó por la oxidación de Mn+2 a Mn+3 siguiendo la metodología descrita por Gleen y Gold (1983). La reacción se realizó en 1 mL conteniendo 0.2 % de rojo fenol (50 µL), 50 µL de lactato de sodio 25 mM, 50 µL de MnSO4 2 mM, 0.1 % de albúmina de huevo (50 µL), 50 µL de succinato de sodio 50 mM a pH 4.5 y 700 µL de extracto enzimático. La reacción comenzó al agregarle 50 µL de H2O2 2 mM y se detuvo después de cinco minutos al adicionarle 50 µL de NaOH 2 N. La absorbancia se leyó a 610 nm y se contrastó contra un testigo sin H2O2 en la mezcla de reacción. El coeficiente de extinción molar del rojo de fenol oxidado es de 22 mM/cm. Una unidad se definió como la cantidad de MnP necesaria para oxidar 1 µmol de rojo fenol/mL/minuto. La actividad de la MnP se expresó como actividad enzimática volumétrica (U/L).
Actividad de la lignina peroxidasa
Se determinó por la oxidación de alcohol veratrílico a veratril aldehído a 310 nm. El volumen de la mezcla de reacción fue de 2.5 mL y estuvo compuesta de 1.8 mL de extracto enzimático, 0.1 mL de alcohol veratrílico 50 mM, 0.5 mL tartrato de sodio 0.5 M como amortiguador (pH 3.0) y 0.1 mL de H2O2 10 mM a temperatura ambiente. Se consideró una unidad de actividad enzimática como la cantidad de enzima que oxida un µmol de alcohol veratrílico/mL/min. La actividad de la LiP se expresó como actividad enzimática volumétrica (U/L) (Magalhães et al. 1996).
Diseño experimental y análisis de datos
Cada población de Ganoderma spp. se consideró un grupo independiente para su análisis estadístico. Asimismo, cada cepa dentro de cada grupo se tomó en cuenta como un tratamiento. Cada población consistió en siete individuos (réplicas). Mientras que cada aislamiento en cada población se estableció con seis réplicas. La actividad enzimática (lacasa, MnP y LiP) entre las dos poblaciones de Ganoderma fue analizada a través de una comparación de medias t-Student con una p = 0.05. Mientras que, dentro de cada grupo, se realizó un análisis de varianza y una comparación de medias empleando la diferencia mínima significativa (DMS, p ≤ 0.05) para determinar cuáles de las cepas de cada población (tratamiento: intragrupo) son estadísticamente mayores productoras de enzimas. Estos análisis se efectuaron con los software Statgraphics y Prism 3.0 para Windows (GraphPad® Software, San Diego, California, EUA).
Interacciones fúngicas y antagonismo
Se eligieron las tres cepas con mayor actividad de la lacasa de cada población y se realizaron interacciones fúngicas con tres cepas de Trichoderma spp. (T85, T98 y T99). Las cepas fueron obtenidas de la colección de hongos entomopatógenos y antagonistas de la Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad de Colima. Las tres cepas de Trichoderma spp. fueron aisladas de suelo de cultivo de melón (Cucumis melo L.) y fueron reactivadas en cajas de Petri con ADP. Se realizaron nueve interacciones en total con seis repeticiones cada una. Las interacciones se realizaron en medio Sivakumar, en el lado izquierdo de la caja de Petri se depositó un disco de micelio agar (6 mm de Ɵ) de la cepa de Ganoderma spp. y se dejó crecer por cuatro días. Por el lado contrario de la caja de Petri, se depositaron 5 µL de una solución de conidiosporas de Trichoderma spp. (1×107 conidiosporas/mL) en agua con Tween® al 0.05 %. Para realizar la solución de conidiosporas, se raspó la superficie de una colonia de Trichoderma spp. en caja de Petri con ADP agregando 10 mL de ADE con Tween 80 al 0.05 %, el producto se filtró a través de una gasa en un tubo cónico estéril (50 mL) para separar las conidiosporas del micelio y ADP. La concentración de conidiosporas se contabilizó en una cámara de Neubauer en microscópico invertido a 40X, la concentración requerida se ajustó con la fórmula C1V1 = C2V2. Las confrontaciones se incubaron por siete días en condiciones de laboratorio como se describió anteriormente.
