Introducción

La pirazinamida (PZA) es un importante antituberculoso, eficaz contra bacilos semilatentes que no son eliminados por ningún otro medicamento (^{Cuevas-Córdoba & Zenteno-Cuevas, 2010}). Esta característica la coloca como uno de los pilares en el tratamiento contra la tuberculosis, junto con la isoniazida y la rifampicina. Este medicamento ha permitido acortar el tiempo de duración de la terapia antituberculosa de nueve a seis meses, contra cepas sensibles y multidrogo resistentes (MDR-TB) (^{Aggarwal et al., 2018}; Centro Nacional de Programas Preventivos y Control de Enfermedades ^{[Cenaprece], 2016}). La PZA difiere de muchos de los medicamentos en su mecanismo de acción, debido a que es capaz de actuar en múltiples blancos, como la producción de energía, probablemente en la síntesis de pantotenato y coenzima A y en el proceso de trans-traducción (^{Zhang, Shi, Zhang & Mitchison, 2014}). Lo anterior forma parte de un proceso vital en condiciones de estrés para la bacteria que reutiliza ribosomas estancados durante la traducción y marca proteínas incompletas para su degradación (^{Personne & Parish, 2014}).

La resistencia a PZA se da por mutaciones en los genes RpsA, involucrado en el proceso de trans-traducción, y el gen panD que participa en la síntesis de β-alanina, precursor de la biosíntesis de pantotenato y coenzima A; sin embargo, las mutaciones más importantes se presentan en el gen pncA (Cuevas-Córdoba et al., 2013), que codifica a la enzima pirazinamidasa (PZase)/nicotinamidasa (^{Louw et al., 2006}), encargada de convertir a esta prodroga en su forma activa (^{Zhang et al., 2014}).

La PZA atraviesa la membrana celular del bacilo de la tuberculosis por difusión pasiva y en el interior la PZase lo transforma en ácido pirazinoico (POA) (^{Juréen, Werngren, Toro & Hoffner, 2008}). El ácido pirazinoico se bombea hacia el exterior de la bacteria y bajo condiciones ácidas (pH 5,5), el POA se protona a H + POA y vuelve a entrar en la bacteria, donde libera el H +, y el ácido pirazinoico se bombea de nuevo al exterior. Este proceso cíclico conllevará a un aumento en la acidez citoplasmática, lo que hará que enzimas vitales puedan ser inhibidas y contribuya a la muerte celular (^{Scheen et al., 2004}; ^{Zhang et al., 2014}).

Las mutaciones en el gen pncA pueden generar la perdida de la actividad en la enzima pirazinamidasa. La enzima pirazinamidasa está conformada por una cadena de 185 aminoácidos, la cual tiene seis hojas β paralelas con hélices α en ambos lados, que en conjunto forman un dominio α/β (^{Petrella et al., 2011}).

El sitio de unión al sustrato en el gen pncA de M. tuberculosis tiene una tríada catalítica constituida por los residuos Asp8 en la terminación de la cadena β-1, Lys96 en la terminación de la cadena β3 y Cys138 en el extremo N-terminal de α-hélice 3. Al frente de la cavidad donde se une el sustrato se encuentra el sitio de unión de iones metálicos, en donde se presenta el ion Fe²⁺. Los residuos importantes que mantienen al ion son Asp49, His51, His57 e His71, formando un sitio para la unión de PZA (^{Petrella et al., 2011}).

Lo antes mencionado demuestra que, para poder obtener una mayor comprensión del origen de la resistencia a los medicamentos, es necesario realizar un análisis de la estructura tridimensional de la enzima codificada por el gen mutado (^{Petrella et al., 2011}).

En este estudio se analizaron muestras que presentaban reporte de resistencia y algunas que carecían de ella, con la finalidad de obtener modelos tridimensionales de ambos tipos de muestras. La obtención de estos datos permitió obtener una comparación estructural de las proteínas nativas y la observación de los cambios que ocurren en la estructura a causa de mutaciones en el gen pncA. El principal objetivo de este trabajo fue detectar las mutaciones puntuales presentes en el gen pncA en aislamientos clínicos de M. tuberculosis con reporte de resistencia a PZA y mediante análisis in silico para poder visualizar y esquematizar los cambios que dan origen a la resistencia a nivel molecular.

