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Introducción
Actualmente, se buscan fuentes alternativas de proteínas debido a que se ha demostrado que los aislados, hidrolizados, péptidos o fracciones, presentan características nutracéuticas importantes, por lo que han sido utilizados como agentes antioxidantes y antimicrobianos, así como para el tratamiento de enfermedades crónico degenerativas como el cáncer, la diabetes, la hipertensión, la dislipidemia y los trastornos metabólicos, entre otros (Esfandi et al., 2019; León-Espinosa et al., 2019; Mason et al., 2020; Shi et al., 2019; Teniente-Martínez et al., 2019; Zhu et al., 2018).
La materia prima de mayor utilización para la obtención de proteínas es la pasta desengrasada de semillas de importancia comercial como son la soya, la quinoa, los lupinos y la avellana, entre otros (Guerra & Pozo, 2018; Lozano et al., 2019; Sánchez-Reséndiz et al., 2019; Villarroel et al., 2012). Sin embargo, desde hace algunos años, se ha observado que las semillas de los frutos, que se consideran productos de deshecho, podrían representar una fuente importante de proteína y no son aprovechadas, tal es el caso de la semilla de guayaba, jitomate, mango y maracuya (Bernardino-Nicanor et al., 2007; Medina et al., 2011; Sarkar et al., 2016; Torres-León et al., 2016). Entre los frutos que se consumen de manera habitual en nuestro país se encuentra la anacahuita, la cual posee entre 2 a 3 semillas que representan más del 60% del volumen del total del fruto y podría representar una posible alternativa para la extracción de proteínas de importancia para la salud humana.
La anacahuita (Cordia boissieri A. DC) es un fruto común en las regiones del noroeste de México, es nativo de América del Norte; el árbol puede alcanzar hasta los 6 m de altura, sus hojas son de color verde de textura aterciopelad, flores blancas y frutos de color verde amarillento (Martínez-Adriano et al., 2016). Las hojas, las flores y los frutos de la anacahuita han mostrado tener propiedades nutracéuticas, entre ellas; efecto citotóxico (Viveros-Valdez et al., 2016), efecto sobre el síndrome metabólico (Owis et al., 2016; Owis et al., 2017), y contra enfermedades del sistema respiratorio (Domínguez, 2012; Salazar-Aranda et al., 2011). Sin embargo, aún cuando las semillas representan aproximadamente el 14% del peso total del fruto, el 47.5% del ancho y el 82% de su longitud; no ha sido caracterizada química y nutracéuticamente, por lo que el objetivo del presente trabajo se enfocó en la obtención de un aislado proteínico por medio de precipitación isoeléctrica a partir de las semillas de anacahuita y caracterizarlo con base en su masa molecular, digestibilidad in vitro, actividad antioxidante y actividad antihipertensiva.
Materiales y métodos
Material Vegetal
El fruto de anacahuita se obtuvo del Ejido de San Francisco en Ciudad Victoria, Tamaulipas, se limpiaron manualmente retirando la pulpa por completo, la semilla se midió, peso, seccionó y secó en un secador por convección de aire forzado (Binder, Modelo FD 115-UL, USA), se molió, en un molino manual, la harina se tamizó a través de la malla No 40 y se almacenó a temperatura ambiente (30 ± 2 ºC) en frascos ámbar sellados herméticamente hasta su análisis.
Determinación de la Composición química proximal
Todas las metodologías utilizadas fueron las que se indican en el AOAC International (1995). El contenido de proteína se determinó por el método Kjeldahl utilizando un factor de conversión de 6.25 (Método 955.04), fibra cruda por el método de hidrólisis ácida/básica (Método 962.09), extracto etéreo con el método de soxhlet (Método 920.39C), humedad por el método de horno al vacío (Método 925.09), y cenizas por el método de calcinación (Método 923.03).