Se determinó la capacidad de antagonismo de cada cepa utilizando la escala propuesta por Badalyan et al. (2004). Se establecieron tres tipos principales de interacciones (A, B, C) y cuatro subtipos (CA1, CB1, CA2 y CB2), estos corresponden a: A = bloqueo al contacto en donde existe una inhibición mutua, en la que ninguna especie es capaz de crecer sobre la otra; B = bloqueo a distancia sin contacto micelial, en la que ambas especies se mantienen alejadas; C = reemplazo o sobrecrecimiento sin bloqueo inicial, en la que una especie es capaz de desplazar a otra por crecimiento micelial; CA1 = reemplazo parcial después del bloqueo al contacto, luego de una inhibición mutua, una especie es capaz de reemplazar a la otra; CA2 = reemplazo completo después del bloqueo al contacto, en la que una especie reemplaza completamente a otra después de un bloqueo al contacto; CB1 = reemplazo parcial después del bloqueo a distancia, en la que una especie es capaz de reemplazar a la otra luego de un bloqueo a distancia; CB2 = reemplazo completo después del bloqueo a distancia, en la que una especie es capaz de reemplazar completamente a otra después de un claro bloqueo a distancia.
De acuerdo con Badalyan et al. (2002), cada uno de los tipos y de los subtipos de interacción tiene un valor asignado de: A = 1, B = 2, C = 3, CA1 = 3.5, CB1 = 4, CA2 = 4.5, CB2 = 5. Con ello se calculó el índice de antagonismo (IA) para cada cepa utilizando la ecuación: IA = A (n × 2) + B (n × 2) + C (n × 3) + CA1 (n × 3.5) + CB1 (n × 4) + CA2 (n × 4.5) + CB2 (n × 5). Donde n = número (frecuencia) de cada tipo o subtipo de interacción.
Cuantificación de la actividad de EL en las interacciones.
Se cuantificó la actividad de la lacasa, MnP y LiP en cada una de las interacciones (tratamientos), como se describió anteriormente. Para la preparación del extracto enzimático, se tomaron los discos de micelio agar en el margen de la interacción de los micelios de ambas cepas.
Análisis de datos
Los datos de las actividades enzimáticas se analizaron mediante una comparación t-Student (p = 0.05) entre la interacción Ganoderma spp. - Trichoderma spp. y el monocultivo de Ganoderma spp. Los análisis se realizaron con el software Statgraphics y Prism 3.0 para Windows (GraphPad® Software, San Diego, California, EUA).
RESULTADOS
Actividad enzimática y TCD de cepas ruderales de Ganoderma spp.
La actividad de la lacasa osciló entre 0.07 y 6.64 U/L en la población ruderal. Las cepas 4R y 5R de Ganoderma spp. registraron la actividad más alta (F = 13.83, p = 0.00001) con 6.64 y 6.39 U/L, respectivamente (Cuadro I). Por el contrario, las cepas 1R (0.49 U/L), 3R (0.07 U/L), 7R (0.98 U/L) y 8R (0.31 U/L) presentaron los valores más bajos de actividad de la lacasa. Para la MnP, únicamente tres cepas mostraron actividad. Ésta fluctuó entre 0.34 y 1.15 U/L. Con la cepa 1R (1.15 U/L) se obtuvo la mayor actividad de la MnP (F = 3.58 y p = 0.0534) en comparación con la cepa 4R (0.34 U/L). La actividad de la LiP osciló de 6.93 hasta 9.95 U/L. Las actividades más altas se observaron en las cepas 5R, 7R, 8R y 9R (F = 5.81 y p = 0.0003) con valores de 9.08, 8.93, 9.43 y 9.95 U/L, respectivamente. Estos valores resultaron significativamente diferentes a los de las cepas con actividad más baja: 1R, 3R y 4R con 7.15, 7.09 y 6.93 U/L, respectivamente (Cuadro I). Para la TCD, las cepas 1R y 5R (F = 61.83 y p = 0.00001) mostraron el mayor valor con 0.91 y 0.92 cm/día, respectivamente (Cuadro I), mientras que el resto de las cepas evaluadas oscilaron entre 0.47 y 0.42 cm/día.
CUADRO I ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS LIGNINOLÍTICAS Y TASA DE CRECIMIENTO DIARIO (TCD) DE CEPAS DE Ganoderma spp. AISLADAS DE UN AMBIENTE RUDERAL.
| Cepas (R) | Lacasa (U/L) | MnP (U/L) | LiP (U/L) | TCD (cm/día) |
| 1R | 0.49±0.16 c | 1.15±0.32 a | 7.15±0.33 c | 0.91±0.009 a |
| 3R | 0.07±0.00 c | 0.67±0.15 ab | 7.09±0.17 c | 0.62±0.032 c |
| 4R | 6.64±1.24 a | 0.34±0.09 b | 6.93±0.07 c | 0.72±0.032 b |
| 5R | 6.39±0.84 a | - | 9.08±1.16 ab | 0.92±0.007 a |
| 7R | 0.98±0.25 c | - | 8.93±1.41 ab | 0.47±0.027 d |
| 8R | 0.31±0.08 c | - | 9.43±0.66 ab | 0.48±0.032 d |
| 9R | 3.90±1.40 b | - | 9.95±1.26 a | 0.52±0.011 d |
| F* | 13.83 | 3.58 | 2.02 | 61.83 |
| p* | 0.00001 | 0.0534 | 0.0896 | 0.00001 |
Medias (± error estándar) con diferente letra en una columna son significativamente diferentes entre sí (DMS, p ≤ 0.05, n = 6), MnP = manganeso peroxidasa, LiP = lignina peroxidasa, F* = prueba de Fisher y p* = probabilidad.
