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INTRODUCCIÓN
La mastitis es una de las enfermedades infecciosas que más afecta a las vacas lecheras y que causa grandes pérdidas económicas en la industria de los lácteos. Las bacterias son las principales causales de mastitis, siendo Escherichia coli y Staphylococcus aureus dos de los patógenos más comunes. El desarrollo del proceso inflamatorio y la respuesta inmune en la ubre varía significativamente entre estos dos patógenos (Petzl et al., 2008; Whelehan, Meade, Eckersall, Young & O’Farrelly, 2011); mientras que E. coli causa mastitis aguda con severas consecuencias clínicas; S. aureus provoca predominantemente mastitis subclínica, lo que resulta una infección crónica que puede persistir durante toda la vida del animal (Whelehan et al., 2011).
Con el fin de prevenir y tratar esta enfermedad, es importante entender la función inmune de la glándula mamaria. La inmunidad innata es un mecanismo no específico que antecede a la inmunidad a largo plazo, siendo los péptidos antimicrobianos (PAM) uno de sus principales componentes (Ganz, 2003; Swanson et al., 2004).
Los PAM son una familia de aproximadamente 900 moléculas que forman parte del sistema inmune innato más primitivo en los vertebrados, insectos y plantas (Tomasinsig et al., 2010). Las defensinas son componentes importantes de estos mecanismos de defensa en células epiteliales, y constituyen una familia de pequeños péptidos catiónicos (3 kDa-6 kDa). Se clasifican en defensinas α, β y θ, aunque en bovinos solo se han descrito las tipo β, y en la actualidad se conocen aproximadamente 18 secuencias completas. Dentro de la familia de las β-defensinas, en los bovinos se incluyen al péptido antimicrobiano lingual (LAP, por sus siglas en inglés) (Isobe et al., 2011; Schonwetter, Stolzenberg & Zasloff, 1995), la β-defensina entérica (EBD, por sus siglas en inglés) (Tarver et al., 1998), la β-defensina de neutrófilo bovino (BNBD, por sus siglas en inglés) (Goldammer et al., 2004; Selsted et al., 1993), el péptido antimicrobiano traqueal (TAP, por sus siglas en inglés) (Diamond et al., 1991) y otras β-defensinas bovinas (Cormican et al., 2008). Además, se ha demostrado la expresión constitutiva de las β-defensinas LAP, TAP y psoriasina (PS100A7) en la glándula mamaria bovina sana a fin de determinar su posible participación en la prevención de la mastitis (Tetens et al., 2010). La expresión de TAP ha sido reportada en la leche y en las glándulas mamarias de vacas sanas e infectadas (Cormican et al., 2008; Roosen et al., 2004). Aunque se desconoce el tipo de célula que la produce, se ha demostrado la expresión de LAP y TAP en células epiteliales mamarias bovinas mediante hibridación in situ (Goldammer et al., 2004; Swanson et al., 2004). Asimismo, mediante inmunohistoquímica se ha determinado la expresión de LAP en tejido mamario sano (Isobe, Hosoba & Yoshimura, 2009a) y en tejido mamario inoculado con E. coli y S. aureus (Petzl et al., 2008). Isobe, Morimoto, Nakamura, Yamasaki & Yoshimura (2009b) encontraron que LAP era secretado en leche bovina.
Otro importante agente antimicrobiano presente en bovinos es la proteína de unión a calcio S100A7, también conocida como Psoriasina (Tetens et al., 2010). A la fecha se conoce poco acerca de su función fisiológica en bovinos, y particularmente en la glándula mamaria. En humanos se ha observado que protege la piel de infecciones contra E. coli, aunque también se expresa en piel sana. En bovinos se ha demostrado que es altamente activa en contra de diferentes cepas de E. coli (Regenhard et al., 2009), y su expresión es inducible por citocinas proinflamatorias y bacterias (Gläser et al., 2005), sin embargo, su función fisiológica exacta aún no está bien descrita (Regenhard et al., 2009). Regenhard, Petz, Zerbe & Sauerwein (2010) reportaron por primera vez que la proteína bovina psoriasina se expresa en glándula mamaria, y pudiera ser una proteína de defensa del huésped y parte de la inmunidad innata. De hecho, S100A7 se ha detectado en muestras de leche después de 24 h de la infección con E. coli, sólo en los cuartos inoculados, mientras que Lutzow et al. (2008) encontraron niveles aumentados de otra proteína de unión a calcio, similar a psoriasina en leche de vacas inoculadas con S. aureus.