Materiales y métodos

Resultados

Modelamiento Molecular de la Enzima PZA-pncA

Los alineamientos realizados en este trabajo mostraron un alto porcentaje de similitud con el modelo de M. tuberculosis presente en la base de datos y con código de acceso 3pl1.1.A (^{Petrella et al., 2011}). Esto nos permitió realizar los alineamientos estructurales para cada una de las muestras que presentaron mutaciones importantes. En la Figura 1 se observa una representación de la estructura tridimensional proteica de MtpncA para la muestra H37rv.

Fuente: Elaboración propia.

Figura 1 Representación de la estructura tridimensional proteica de MtPncA para la muestra H37rv. Se representan los residuos importantes para la catálisis (Asp 8, Lys 96 y Cys 138) y los residuos involucrados con la unión del cofactor enzimático (Asp 48, His 57 y His71); el ion de hierro se representa con una cruz roja. 

Una mutación interesante se presentó cercana a una de las regiones "calientes" (^{Tracevska, Jansone & Baumanis, 2004}) en el codón 10. Con base en el análisis de esta mutación, se pudo observar que se presentó un cambio en la estructura, debido a la sustitución de glutamina por prolina (^{Nelson & Cox., 2000}), dado que se ve afectado el aminoácido valina 9 y ácido aspártico 8, ubicados en el sitio activo de la enzima. Al observar el modelo de la estructura 3D se puede observar que existe una variación en la cadena con respecto a la H37Rv, principalmente en el aminoácido ácido aspártico 8, originada por el cambio de glutamina (Figura 2A).

A representación de la cadena de aminoácidos de metionina 1 hasta Glutamina 10, presente en la muestra 41.

B cambio de Prolina por Leucina en la muestra 654.

C ejemplificación de la mutación de ácido Aspártico por Alanina en la muestra F363.

D representación de la mutación Leucina por Serina J842.

E representación de la mutación Serina por Arginina en la muestra 35.

Fuente: Elaboración propia.

Figura 2 Superposición de las regiones mutadas en MtpncA H37rv en color verde y cada una de las mutaciones para cada una de las muestras en rojo. La ejemplificación de la proteína muestra el aminoácido de interés en una representación donde muestra sus cadenas laterales y las atracciones con líneas intermitentes amarillas. 

La mutación P62L está presente en un giro donde se encuentra un sitio importante para la unión del cofactor enzimático, el efecto de esta mutación comienza en la histidina 57, observándose un ligero desplazamiento en el enlace peptídico. En ácido aspártico 63, serina 65 y serina 66 se observó que no se presentaba ningún cambio estructural; sin embargo, en el aminoácido serina 67, triptófano 68 y prolina 70 se observó un evidente desplazamiento (Figura 2B).

En la muestra F363 se presentó una mutación correspondiente a ácido aspártico 63 por alanina, que se encuentra en un sitio importante como ya fue mencionado. Al observar el modelo tridimensional, el efecto se puede ver plasmado en los aminoácidos serina 65, serina 66 y serina 67. En serina 65 aparece un desplazamiento en la posición del oxígeno perteneciente al grupo carboxilo que está formando parte del enlace peptídico con serina 66. El efecto se puede observar en el OH perteneciente al grupo radical R, mientras que en serina 67 se observa una modificación en ambos sitios (Figura 2C).

La mutación en el codón 68, triptófano por serina, se encuentra en una posición importante y es altamente conservada (Aggarwal et al., 2017). En el análisis del modelo tridimensional se observa que solo se modifica serina 67.

En la mutación L151S se presentó un codón después de la terminación de una alfa hélice y dos codones antes del comienzo de una lámina beta (Aggarwal et al., 2017). En la observación del modelo tridimensional no se detectó un cambio aparente (Figura 2D).