Actividad enzimática y TCD de cepas urbanas de Ganoderma spp.
La actividad de la lacasa osciló entre 0.03 y 4.16 U/L en la población urbana de Ganoderma spp. La cepa 18C registró la actividad más alta (F = 155.26 y p = 0.0000) con 4.16 U/L (Cuadro II). Por el contrario, las cepas 9C y 10C presentaron las actividades más bajas con 0.03 y 0.06 U/L, respectivamente. Para la MnP, sólo seis de las siete cepas mostraron actividad, la cual fluctuó de 0.81 a 13.99 U/L. Las cepas 2C (13.6 U/L) y 7C (13.9 U/L) mostraron la mayor actividad enzimática (F=691.32 y p = 0.0000) en comparación con el resto de las cepas aisladas, cuyos valores oscilaron de 0.81 y 5.43 U/L (Cuadro II). Para la LiP, únicamente cinco de las siete cepas urbanas presentaron actividad, la cual fue de 0.36 hasta 2.29 U/L. La más alta se observó en la cepa 8C (2.29 U/L, F = 35.33 y p = 0.0000), mientras que las más bajas se encontraron en las cepas 7C (0.36 U/L) y 10C (0.56 U/L, Cuadro II). Para la TCD, el valor más alto se registró para la cepa 10C (F = 15.80 y p = 0.0000) con 2.46 cm/día (Cuadro II); por el contrario, las cepas con menor TCD fueron la 2C y la 8C con 1.59 y 1.68 cm/día, respectivamente. Por lo que la cepa 10C creció 1.5 veces más rápido que las cepas 2C y 8C.
CUADRO II ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS LIGNINOLÍTICAS Y TASA DE CRECIMIENTO DIARIO (TCD) DE CEPAS DE Ganoderma spp. AISLADAS DE UN AMBIENTE URBANO.
| Cepa (C) | Lacasa (U/L) | MnP (U/L) | LiP (U/L) | TCD (cm/día) |
| 1C | 0.71±0.104 c | 5.43±0.141 b | 1.15±0.193 c | 2.09±0.009 b |
| 2C | 0.78±0.165 c | 13.66±0.282 a | - | 1.59±0.070 c |
| 7C | 1.12±0.228 c | 13.99±0.117 a | 0.36±0.119 d | 1.96±0.114 b |
| 8C | 3.214±0.297 b | 1.54±0.169 d | 2.29±0.120 a | 1.68±0.057 c |
| 9C | 0.03±0.007 d | 0.81±0.153 e | - | 2.17±0.104 b |
| 10C | 0.06±0.006 d | 2.24±0.390 c | 0.56±0.097 d | 2.46±0.058 a |
| 18C | 4.16±0.070 a | - | 1.70±0.122 b | 2.07±0.048 b |
| F* | 96.77 | 691.32 | 35.33 | 15.80 |
| p* | 0.00001 | 0.00001 | 0.00001 | 0.00001 |
Medias (± error estándar) con diferente letra en una columna son significativamente diferentes entre sí (DMS, p ≤ 0.05, n = 6), MnP = manganeso peroxidasa, LiP = lignina peroxidasa, F* = prueba de Fisher y p* = probabilidad.
Comparación inter grupos
La actividad de la lacasa entre las dos poblaciones de Ganoderma (ruderal = 2.69 U/L y urbana = 1.43 U/L) no presentó diferencia estadística significativa (t-Student = 1.0018, p = 0.1712, Cuadro III). Por el contrario, la actividad de la MnP (t-Student = - 2.2036, p = 0.0393) y la LiP (t-Student = 11.96, p = 1.50E-07) en las cepas de la población ruderal fue mayor en comparación con las cepas aisladas en el ambiente urbano; para la MnP y la LiP la actividad enzimática en las cepas ruderales fue de 8.22 y 8.36 U/L, respectivamente. Por otra parte, las cepas aisladas de la urbanidad exhibieron valores más bajos con 6.28 y 1.21 U/L para la MnP y la LiP, respectivamente. La TCD (t-Student = - 10.03, p = 7.69E-07) de la población aislada de la ciudad (2.0 cm/día) fue estadísticamente mayor a la aislada del ambiente ruderal (0.66 cm/día).
