Lugar de trabajo

El estudio se llevó a cabo en la Unidad de Producción de Ovinos y el Laboratorio de Nutrición Animal de la Facultad de Zootecnia, Universidad Autónoma de Chihuahua, situada sobre el Periférico Francisco R. Almada km 1, a una altitud de 1435 msnm, temperatura media anual de 18.2 ºC, precipitación media anual de 387.5 mm3. Localización geográfica 28º 38’ latitud Norte y 106º 04’ longitud Oeste (^{Álvarez, 1990}).

Preparación de manzarina

La manzana de desecho molida fue adicionada con 1.5% de urea, 0.20% de sulfato de amonio y 0.5% de un suplemento vitamínico y mineral. Una vez mezclada se sometió a fermentación en piso de concreto bajo condiciones aeróbicas y de temperatura ambiente en un invernadero, con volteado cada 2 h durante 1 día para oxigenarlas y estimular la respiración de los microorganismos aerobios. Posteriormente, cuando las muestras se fermentaron durante el proceso de FES (fermentación en estado sólido) y perdieron la humedad suficiente para su almacenamiento, fueron molidas en un molino Wiley MR con malla de 1 mm para el posterior análisis químico en laboratorio.

Muestras analizadas

Las dietas se formularon para ser isoproteicas e isoenergéticas con base en la composición química de los ingredientes reportada en la literatura. El rastrojo de maíz se utilizó en conjunto con la fuente proteica manzarina, comparada con la harinolina. Se manejó como tratamientos 4 dietas formuladas cuyo aporte de proteína correspondió principalmente a la manzarina: harinolina aportando un 0:100% (dieta 1), 33:66% (dieta 2), 66:33% (dieta 3) y 100:00% (dieta 4) de los requerimientos de PC (9.6%) y el resto (100%, 66%, 33% y 0%) proveniente de harinolina. En la Tabla 1 se muestra la composición de la dieta. Los animales tuvieron libre acceso al consumo de agua.

Animales

Se usaron cuatro ovinos machos de 60 (± 2.5) kg en promedio como donadores de inóculo los cuales fueron equipados con una cánula ruminal permanente y alojados en corraletas individuales. La dieta que consumieron los animales fue a base de manzarina como ingrediente proteico y harinolina en las mismas proporciones evaluadas in vitro, además de minerales para cubrir los requerimientos nutricionales de mantenimiento (^{National Research Council [NRC], 2007}). La alimentación se realizó a las 8:00 a.m. y 4:00 p.m. Se realizaron tres incubaciones en frascos por cada tratamiento e inóculo respectivamente.

Análisis químico

Se realizó el análisis químico a las dietas tal cual se ofrecieron a los animales. La materia seca y proteína cruda fueron determinadas de acuerdo al procedimiento descrito por ^{A. O. A. C. (2005)}. Las determinaciones de fibra detergente neutro (FDN) y fibra detergente ácido (FDA) se realizaron por el método de ^{Goering y Van Soest (1970)}.

Degradabilidad por producción de gas in vitro

El procedimiento de Producción de Gas (PG) in vitro se realizó de acuerdo a la técnica de ^{Menke y Steingass (1988)} con algunas modificaciones para incubaciones en frascos. Este método es utilizado para determinar la cantidad de gas producido mediante la incubación de alimentos para rumiantes en un periodo de incubación de 96 h. La cantidad de gas liberado está estrechamente relacionado con la degradabilidad del alimento. La preparación de la muestra involucró el molido usando un tamiz de 1 mm (^{Menke et al., 1979}) y secado a 105 ºC por 8 h. El fluido ruminal se colectó 15 min antes de iniciar la prueba. La toma del fluido ruminal colectado de los ovinos fue realizada inmediatamente antes de la alimentación, considerando que los microorganismos son menos activos pero más consistentes en su composición y actividad (^{Blummel & Orskov, 1993}). El medio ruminal in vitro estuvo formado por amortiguadores de bicarbonato y fosfato, un agente reductor, una fuente de nitrógeno, varios minerales y resazurina. Se utilizó CO₂ durante la preparación del medio para asegurar un ambiente anaerobio al tiempo de la inoculación. Las soluciones A, B, C y resazurina se agregaron dentro de un matraz con agua destilada, el cual se introdujo en un incubador rotatorio (Incubador Shaker I2400) a 39 ºC, posteriormente se le agregó la solución reductora y se burbujeó CO₂ a toda la mezcla hasta que el color se tornó de azul a rosa y finalmente claro (transparente). El fluido ruminal previamente colectado fue filtrado a través de muselina y mezclado junto con la saliva artificial, la relación final saliva artificial: fluido ruminal fue de 2:1.