La importancia de las β-defensinas y psoriasina en la defensa local contra la mastitis radica en la expresión constitutiva e inducible de los péptidos antimicrobianos en la glándula mamaria bovina y su actividad antibacteriana frente a patógenos. Sin embargo, deben mostrar un notable nivel de expresión constitutivo en los sitios de invasión bacteriana y ser altamente inducibles una vez que se desarrolla la infección.
Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue determinar el nivel de expresión de las β-defensinas LAP y TAP, así como de psoriasina (S100A7), en diferentes regiones de la glándula mamaria bovina con mastitis crónica causada por S. aureus.
MATERIALES Y MÉTODOS
Recolección de muestras de tejido mamario
Se utilizaron dos vacas Holstein Friesian de condición corporal 3/5, de segundo parto, las cuales fueron diagnosticadas con mastitis crónica en la totalidad de los cuartos. La mastitis fue confirmada mediante la prueba de california (3+++) y el conteo de células somáticas (6 000 000 células) (Calvinho, 1998). La presencia de S. aureus se realizó mediante el análisis bacteriológico de muestras de leche, y confirmado con pruebas bioquímicas comerciales siguiendo las instrucciones del fabricante (API Staph, bioMérieux, USA). Las vacas fueron sacrificadas y se tomaron dos muestras de aproximadamente 1 cm3 de cada uno de los tejidos de la glándula mamaria de las siguientes regiones: cisterna, parénquima, Rosetta de Füerstenberg, esfínter y linfonódulo inguinal, en cada uno de los cuartos. Los tejidos fueron colocados en solución de RNAlater (Ambion, Austin, Texas) y mantenidos a -20 °C hasta la extracción de ácido ribonucleico (RNA, por sus siglas en inglés).
Extracción de RNA y obtención de cDNA
Para la extracción de RNA, 30 mg de cada uno de los tejidos fueron congelados con nitrógeno líquido a -80 ºC y pulverizados con un mortero. El RNA fue extraído usando el kit RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany), siguiendo el protocolo del fabricante. El RNA se cuantificó por espectrofotometría (260/280) y su calidad comprobada por electroforesis en agarosa al 1%.
El cDNA se obtuvo mediante transcripción inversa utilizando 250 ng de RNA y 200 U de Superscript III reverse transcriptasa (Invitrogen, Carlsbad, California), siguiendo las instrucciones del fabricante. Esto se repitió para cada una de las muestras. Para la expresión génica de cada uno de los péptidos se utilizaron los cebadores R y F específicos previamente descrito por Tetens et al. (2010).
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) en tiempo real cuantitativo (qPCR)
Para el qPCR se utilizó el equipo CFX96 real time PCR (Bio- rad) y el kit Platinum SYBR Green qPCR Super Mix UDG (Invitrogen), acatando las instrucciones del fabricante. Se obtuvo un volumen final de 20 µL que contiene 25 µmol/L de dNTPs y 0.5 µM de cebador oligo-dT. Las condiciones del ciclo fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 95 ºC por 3 min, y los próximos 40 ciclos fueron realizados de la siguiente manera: desnaturalización (95 ºC por 15 s), hibridación (58 ºC por 30 s), elongación (72 ºC por 30 s).