CUADRO III ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS (U/L) Y TASA DE CRECIMIENTO DIARIO (TCD) EN cm/día DE AISLAMIENTOS DE Ganoderma spp. DE DOS AMBIENTES DIFERENTES.
| Variable | Ruderal | Ciudad | t-Student | p-valor |
| Lacasa | 2.69 | 1.43 | 1.0018 | 0.1712ns |
| MnP | 8.22 | 6.28 | -2.2036 | 0.0393* |
| LiP | 8.36 | 1.21 | 11.96 | 1.50E-07*** |
| TCD | 0.66 | 2.0 | -10.03 | 7.69E-07*** |
MnP = manganeso peroxidasa, LiP = lignina peroxidasa, TCD = tasa de crecimiento diario, ns = no significativo, * = significativo, *** = altamente significativo (DMS, p ≤ 0.05, n = 6) y U/L = unidades internacionales por litro.
Interacciones fúngicas entre las cepas ruderales de Ganoderma spp. y Trichoderma spp.
La figura 1 y el cuadro IV muestran los resultados de las interacciones fúngicas entre las cepas ruderales de Ganoderma spp. y Trichoderma spp. La cepa 4R mostró el mayor IA con 10.5, mientras que las cepas 5R y 9R obtuvieron valores 3.0 y 5.5, respectivamente. La interacción más común entre estos dos géneros fue la inhibición o bloqueo al contacto, mientras que la segunda interacción más común fue el reemplazo parcial después de una inhibición al contacto. Por lo tanto, Trichoderma puede detener y reemplazar a Ganoderma bajo las condiciones de estudio. Por ejemplo, Ganoderma sp. 4R es reemplazado parcialmente por Trichoderma sp. T98 (Fig. 1).
Fig. 1 Tipos de interacciones entre tres cepas de Ganoderma spp. aisladas de un ambiente ruderal, con diferentes cepas Trichoderma spp.: I) reemplazo parcial después de una inhibición al contacto entre Ganoderma sp. 4R y Trichoderma sp. 85, II) reemplazo parcial luego de una inhibición al contacto entre Ganoderma sp. 4R y Trichoderma sp. 98, III) reemplazo parcial después de una inhibición al contacto entre Ganoderma sp. 4R y Trichoderma sp. 99, IV) bloqueo al contacto entre Ganoderma sp. 5R y Trichoderma sp. 85, V) bloqueo al contacto entre Ganoderma sp. 5R y Trichoderma sp. 98, VI) bloqueo al contacto entre Ganoderma sp. 5R y Trichoderma sp. 99, VII) bloqueo al contacto entre Ganoderma sp. 9R y Trichoderma sp. 85, VII) bloqueo al contacto entre Ganoderma sp. 9R y Trichoderma sp. 98 y IX) reemplazo parcial luego de una inhibición al contacto entre Ganoderma sp. 9R y Trichoderma sp. 99.
CUADRO IV ÍNDICE DE ANTAGONISMO ENTRE CEPAS RUDERALES DE Ganoderma SPP. Y CEPAS DE Trichoderma spp.
| Ganoderma spp. | Trichoderma spp. | IA | ||
| 85 | 98 | 99 | ||
| 4R | CA1 | CA1 | CA1 | 10.5 |
| 5R | A | A | A | 3 |
| 9R | A | A | CA1 | 5.5 |
IA = índice de antagonismo, A = inhibición al contacto, CA1 = reemplazamiento parcial después de una inhibición al contacto.
Interacciones fúngicas entre las cepas urbanas de Ganoderma spp. y Trichoderma spp.
La figura 2 y el cuadro V muestran los resultados de las interacciones fúngicas entre las cepas urbanas de Ganoderma spp. y Trichoderma spp. La cepa 7C obtuvo el mayor IA con 8.0, mientras que las cepas 8C y 18C tuvieron, ambas, valores 5.5. La interacción más común entre estos dos géneros fue la inhibición o bloqueo al contacto, mientras que la segunda interacción más común fue el reemplazo parcial después de una inhibición al contacto. Por lo tanto, Trichoderma sp. puede detener y reemplazar a Ganoderma spp. bajo las condiciones de estudio (Fig. 2).