La cantidad de muestra empleada y registrada dentro de los 12 frascos (tres frascos por tratamiento) fue de 200 mg de muestra, a cada frasco se le agregaron 30 ml de la solución saliva artificial y fluido (en una relación 2:1, respectivamente). A partir de ese momento se registró el volumen inicial y se introdujeron al incubador con agitación continua donde permanecieron durante 96 h. Las lecturas de producción de gas se hicieron a las 3 h, 6 h, 9 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h y 96 h mediante punción de los frascos en incubación registrando la presión con la ayuda de un transductor de la marca FESTO^®. Los perfiles de producción de gas se ajustaron con el modelo logístico para una etapa o fase de ^{Groot, Cone, Williams, Debersaques y Lantinga (1996)}, el cual es:

G = A/(1 + (B/t)C)

donde: G, producción de gas (ml/200 mg MS) al tiempo de incubación t; A es la asíntota o producción de gas (ml / 200 mg MS) cuando t →∞; B, tiempo (h) de incubación al cual se alcanza la mitad de la producción de gas asintótica; C, constante que determina la forma de la curva y, por lo tanto, la posición del punto de inflexión, dado por: t_I = B((C - 1)/(C + 1))1/C; y finalmente t, que es el tiempo de incubación en horas.

Diseño experimental y análisis de varianza

Se utilizó un diseño en cuadro latino 4 × 4, correspondiendo a las cuatro dietas probadas (niveles de manzarina en las dietas-tratamientos), a los cuatro ovinos usados (columnas) y los cuatro periodos (hileras) que se utilizaron en la prueba. En cada periodo se realizaron tres incubaciones en frascos por animal donador y dieta. Cada periodo constó de 13 días de adaptación a la respectiva dieta y 1 día para la Colecta del líquido ruminal. Las variables medidas fueron aquellas de la composición química de las dietas y la producción de gas a los distintos tiempos de incubación, en tanto que las variables de respuesta estimadas fueron los parámetros A, B y C del modelo de ^{Groot et al. (1996)}.

Las variables de respuesta se analizaron con el siguiente modelo lineal mixto:

Yijk = µ + αi + βj + Pk + εijk,

donde: Y_ijk es la variable de respuesta; µ es la media general, común a todas las observaciones; α_i es el efecto fijo de la i-ésima dieta (i = 1, 2, 3, 4); β_j es el efecto aleatorio del j-ésimo borrego (j = 1, 2, 3, 4); P_k es el efecto fijo del k-ésimo periodo (k = 1, 2, 3, 4); y ε_ijk es la variación residual o error experimental, supuesto N, I, μ = 0, σ = 1, también común a todas las observaciones.

Los datos se analizaron usando el PROC MIXED de SAS versión 9.0 (^{SAS, 2011}) que se ajusta un modelo con el efecto fijo de tratamiento y el animal del efecto aleatorio. Los errores se ajustaron a una varianza y covarianza de simétrica compuesta (CS), para el caso de la variable tiempo, y de la auto regresión de primer grado [AR (1)] para el caso del periodo variable, esto dentro de cada subpoblación definida por el periodo de muestreo. Cuando el efecto de tratamiento resultó significativo, se realizó un análisis de tendencia mediante contrastes polinomiales.