Entre la alfa hélice 4 y la lámina beta 6 se presentó la mutación en el codón 179, que corresponde al cambio de serina por arginina (Aggarwal et al., 2017). Al analizar la mutación en el programa EduPyMOL, se observa que el efecto se da en valina un codón atrás de ella, permitiendo que se pegue una cadena (^{Berg, Tymoczko & Stryer, 2008}) (Figura 2E).

Discusión

La resistencia de M. tuberculosis a pirazinamida ha sido asociada con mayor frecuencia a mutaciones en el gen pncA; sin embargo, se ha documentado la existencia de mutaciones en los genes RpsA y panD. En este estudio se llevó a cabo el análisis de mutaciones en el gen pncA para aislamientos clínicos de M. tuberculosis, además de un detallado análisis in silico del modelado molecular de las mutaciones encontradas (Cuevas-Córdoba et al., 2013). De las 29 muestras analizadas, cuatro tenían el reporte de resistencia a pirazinamida (230, 441, 470, 572), pero solo en dos de ellas (470 y 230) fue posible encontrar mutaciones en la secuenciación del gen amplificado, lo que indica que probablemente en las muestras 441 y 572 la resistencia se esté llevando a cabo por mutaciones en los genes RpsA o panD (Cuevas-Córdoba et al., 2013). Las muestras 514, 41, 654, j842, F363 y 35 no presentaban reporte de resistencia a PZA, pero se encontraron mutaciones en el gen pncA.

En las secuencias analizadas para el gen pncA se encontró la presencia de diversas mutaciones presentes a lo largo del gen (Aggarwal et al., 2017); sin embargo, no habían sido interpretadas y modeladas como en el presente estudio. La mutación W68 analizada por Aggarwal y colaboradores en el 2017, se presenta en una región cercana al cofactor enzimático, causando efectos directos en la función de la enzima. Trabajos anteriores analizan la sustitución por arginina o glicina; en el presente estudio la sustitución fue por serina. El efecto que provoca esta mutación puede variar según el aminoácido involucrado, razón por la cual se optó por realizar su análisis (Aggarwal et al., 2017; ^{Petrella et al., 2011}).

Aggarwal et al. (2017) mencionaron que, además de ión Fe2 +, PZA también se une a la cavidad y se ha observado que hay cierto grado de agrupamiento en tres regiones de PZase (3 a 17, 61 a 85 y 132 a 142); las mutaciones presentes en estos residuos afectan de manera importante. En el presente estudio se presentaron cuatro mutaciones dentro de estas regiones.

La mutación Q10P se encuentra en un sitio cercano a aspargina 8, que está involucrado en la catálisis (^{Tracevska et al., 2004}). En el modelo de la estructura 3D se observó que existe una variación en la cadena con respecto a H37Rv. El aminoácido ácido aspártico 8 presentaba un puente de hidrógeno con glutamina 10, como se observa en el modelo realizado por ^{Petrella et al. (2011)}. Al presentarse la sustitución por prolina, provoca una pérdida de puentes de hidrógeno. El ácido aspártico 8 presentaba una atracción electrostática con valina 7 que también se ve afectada (^{Luscombe, Laskowski & Thornton, 2001}; ^{Pace, Scholtz & Grimsley, 2014}). La pérdida de estas interacciones influye directamente a ácido aspártico8, por lo que provocará un cambio en el sitio activo de la enzima (Figura 2A). Al realizar el análisis de CUPSAT (Tabla 3), se observa que la proteína no alcanza a estabilizarse, provocando un efecto desfavorable en la función enzimática.

La segunda mutación encontrada, P62L, se encuentra en un bucle que abarca desde los residuos His51 hasta His71; esta estructura cierra la cavidad unión al sustrato. Al realizar el modelado, se observó que el efecto de esta mutación provoca modificaciones río abajo de este codón, así como en el aminoácido histidina 57, fenil alanina 58 y en serina 59 se puede observar que se originó un puente de hidrógeno con glicina 60 (^{Luscombe et al., 2001}; ^{Pace et al., 2014}).