Fig. 2 Tipos de interacciones entre tres cepas de Ganoderma spp. aisladas de un ambiente urbano con cepas Trichoderma spp.: I) reemplazo parcial después de una inhibición al contacto entre Ganoderma sp.7C y Trichoderma sp. 85, II) bloqueo al contacto entre Ganoderma sp. 7C y Trichoderma sp. 98 III) reemplazo parcial luego de una inhibición al contacto entre Ganoderma sp. 7C y Trichoderma sp. 99, IV) bloqueo al contacto entre Ganoderma sp. 8C y Trichoderma sp. 85, V) bloqueo al contacto entre Ganoderma sp. 8C y Trichoderma sp. 98, VI) reemplazo parcial después de una inhibición al contacto entre Ganoderma sp. 8C y Trichoderma sp. 99, VII) bloqueo al contacto entre Ganoderma sp. 18C y Trichoderma sp. 85, VIII) reemplazo parcial luego de una inhibición al contacto entre Ganoderma sp. 18C y Trichoderma sp. 98 y IX) bloqueo al contacto entre Ganoderma sp. 18C y Trichoderma sp. 99.
CUADRO V ÍNDICE DE ANTAGONISMO ENTRE CEPAS URBANAS DE Ganoderma spp. Y CEPAS DE Trichoderma spp.
| Ganoderma spp. | Trichoderma spp. | IA | ||
| 85 | 98 | 99 | ||
| 7C | CA1 | A | CA1 | 8.0 |
| 8C | A | A | CA1 | 5.5 |
| 18C | A | CA1 | A | 5.5 |
IA= índice de antagonismo, A=inhibición al contacto, CA1=reemplazamiento parcial después de una inhibición al contacto.
Actividad enzimática ligninolítica de las cepas ruderales de Ganoderma spp. en interacción con Trichoderma spp.
Las tres cepas ruderales de Ganoderma spp. dispuestas en interacción con tres cepas de Trichoderma spp., no incrementaron la actividad de la lacasa (Cuadro VI). Por otra parte, las cepas 4R y 9R de Ganoderma spp. cuando crecen en monocultivo no presentaron actividad de MnP. Sin embargo, cuando se disponen en interacción con Trichoderma spp., las cepas de Ganoderma spp. tienen actividad de MnP. Las actividad de la MnP en la cepa 4R dispuesta en interacción con las cepas de Trichoderma spp. 85, 98 y 99, fue de 7.21, 25.81 y 3.95 U/L, respectivamente. Mientras que en la cepa 9R en interacción con Trichoderma spp., la actividades de la MnP fue de 3.48, 11.48 y 4.54 U/L, respectivamente. Mientras que para la cepa 5R de Ganoderma spp., las tres cepas de Trichoderma spp. fueron capaces de incrementar la actividad de la MnP, los aumentos oscilaron de 1.54 a 30.01 veces más. Particularmente, la cepa Trichoderma sp. T98 provocó un incremento mayor en la actividad de la MnP en las tres cepas de Ganoderma spp. evaluadas.
CUADRO VI ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS LIGNINOLÍTICAS EN INTERACCIONES ENTRE CEPAS RUDERALES DE Ganoderma spp. Y Trichoderma spp.
| Interacciones | Lacasa (U/L) | Incremento | MnP (U/L) | Incremento | LiP (U/L) | Incremento |
| Gan. 4R | 6.64±1.239 a | - | NP | - | 6.93±0.076 c | - |
| Gan. 4R - Tri. 85 | 2.21±0.260 b | NI | 7.21±3.103 b | 7.21 | 8.11±0.691 b | 0.17 |
| Gan. 4R - Tri. 98 | 1.91±0.236 b | NI | 25.81±0.221 a | 25.81 | 10.51±0.051 a | 0.51 |
| Gan. 4R - Tri. 99 | 1.52±0.220 b | NI | 3.95±0.610 bc | 3.95 | 7.92±0.352 bc | 0.14 |
| F* | 6.41 | - | 52.01 | - | 24.90 | - |
| P* | 0.0007* | - | 0.00001* | - | 0.0009* | - |
| Gan. 5R | 6.39±0.824 a | - | 0.64±0.309 b | - | 9.08±1.168 b | - |
| Gan. 5R - Tri. 85 | 1.93±0.0333 b | NI | 1.63±0.388 b | 1.54 | 7.78±0.044 c | NI |
| Gan. 5R - Tri. 98 | 2.34±0.076 b | NI | 19.85±1.294 a | 30.01 | 10.33±0.198 a | 0.13 |
| Gan. 5R - Tri. 99 | 2.63±0.388 b | NI | 2.45±0.578 b | 2.82 | 6.90±0.090 c | NI |
| F* | 10.18 | - | 192.13 | - | 1.87 | - |
| P * | 0.0010* | - | 0.00001* | - | 0.00001* | - |
| Gan. 9R | 3.90±1.409 a | - | NP | - | 9.54±0.418 a | - |
| Gan. 9R - Tri. 85 | 2.40±0.284 a | NI | 3.48±1.110 b | 3.48 | 7.51±0.114 bc | NI |
| Gan. 9R - Tri. 98 | 2.31±0.111 a | NI | 11.48±2.047 a | 11.48 | 8.35±0.489 b | NI |
| Gan. 9R - Tri.99 | 1.41±0.619 a | NI | 4.54±1.590 b | 4.54 | 7.15±0.225 c | NI |
| F* | 0.84 | 11.66 | 9.33 | |||
| p* | 0.1938 | 0.0027* | 0.0055* |
Medias (± error estándar) con diferente letra en una columna son significativamente diferentes (DMS, p ≤ 0.05, n = 6), MnP = manganeso peroxidasa, LiP = lignina peroxidasa, F* = prueba de Fisher, p* = probabilidad, * = valor significativo, NP = no presentó, NI = no incrementó, Gan = Ganoderma spp. y Tri = Trichoderma spp. U/L = unidades internacionales por litro.