Se construyó una curva estándar con las diluciones del producto de PCR de punto final obtenido para cada uno de los genes, utilizando diluciones de 1 x 1010 hasta 1 x 102, así como los controles negativos (agua + cebador; cebador + dNTPs). Las cantidades del mRNA específico de cada gen y cada región anatómica fueron determinadas de acuerdo con la curva estándar. El mRNA de GAPDH, por ser expresado constitutivamente, fue usado como control interno invariante (Infante, Aguilar, Gicquel & Pando, 2005).
Los resultados de qPCR fueron reportados como la razón de la cantidad de ARN mensajero (mRNA, por sus siglas en inglés) de cada uno de los péptidos específicos sobre 1 × 106 copias del gen Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH, por sus siglas en inglés).
RESULTADOS
Rendimiento de qPCR
El límite de detección para el qPCR fue de 100 copias de mRNA, de acuerdo con la última dilución de la curva estándar (1 × 102). En general, el análisis de las curvas de fusión para cada gen no mostró signos de productos inespecíficos de qPCR, indicando que los pares de cebadores fueron específicos. En la figura 1 se muestra la curva de fusión para el péptido LAP como ejemplo. Dado que el gen constitutivo (GADPH) en su valor de Ct estuvo por debajo de los ≤ 0.5 ciclos en sus medidas repetidas, se puede decir que dicho gen fue estable.
Fuente: Imagen extraída de software CFX manager software (Bio-rad Laboratories, Inc.).
Figura 1 Curva de fusión del péptido antimicrobiano LAP. Nótese que los controles negativos (indicado en la imagen con una flecha) no amplificaron lo que indica, que los pares de cebadores fueron específicos, además, tanto las muestras como los controles positivos mostraron la misma temperatura de fusión.
Expresión de los péptidos antimicrobianos en la glándula mamaria con mastitis
Los niveles de expresión de mRNA de los péptidos antimicrobianos LAP, TAP y S100A7 se muestran en la figura 2. Las β-defensinas LAP y TAP muestran un mayor número de copias de mRNA en tejido de la cisterna (LAP: 1.36 × 107 y TAP 9.05 × 108, respectivamente), seguido por el parénquima (LAP 9.75 × 106 y TAP 4.3 × 106, respectivamente). También, el nivel de expresión de LAP en tejido de la Roseta de Fürstenberg (aproximadamente 4.72 × 106) fue similar al nivel de expresión de TAP en el parénquima (aproximadamente 4.3 × 106). Por el contrario, los niveles de expresión de LAP en esfínter y linfonódulo inguinal fueron los más bajos, respectivamente (aproximadamente 2 × 105 y 9.52 × 105, de modo respectivo). En cuanto a TAP, los niveles de expresión fueron similares tanto en la Roseta de Fürstenberg como en el esfínter (aproximadamente 2.31 × 106 y 2.12 × 106, de modo respectivo) y menor a la expresión en cisterna y parénquima. En el linfonódulo inguinal la expresión de TAP fue casi nula (aproximadamente 2.12 × 106).
Fuente: Elaboración propia.
Figura 2 Se muestran los niveles de expresión de mRNA de los péptidos LAP a) TAP b) y S100A7 c) en cinco diferentes regiones anatómicas de la glándula mamaria bovina. El número de copias de mRNA está normalizado contra la expresión de GADPH bovino. Las barras representan la desviación estándar.
El patrón de expresión de mRNA para S100A7 fue muy alto en el esfínter y Roseta de Fürstenberg, con aproximadamente 2.04 × 109 y 2.85 × 108 copias de mRNA, respectivamente. En cisterna el nivel de expresión fue menor (aproximadamente 1.42 × 108) con respecto al mismo sitio para LAP y TAP. En el linfonódulo inguinal fue menor (aproximadamente 5.59 × 107) respecto a los sitios anteriores. El más bajo nivel de expresión se encontró en el parénquima con aproximadamente 1.62 × 104 copias de mRNA.
DISCUSIÓN
En este estudio se muestra por primera vez el nivel de expresión de las β-defensinas bovinas LAP y TAP, y la proteína S100A7 en diferentes localizaciones de la glándula mamaria con mastitis crónica causada por S. aureus.