Composición química de las dietas

En lo concerniente a la cantidad de FDA se observaron diferencias (p < 0.05) en las cuatro dietas coincidiendo con el aumento gradual de la manzarina en las dietas, pero también el contenido de forraje (rastrojo de maíz), el cual constituyó aproximadamente el 20%. Aun así, el análisis de estos nutrientes se realizó a las dietas completas, forraje y concentrado mezclados. El contenido de FDA fue de 13%, 15.17%, 16.7% y 20.1% para las dietas con 0, 33, 66 y 100 % de manzarina, respectivamente, siendo diferentes entre ellas (p < 0.05). Análisis previos del valor nutritivo de la manzarina muestran que esta contiene cantidades de FDA de 53.4% y FDN de 64.5% (^{Becerra Bernal et al., 2008}), por lo que la inclusión de la manzarina impacta también en las concentraciones de fibra en las dietas. Las concentraciones de FDN presentaron un comportamiento similar al de las de FDA, incrementando de manera gradual conforme aumentó la concentración de manzarina en las dietas (p < 0.05). Los valores de FDN fueron de 27.6 % para la dieta 1 que presentó las cantidades más bajas, 29.7 % para la dieta 2, 31.4% la dieta 3 y la dieta 4 con las concentraciones más altas de 35.0 % (p < 0.05). Aunque las dietas fueron balanceadas de forma isoproteica e isoenergética en ocasiones los ingredientes con los que se preparan no siempre contienen las cantidades precisas de nutrientes que reporta la literatura por cuestiones varias. El contenido de PC para la dieta 1 fue de 8.36%, para la dieta 2% de 9.71% la cual como se podrá ver fue la que presentó la concentración superior, la dieta 3 con 8.44% y 8.22% para la dieta 4 con el porcentaje inferior (p < 0.05). Existen otros beneficios para incluir la manzarina en la alimentación de animales además de poder utilizarla como substituto de algún ingrediente proteico como la mejor de la actividad antioxidante en el plasma y la salud del epitelio ruminal en ovinos (^{Rodríguez-Muela et al., 2015}), y en cerdos se ha encontrado que el uso de pulpa de manzana beneficia la microflora intestinal y favorece la retención del nitrógeno (^{Cho et al., 2012}).

Degradabilidad in vitro por producción de gas

Los volúmenes de producción de gas obtenidos por la incubación in vitro durante 96 h de las cuatro dietas no mostraron diferencias a ninguna hora de evaluación (p > 0.05), estos se muestran en la Tabla 2. Sin embargo, no se tiene conocimiento de la digestibilidad de este ingrediente y sus efectos sobre la degradabilidad de los demás ingredientes. Se requiere de investigación sobre la digestibilidad de este ingrediente solo y mezclado con otros para evaluar su impacto sobre la cinética de fermentación ruminal y así poder incorporarlo en las dietas de una manera precisa y estratégica a favor de la óptima producción del animal, pues como se ha mencionado los ingredientes tienen efectos asociativos favorables o desfavorables dependiendo de los componentes que acompañan la ración completa (^{Liu, Susenbeth, & Sudekum, 2002}).

Aunque no se encontró diferencia significativa durante la mayoría del tiempo de incubación la dieta 2 (p > 0.05) fue la que presentó los volúmenes de gas superiores entre las dietas con manzarina acentuando estas diferencias sobre todo a la hora 96 de incubación. Lo anterior puede deberse a que existen asociaciones entre ingredientes que conforman una dieta sobre todo durante las primeras horas de incubación, dicha asociación puede mantener, afectar o favorecer la degradabilidad in vitro entre dietas con diferentes concentraciones de ingredientes (^{Getachew, Makkar, & Becker, 1998}).