Respecto a la LiP, Ganoderma sp. 4R incrementó ligeramente su actividad enzimática cuando se dispuso en interacción con las tres cepas de Trichoderma spp., los incrementos fueron de 0.17, 0.51 y 0.14 veces más, en las cepas T85, T98 y T99 de Trichoderma, respectivamente. Para Ganoderma sp. 5R, únicamente la cepa T98 de Trichoderma sp. logró incrementar la actividad de la LiP en 0.13 veces más. Finalmente, la cepa 9R no aumentó la actividad de la LiP por efecto de sus interacciones con Trichoderma spp.
Actividad enzimática ligninolítica de cepas urbanas de Ganoderma spp. en interacción con Trichoderma spp.
La actividad de la lacasa de las tres cepas urbanas de Ganoderma sp. en interacción con tres cepas de Trichoderma sp. se incrementó ligeramente (Cuadro VII). La cepa 7C de Ganoderma sp. incrementó la actividad de la lacasa entre 1.14 (Trichoderma T99) y 1.83 (Trichoderma T85) veces más en las interacciones fúngicas. Mientras que las cepas 8C y 18C de Ganoderma spp. tuvieron incrementos más bajos por efecto de las interacciones con Trichoderma spp., que oscilaron entre 0.08-0.17 y 0.36-0.49 veces más, respectivamente. La actividad de la MnP de la cepa 7C de Ganoderma sp., únicamente se incrementó (0.24 veces más) cuando se dispuso en interacción con Trichoderma sp. 99; mientras que, para la cepa 8C de Ganoderma sp., la actividad se incrementó 2.53 y 1.44 veces más por efecto de las interacciones con Trichoderma spp. T85 y T99, respectivamente. Por otra parte, la cepa 18C de Ganoderma sp. no presentó actividad de MnP cuando creció en monocultivo, sin embargo, las cepas de Trichoderma sp. indujeron la actividad de esta enzima en un rango de 0.89 (Trichoderma sp. 85) a 1.06 (Trichoderma sp. 98) veces más.
CUADRO VII ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS LIGNINOLÍTICAS EN INTERACCIONES ENTRE CEPAS URBANAS DE Ganoderma spp. Y Trichoderma spp.
| Interacciones | Lacasa (U/L) | Incremento | MnP (U/L) | Incremento | LiP (U/L) | Incremento |
| Gan. 7C | 1.12±0.228 b | - | 13.99±0.177 b | - | 0.36±0.119 c | - |
| Gan. 7C - Tri. 85 | 2.85±0.488 a | 1.54 | 1.30±0.182 d | NI | 22.91±0.758 a | 62.68 |
| Gan. 7C - Tri. 98 | 3.17±0.218 a | 1.83 | 7.70±2.111 c | NI | 0.80±0.203 bc | 1.22 |
| Gan. 7C - Tri. 99 | 2.40±0.467 a | 1.14 | 17.39±0.980 a | 0.24 | 1.97±0.903 b | 4.47 |
| F* | 8.86 | - | 54.26 | - | 475.57 | - |
| P* | 0.0028* | - | 0.00001* | - | 0.00001* | - |
| Gan. 8C | 3.14±0.297 a | - | 1.54±0.169 c | - | 2.29±0.120 a | - |
| Gan. 8C - Tri. 85 | 3.42±0.744 a | 0.08 | 5.44±0.316 a | 2.53 | 1.43±0.154 b | NI |
| Gan. 8C - Tri. 98 | 3.44±0.229 a | 0.09 | 0.89±0.517 c | NI | 2.32±0.201 a | 0.01 |
| Gan. 8C - Tri. 99 | 3.69±0.857 a | 0.17 | 3.77±0.776 b | 1.44 | 0.86±0.404 b | NI |
| F* | 0.22 | - | 24.01 | - | 10.77 | - |
| P* | 0.8804 | - | 0.00001* | - | 0.0013* | - |
| Gan. 18C | 4.16±0.070 b | - | NP | - | 1.70±0.122 a | - |
| Gan. 18C - Tri. 85 | 5.67±0.500 a | 0.36 | 0.89±0.508 ab | 0.89 | 0.56±0.117 b | NI |
| Gan. 18C - Tri. 98 | 6.21±0.283 a | 0.49 | 1.06±0.093 a | 1.06 | 1.79±0.0109 a | 0.05 |
| Gan. 18C - Tri.99 | 5.86±0.453 a | 0.40 | 1.06±0.093 a | 1.06 | 0.65±0.151 b | NI |
| F* | 12.61 | - | 6.29 | - | 22.78 | - |
| p* | 0.0007* | - | 0.0097* | - | 0.0001* | - |
Medias (± error estándar) con diferente letra en una columna son significativamente diferentes (DMS, p ≤ 0.05, n = 6), MnP = Manganeso peroxidasa, LiP = lignina peroxidasa, F* = prueba de Fisher, p* = probabilidad, * = valor significativo, NP = no presentó, NI = no incrementó, Gan = Ganoderma spp. y Tri = Trichoderma spp. U/L = unidades internacionales por litro.