En los aminoácidos siguientes al P62L (Figura 2B) aparentan estar intactos, esto debido a que leucina y prolina tienen como características presentar cadenas laterales no polares sin carga, ambos son alifáticos (^{Berg et al., 2008}; ^{Nelson & Cox., 2000}). Esto favorece a que ácido aspártico 63 se mantenga, dado que este forma una atracción electrostática con serina 65 y serina 66, por lo que mantiene estables estos sitios. En el aminoácido serina 67 interactuaba formando un puente de hidrógeno con prolina 62 (^{Luscombe et al., 2001}; ^{Pace et al., 2014}); sin embargo, se ve fuertemente afectado por la mutación, originando la pérdida de este puente de hidrógeno que desestabiliza la estructura. El aminoácido triptófano 68 también presenta una pérdida de puente de hidrógeno unido con histidina 57 (Aggarwal et al., 2017; ^{Petrella et al., 2011}). Aggarwal et al. (2017) mencionan a triptófano 68 como un aminoácido importante, dado que delinea con his137 y phe13 los sitios de unión al cofactor enzimático. En este estudio se observó afectado, sin embargo, no genera un efecto grave como lo confirma el análisis en CUPSAT (Tabla 3), que menciona que la proteína se alcanza a estabilizar y la mutación no genera un efecto trascendente en la misma.

La tercera mutación analizada se presentó en el aminoácido ácido aspártico 63, que forma una atracción electrostática (puente salino) debido a que la cadena lateral de este aminoácido está completamente ionizada y contiene un grupo carboxilo cargado negativamente (-COO-) (^{Berg et al., 2008}; ^{Pace et al., 2014}) y, por tanto, provoca que se produzca esta atracción con los residuos triptófano 64, serina 65, serina 66 y serina 67. La cadena lateral del ácido aspártico 63 también se encuentra formando una interacción con la cadena lateral de serina 66. El aminoácido continuo serina 67 forma puentes de hidrógeno con el grupo amino de ácido aspártico 63 y triptófano 64. La cadena lateral de serina 67 forma un puente de hidrógeno con ácido aspártico 63 (^{Luscombe et al., 2001}; ^{Pace et al., 2014}). En la mutación del codón 63 por la alanina, el ácido aspártico pierde la cadena lateral, por lo que se pierden todas las interacciones antes mencionadas (Figura 2C). Con el análisis de CUPSAT (Tabla 3) se pudo confirmar que la proteína pierde su estabilidad debido a esta mutación. Al encontrarse en la cavidad que cierra la unión al sustrato, la mutación afecta de manera importante impidiendo la unión y de esta manera genera la resistencia (^{Berg et al., 2008}; ^{Nelson & Cox., 2000}).

La cuarta mutación fue en el aminoácido triptófano 68, donde presentó un cambio por serina, el cual provoca un ligero desplazamiento de su grupo carboxilo en el aminoácido serina 67; el cambio de triptófano por serina provoca que se establezca un puente de hidrógeno entre la cadena lateral de serina 68 con el grupo carboxilo de prolina 69 (^{Luscombe et al., 2001}; ^{Pace et al., 2014}). El análisis con CUPSAT confirma que la proteína pierde su estabilidad a causa de la mutación, datos que confirman lo reportado por ^{Yoon et al. (2014)} (Tabla 3).

La quinta mutación analizada fue en el codón 151, en donde se encuentra el aminoácido lisina formando puentes de hidrógeno con alanina 146 y dándole estabilidad a una hélice alfa. Este aminoácido forma otro puente de hidrógeno con treonina 150. Al ocurrir la mutación por serina, provoca que el OH de la cadena lateral de este aminoácido forme otro puente de hidrógeno con alanina 152 (^{Luscombe et al., 2001}; ^{Pace et al., 2014}), lo que podría provocar un cambio de posición en la lámina beta; sin embargo, en el modelo tridimensional no se observa este hecho (Figura 2D). El análisis de CUPSAT (Tabla 3) confirma que la proteína logra estabilizarse, por lo que el efecto de esta mutación no parece ser trascendente (^{Allana et al., 2017}).