La expresión más abundante de los péptidos LAP y TAP se restringió en particular a la cisterna y parénquima, con niveles muy bajos en Roseta de Fürstenberg, esfínter y en linfonódulo inguinal. Solo LAP fue un poco mayor en cuanto a TAP en linfonódulo inguinal. Este hallazgo pudiera sugerir que LAP es inducible en el sitio de infección, como lo demuestran Swanson et al. (2004), quienes reportaron abundante expresión de LAP mRNA en epitelio de la cisterna, epitelio alveolar y regiones periféricas de tejido infectado con Corynebacterium species, Staphylococcus aureus, Streptococcus uberis, mientras que no se detectó expresión de este péptido en tejido no infectado, por lo que sugirieron que la expresión de LAP era inducida en el sitio de infección, ya que estos tejidos eran los primeros expuestos a microorganismos invasores. De la misma manera, datos obtenidos por Singh, More & Kumar (2004), mediante análisis de hibridación in situ, reportaron una expresión predominante de LAP en los cuartos con mastitis en tejido de la cisterna mamaria, lo cual concuerdan con lo encontrado en este trabajo. Asimismo, Ptzel et al. (2008) encontraron que la expresión de LAP en la glándula mamaria es inducida significativamente entre las 72 h - 84 h seguidas de la inoculación con S. aureus. Roosen et al. (2004) afirman que LAP también es expresado constitutivamente en tejido mamario sano y con mastitis. Por ello, LAP es considerado un péptido tanto constitutivo como inducible en epitelio secretor de la teta, indicando su papel en la defensa inmunológica de la glándula mamaria, ya que el LAP representa un mecanismo no-oxidativo microbicida para contener a los microbios patógenos (Das et al., 2010).
Con respecto al péptido TAP, que al igual que LAP tuvo un mayor nivel de expresión en cisterna y parénquima, estos resultados concuerdan con los de Whelehan et al. (2011), quienes demostraron la expresión de TAP en la región alveolar, ducto, cisterna y canal del pezón de la glándula mamaria bovina infectada con S. aureus. Además, Roosen et al. (2004) han reportado la expresión constitutiva del péptido TAP en tejido de ubres sanas de vacas en lactación, pero no en los tejidos infectados, mientras que Cormican et al. (2008) confirmaron la expresión de TAP tanto en epitelio mamario como en tejido mamario. De igual modo, estudios reportan que el péptido antimicrobiano TAP se expresa de manera constitutiva, pero también de manera inducible, y que los niveles de expresión en los tejidos mamarios aumentan en respuesta a la inflamación, tal sería el caso de tejidos con mastitis (Diamond, Jones & Bevins, 1993; Roosen et al., 2004), esto debido a que el péptido TAP ha mostrado una alta actividad antimicrobiana frente a S. aureus, principalmente en la fase aguda de la mastitis (Eckersall et al., 2006). Kościuczuk et al. (2014) reportan que en el parénquima no hay expresión de este péptido, contrario a los resultados aquí mostrados, donde se detecta la expresión del péptido TAP en parénquima. Esto pudiera deberse a que el límite de detección del qPCR fue mucho menor, y con ello se pudo detectar una menor cantidad de este péptido.
Por otra parte, el patrón de expresión para LAP y TAP encontrado en este estudio difiere de lo localizado en vacas sanas, donde se ha reportado que las defensinas LAP y TAP se expresan mayormente en la región del linfonódulo inguinal (Tetens et al., 2010) y no en las regiones distales de la glándula mamaria, lo que podría sugerir que son los sitios donde son inducibles ante la infección.