La actividad la LiP de Ganoderma sp. 7C se incrementó en las tres interacciones con Trichoderma sp., los valores fueron de 62.68, 1.22 y 4.47 veces más en las cepas T85, T98 y T99, respectivamente. Mientras que en las cepas 8C y 18C de Ganoderma sp, se encontró un ligero incremento por efecto de la interacción con Trichoderma sp. 98, el cual fue de 0.01 y 0.05 veces más, respectivamente.
DISCUSIÓN
En el presente estudio se puso a prueba la hipótesis de que la población urbana de aislados de Ganoderma spp., posee mayor actividad enzimática ligninolítica en comparación con la población ruderal, esta hipótesis se rechaza, ya que la población ruderal presentó mayor actividad de MnP y LiP, e igual actividad de lacasa. Una de las razones que podrían favorecer la habilidad para producir en mayor cantidad enzimas ligninolíticas en la población ruderal, es su exposición a estresores ambientales como los agroquímicos, los cuales se encuentran ampliamente distribuidos en los ambientes ruderales (Chaves-Bedoya et al. 2013). Uno de los principales estresores en hongos de la pudrición blanca (basidiomicetos) son los herbicidas, los cuales son persistentes en el suelo (Maciel et al. 2013). Al respecto, Maganhotto et al. (2004) reportaron que el herbicida propanil inhibió el crecimiento de la biomasa de Ganoderma spp., así como las actividades enzimáticas LiP y lacasa, pero al mismo tiempo incrementó la actividad de la MnP a los 13 días de cultivo.
Otras investigaciones demuestran que los herbicidas pueden incrementar satisfactoriamente la producción de enzimas ligninolíticas de los hongos de la pudrición blanca. Al respecto, Maciel et al. (2013) observaron el aumento en la actividad de la lacasa de Trametes sp. luego de estar siete días en contacto con el herbicida picloram. En otros estudios, da Silva et al. (2010a), da Silva et al. (2010b) y da Silva et al. (2018), indicaron que Ganoderma spp. incrementa su actividad enzimática ligninolítica cuando está en contacto con los herbicidas bentazón y diuron. La biomasa de G. lucidum se redujo considerablemente cuando se incrementó la concentración de diuron (0-100 mM) y bentazón (0-25 mM) en el medio de cultivo. El estrés por bentazón en el hongo incrementó fuertemente la actividad de la lacasa (> 7 veces más) y no tuvo efecto sobre la de la MnP de G. lucidum. Mientras que el diuron incrementó fuertemente la actividad lacasa y MnP (> 7 veces, da Silva et al. 2010a).
En otro estudio, Chan-Cupul et al. (2014) evaluaron el efecto estresor de la atrazina (herbicida) en especies de hongos de la pudrición blanca, a diferencia de Cymatoderma elegans y Pleurotus sp. cepa 1, los especímenes Pleurotus sp. cepa 2, Daedalea elegans y Pycnoporus sanguineus inhibieron fuertemente su TCD cuando se cultivaron con 468 ppm de atrazina. Asimismo, se encontraron incrementos en la actividad de la lacasa por arriba de 1.5 veces en P. sanguineus. Los especímenes estudiados poseen alta actividad enzimática en cultivos axénicos, p. e. Trametes maxima (> 25 U/mg proteína), D. elegans (> 25 U/mg de proteína) y P. sanguineus (> 50 U/mg proteína), estas especies fueron aisladas de zonas ruderales con presencia de perturbación antrópica-agropecuaria.