La última mutación, S179R, en donde la serina se presenta al final de una hélice alfa y forma dos puentes de hidrógeno con arginina 175, el OH de la cadena lateral de serina 179 también formaba un puente de hidrógeno con alanina 178 (^{Pace et al., 2014}). Al ocurrir la mutación por arginina, se pierde este puente de hidrógeno, lo que podría provocar que se desestabilice este sitio; sin embargo, al estar situados casi al final de la proteína es probable que su efecto no sea tan trascendente (Figura 2E) (^{Allana et al., 2017}; ^{Louw et al., 2006}). Al realizar el análisis de CUPSAT se pudo observar que la proteína pierde su estabilidad a causa de esta mutación.

Además de la presencia de mutaciones por cambio de aminoácidos, también se presentó un codón de paro originado por la inserción de una ¨A¨ en el codón 48, generando el codón de terminación en la posición 56, lo cual provocaría una proteína incompleta; esta mutación no había sido reportada en la literatura con anterioridad. Las mutaciones que dan origen a un codón de un aminoácido a UGA producen la terminación prematura de la síntesis de la cadena polipeptídica. Sin embargo, si existe una segunda mutación que cambiara la base apropiada en el anticodón de un tRNA, la terminación es suprimida y puede generarse una proteína completa (^{Singer, 1993}). De igual manera sucede con las demás mutaciones analizadas en este estudio; pueden también ser revertidas por mutaciones supresoras que lean incorrectamente el codón mutado, lo que provocaría que no hubiese cambio en la estructura primaria de la proteína. La principal limitante en este estudio es la falta de un análisis enzimático en estas muestras, lo que reforzaría los resultados obtenidos con el modelaje molecular y tridimensional de la proteína mutada.

El análisis de correspondencia simple para determinar asociación entre la presencia de resistencia de TB-MDR y su relación con resistencia a pirazinamida mostró que no existe asociación en las muestras aquí analizadas. Estos datos difieren de lo reportado por ^{Alame-Emane et al. (2015)}, quienes, a pesar de tener un mayor número de muestras (272), no realizaron un análisis estadístico que soportara la asociación de resistencia.

Conclusión

Los sistemas de salud en nuestro país no realizan como rutina la prueba de resistencia a pirazinamida debido a que PZA es activo contra M. tuberculosis solo a un pH ácido (pH 5.5), lo que impide su fácil análisis. La detección de mutaciones presentes en el gen pncA que generan resistencia en este profármaco es de suma importancia, ya que es considerado como base estructural de la terapia antituberculosa.

Con la creciente aparición de cepas de M. tuberculosis resistentes a los fármacos para su control, se prevé un panorama alarmante. Los pacientes infectados tienen de un 50% a un 80% de éxito en el tratamiento y son una fuente de infección por periodos más largos que los pacientes que presentan cepas sensibles. La comprensión del efecto de la mutación genética en la estructura de la proteína es necesaria para ayudar al conocimiento del desarrollo de nuevos y mejores fármacos. El presente estudio se basó en el análisis de secuencias del gen completo pncA, a partir de las cuales se generaron modelos tridimensionales, con los cuales se pudieron realizar predicciones sobre el efecto que se da con el cambio de aminoácidos.

En conclusión, con base en el análisis realizado, las modificaciones en los aminoácidos Q10P, W68S y S179R podrían ser importantes para el correcto plegamiento y funcionamiento de la actividad enzimática y podrían estar relacionadas con la resistencia a pirazinamida, hecho que deberá ser confirmado con modelos experimentales. El análisis in silico es de suma importancia y nos permite conocer el impacto de las mutaciones sobre la secuencia de aminoácido y la actividad de la proteína que nos da un panorama de la probable resistencia que genera la mutación analizada.