Entre los mecanismos para disparar la expresión de los péptidos LAP y TAP se incluyen los lipopolisacáridos y algunas citosinas, que además de inducir a los receptores de manosa inducen la expresión de los receptores TLR1, TLR2, TLR3 y TLR4. Ello provoca el incremento subsecuente del mRNA de estos péptidos, motivo por el cual las concentraciones sobrepasan las basales cuando están presente los factores predisponentes (Zhao, Wang & Lehrer, 1996). Pero este aumento en la expresión de los péptidos se observa su pico máximo a las 16 h posestimulación, por lo que en un tiempo menor se puede obtener medidas basales de dichos péptidos (Mitchell, Al-Haddawi, Clark, Beveridge & Caswell, 2007).
En cuanto al péptido S100A7, este mostró un patrón y nivel de expresión opuesto a LAP y TAP, prevaleciendo su expresión en esfínter, Roseta Fürstenberg, cisterna y nódulo inguinal, en orden de mayor a menor número de copias de mRNA; mientras que en el parénquima el nivel de expresión fue muy escaso.
El esfínter fue el tejido donde hubo la mayor expresión de S100A7, lo que concuerda con lo publicado por Regenhard et al. (2010), quienes reportan una abundante expresión de este péptido en esta región. Asimismo, concuerda con su expresión constitutiva en vacas sanas (Tetens et al., 2010), lo cual pudiera sugerir que también es inducible. De acuerdo con el patrón de infección galactogénico, el epitelio del pezón es el primer tejido expuesto a microorganismos patógenos y, por tanto, la primera línea de defensa, de ahí su mayor expresión tanto en vacas sanas como en vacas con mastitis.
Además, este estudio mostró la expresión de S10A7 en tejidos de la cisterna de vacas con mastitis crónica por S. aureus, datos que concuerdan con los reportado por Regenhard et al. (2010), quienes detectaron la expresión de psoriasina en el epitelio de la cisterna después de 24 h de la infección con E. coli, y no en vacas sanas, lo que sugiere que su expresión podría ser inducida también por S. aureus. Sin embargo, en este estudio no se observó la expresión de S100A7 en el parénquima de vacas infectadas con S. aureus, datos que coinciden con lo observado por Regenhard et al. (2010), que no detectaron la expresión de psoriasina después de 24 h de la infección con E. coli, ni tampoco en vacas sanas. El canal del pezón forma una barrera que protege a la cisterna y al parénquima del contacto con el medio ambiente, por lo que no se detectó la expresión de psoriasina en cisterna y parénquima de vacas sanas, pero sí en vacas infectadas con E. coli y S. aureus. La expresión de psoriasin en la glándula mamaria es parte de los mecanismos de defensa innatos que actúan de manera local, con actividad antimicrobiana contra patógenos como E. coli y S. aureus (Regenhard et al., 2010).
En estudios en la lengua humana se ha observado que la expresión de psoriasina es mucho mayor en la parte anterior de la lengua comparada con la parte posterior, debido a que esta zona es la que tiene el primer contacto con microbios y es más vulnerable a traumas en la superficie, por lo que requiere protección adicional, con alta expresión de proteínas antimicrobianas (Meyer et al., 2008), situación muy similar a lo que sucede en el pezón, el cual está más expuesto a traumas y colonización bacteriana, mientras que el tejido del parénquima se encuentra en una ubicación más distal.
CONCLUSIÓN
El presente estudio muestra por primera vez el patrón y nivel de expresión de los péptidos antimicrobianos LAP, TAP y S100A7 en diferentes regiones de la glándula mamaria con mastitis clínica crónica por S. aureus. La mayor expresión de LAP y TAP se limitó a las regiones de la cisterna y el parénquima, lo cual podría sugerir que su expresión se ve aumentada una vez que el patógeno se establece en esta región de la glándula mamaria, lo que podría sugerir un papel quimiotáctico y, por tanto, la inflamación crónica de la glándula mamaria sin eliminación del patógeno S. aureus. Mientras que S100A7 mostró una mayor expresión en los tejidos que están en contacto constante e inmediato con el patógeno como el esfínter y Roseta de Fürstenberg, sugiriendo que este péptido pudiera tener un papel fundamental en la disminución en el número de colonias en la glándula mamaria por S. aureus en las etapas iniciales de la infección.