Por otra parte, el género Ganoderma spp. tiene características ecológicas versátiles al poseer un hábito saprobio y fitopatógeno; algunas especies son de interés para su control biológico con hongos antagonistas como especies del género Trichoderma (Naher et al. 2012b, Sundram 2013a, Sundram 2013b). Sin embargo, en la bibliografía científica hay pocas investigaciones sobre el efecto de esas interacciones en la actividad enzimática ligninolítica de los géneros en cuestión, por lo tanto, el presente estudio representa una contribución al tema.
En cuanto a las interacciones de estos dos géneros, Badalyan et al. (2004) indicaron que Ganoderma spp. posee habilidad para enfrentar a Trichoderma spp. como micoparásito. En interacciones duales los autores observaron una inhibición al contacto, un reemplazo completo después del bloqueo al contacto y un reemplazo parcial después del bloqueo al contacto cuando Ganoderma sp. interactuó con Trichoderma harzianum, Trichoderma pseudokoningii y Trichoderma viride, respectivamente, en todos los casos Ganoderma sp. fue quien reemplazó a Trichoderma spp. En todas ellas Ganoderma sp. fue capaz de frenar y crecer sobre las especies de Trichoderma. En otro estudio, Badalyan et al. (2002) evaluaron interacciones fúngicas entre G. lucidum y cuatro hongos fitopatógenos: Gaeumannomyces graminis var. Tritici, Bipolaris sorokiniana, Fusarium culmorum y Rhizoctonia cerealis, los tipos de interacción observados fueron reemplazo completo después de un bloqueo al contacto (CA2), reemplazo completo luego de un bloqueo al contacto (CA2), reemplazo completo después de un bloqueo al contacto (CA2) y reemplazo parcial luego de un bloqueo al contacto (CA1), respectivamente. De nuevo, G. lucidum fue capaz de frenar y reemplazar a los hongos fitopatógenos filamentosos. Este resultado es similar a zlo observado en las interacciones realizadas en este estudio, es decir, Ganoderma es un género de hongos versátiles y dominantes (difíciles de reemplazar). Los resultados de las interacciones evaluadas refuerzan el rechazo de la hipótesis planteada, ya que Ganoderma no fue reemplazado por Trichoderma, en su caso, sólo se observaron reemplazos parciales.
En un estudio previo, Chan-Cupul et al. (2018) reportaron que la inhibición al contacto es la principal interacción entre P. sanguineus y T. maxima y ocho hongos microscópicos de suelo. Destacando que Trichoderma sp. fue capaz de reemplazar parcialmente después de una inhibición al contacto a P. sanguineus (CA1). Mientras que T. maxima fue reemplazado completamente después de un bloqueo a distancia por Trichoderma sp. (CB2). Estos resultados son contrarios a los de la presente investigación porque Ganoderma spp. no pudo ser reemplazado completamente por Trichoderma spp. Posiblemente existan muchos factores bioquímicos que juegan un rol en la interacción entre estos dos géneros, tales como metabolitos secundarios, esteroles, enzimas ligninolíticas, enzimas quitinolíticas y peróxido de hidrógeno (Moreno et al. 2011, Naher et al. 2012a, Baby et al. 2015). Al mismo tiempo, no hay que dejar de tras los factores ecológicos implicados en este tipo de interacciones, ya que, tanto Ganoderma spp. como Trichoderma spp. son hongos saprobios que están implicados en la degradación de materia orgánica, entre ellos los componentes de la lignina como la celulosa y la hemicelulosa (Boddy y Hiscox 2016).
CONCLUSIONES
Las poblaciones ruderal y urbana de Ganoderma spp. Presentan la misma actividad de la lacasa, pero con diferentes actividades de LiP y MnP, la población ruderal posee mayor actividad de MnP y LiP. Sin embargo, la población urbana posee mayor TCD que la ruderal en 2.03 veces más. El 55.5 por ciento de las interacciones entre Ganoderma spp. y Trichoderma spp. fueron el bloqueo al contacto micelial. Sólo en una interacción el micoparásito Trichoderma spp. claramente fue capaz de reemplazar parcialmente a Ganoderma spp. bajo las condiciones de estudio. Las cepas ruderales no intensificaron la actividad de la lacasa en las interacciones con Trichoderma spp., sin embargo, las enzimas MnP y LiP se elevaron de 1.54 a 30.01 y de 0.13 a 0.51 veces, respectivamente, por efecto de la interacción. Las cepas aisladas del ambiente urbano incrementaron de 0.17 a 1.83 veces la actividad de la lacasa cuando interactuaron con Trichoderma spp. La actividad de MnP y LiP de las interacciones entre Ganoderma spp. y Trichoderma spp. aumentó 2.53 y 62.68 veces, respectivamente.