Se sabe que la fermentación se debe al conjunto de ingredientes presentes en la dieta y que en la mayoría de las veces los comportamientos entre dietas con cantidades de nutrientes similares, pero con diferentes ingredientes pueden cambiar los patrones de fermentación in vitro, esto se debe en gran parte a una asociación positiva de los ingredientes o balance positivo (^{Liu et al., 2002}). La degradación de los alimentos comienza con los nutrientes más fácilmente digeribles como es el caso de los carbohidratos solubles y proteínas digestibles en rumen, esta fermentación ocurre durante las primeras horas, principalmente cuando son dietas completas o concentrados los que se incuban, pues en estos casos los nutrientes son disueltos en el medio y no necesitan ser colonizados por los microorganismos (^{Groot et al., 1996}). Así, pues, la producción de gas dependerá de la composición química de los alimentos o dietas evaluadas (^{Garcianera & Villalba 2002}).

Parámetros de la cinética de fermentación in vitro

En la Tabla 3 se muestran los parámetros de cinética de fermentación y las asíntotas de cada fase obtenidas por el modelo monofásico. El parámetro A para las cuatro dietas no mostró diferencias (p > 0.05). Los valores obtenidos fueron de 39.24 ml de gas por cada 200 mg de MS para la dieta 1, 55.91 ml de gas para la dieta 2, 38.01 en la dieta 3 y en la dieta 4 se observaron 39.35 ml de gas, aunque numéricamente se observaron valores heterogéneos estos no fueron diferentes (p > 0.05), debido al EE. El parámetro B no mostró diferencias y los valores fueron 7.43, 13.97, 10.03 y 12.90 ml de gas para las dietas 1, 2, 3 y 4 (p > 0.05), dicho parámetro es el tiempo medio de formación de gas después de la incubación. El parámetro C tampoco mostró diferencias significativas (p > 0.05), los valores obtenidos fueron 1.18 ml de gas para la dieta 1, 1.29 para la dieta 2, 1.44 para la dieta 3 y 1.29 para la dieta 4. En referencia a los contrastes polinomiales para las tendencias lineal, cuadrática y cúbica, los efectos para tratamiento en el parámetro A fue significativo (p < 0.05) solo para la tendencia lineal. Para el parámetro B, el efecto de tratamiento fue significativo (p < 0.01) para la tendencia lineal. Dado que este parámetro tiende a aumentar significativamente con la adición de harinolina en la dieta, también se observó una menor eficiencia de la manzarina en comparación de la harinolina. El parámetro C registró una tendencia cúbica significativa (p < 0.05). El modelo que logre el mejor ajuste a los perfiles de producción de gas observados permite realizar la interpretación de los datos con una ecuación adecuada, y por consiguiente plasmar una comparación más correcta de los substratos estudiados y obtener estimadores con el menor sesgo de las tasas de fermentación de los constituyentes solubles y estructurales (^{Groot et al., 1996}; ^{Williams, 2000}).

Son muchos los modelos disponibles para la parametrización de los perfiles de degradación ruminal, todos ellos con ventajas y desventajas de ajustes estadísticos, pero también dependientes de las condiciones experimentales y por supuesto del tipo de substrato. En el presente trabajo se evaluaron varios modelos como fue el logístico propuesto por ^{Schofield, Pitt y Pell (1994)}, el de Gompertz propuesto por ^{Lavrenccic, Stefanon y Susmel (1997)}, pero el modelo que logro mejor ajuste con los perfiles de gas observados en esta investigación fue el monofásico de ^{Groot et al. (1996)}.

Aún y con la selección de un modelo con aceptable ajuste, los parámetros de fermentación de los substratos evaluados no mostraron diferencias (p > 0.05). Aunque los porcentajes de fibras y proteína contenidos en los substratos fueron significativos esto no se vio reflejado en la cinética de fermentación de los tratamientos pues como se ha mencionado un punto importante también es el incremento de la frecuencia de las lecturas de la producción de gas lo que ofrece perfiles más detallados (^{Williams, 2000}). En el caso del presente trabajo las lecturas de los volúmenes de producción de gas se realizaron únicamente a la hora 3, 6, 12, 24, 48, 72 y 96, con una marcada disminución en la frecuencia sobre todo en las primeras 24 h de incubación las cuales son de suma importancia para determinar la cinética de degradación de los nutrientes más solubles en las dietas.