Determinación del punto isoeléctrico
La determinación del punto isoeléctrico de la proteína de la semilla de anacahuita se realizó utilizando la metodología reportada por Bernardino-Nicanor et al. (2007). La harina de la semilla de anacahuita fue sometida a un tratamiento de desengrasado utilizando éter de petróleo en un aparato de Soxhlet, la muestra de harina desengrasada se mezcló con agua en una relación 1:20 (p/v), se ajustó el pH con NaOH (0.1N) en el intervalo de 9 a 12, se mantuvo en un baño a 40ºC durante 30 min, se centrifugó (Hermle Z200A, Germany) a 4°C durante 30 minutos a 3000 x g, el sobrenadante fue colectado y se determinó el contenido de proteína por el método de Kjeldahl, seleccionando el pH dónde se encontró la mayor concentración de proteína, el sobrenadante seleccionado se ajustó a pH de 3, 4, 5, 6 y 7 con HCl (0.1N). La proteína precipitada fue separada por medio de centrifugación a 3000 x g por 30 min a 4°C y liofilizada (Freezone Plus 6, Labconco, USA), el punto isoeléctrico es el pH donde se obtuvo la mayor concentración de proteína.
La obtención del aislado proteínico se basa en 2 procesos: solubilidad de la proteína por medio de una disolución alcalina, seguida de la precipitación de la proteína por medio de la disolución ácida; una vez precipitada la proteína, se separa por centrifugación y se liofiliza (aislado proteínico)
Determinación de la digestibilidad in vitro
La digestibilidad in vitro se determinó de acuerdo al método descrito por Hsu et al. (1977) con algunas modificaciones (Queiroz et al., 2016). A 50 mL de una disolución de proteína (6.25 mg de proteína/mL) se le ajustó el pH a 8.0 con HCl O.1N o NaOH 0.1N, se agitó en baño maría a 37 °C. Se agregaron 5 mL de una disolución multienzimatica (1.6 mg de tripsina pancreática porcina, EC 3.4.21.4; 3.1 mg de quimiotripsina pancreática bovina, EC 3.4.21.1 y 1.3 mg, pancreatina, EC 3.1.3.8), se agitó por 10 min y se midió el pH. La digestión se detiene con un baño de agua en ebullición por 5 min. La digestibilidad in vitro se determinó por medio de la ecuación 1.
Determinación de la actividad antioxidante por el método de DPPH
Se determinó usando el método de DPPH, según lo establecido por Brand-Williams et al. (1995), donde se utiliza el radical estable 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo (DPPH), los antioxidantes transfieren electrones o átomos de hidrógeno a este compuesto y así neutralizan su propiedad de radical libre; esta técnica consiste en preparar una disolución del antioxidante (muestra), en metanol (0.1 mL), se adiciona 3.9 mL de DPPH en metanol (6 x10-5 mol/L). La disminución de la absorbancia se determina a 515 nm desde el tiempo 0 y cada 10 minutos hasta completar la reacción.
La actividad antioxidante fue expresada como micromoles equivalentes de Trolox por gramo de muestra (µmol ET/g muestra). El IC50 denota la concentración del compuesto para inhibir el valor inicial del DPPH a 50% a una absorbancia de 515 nm.
Determinación de la Actividad Antihipertensiva:
La capacidad antihipertensiva se determinó mediante la actividad inhibitoria de la enzima convertidora de la angiotensina (ECA) de pulmón de conejo, ≥ 2.0 unidades/mg de proteína (EC 3.4.15.1) con el método de Cushman & Cheung (1971), modificado por Hernández-Ledesma et al. (2007). El método se basa en la medida espectrofotométrica a 228 nm del ácido hipúrico formado por la reacción del sustrato hipuril-histidil-leucina (HHL) con la ECA, en presencia y ausencia del inhibidor (muestras). Se preparó una disolución de sustrato constituida por HHL (10 mM) disuelta en un tampón fosfato potásico 200 mM y cloruro sódico 300 mM, de pH 8,3. Añadiendo 25 μL de ECA, correspondientes a 4 mU de ECA disueltas en glicerol al 50%, a 110 μL de la disolución de sustrato y a 15 μL de cada una de las muestras, cuya actividad inhibitoria de la ECA se le determinó. La reacción se llevó a cabo durante 80 min a 37 ºC. Posteriormente, se inactivó la enzima por descenso del pH, adicionando 110 μL de HCl 1 N. El ácido hipúrico formado durante la reacción se extrajo con 1000 μL de acetato de etilo. Tras agitación y posterior centrifugación a 3000 x g durante 10 min a temperatura ambiente, se tomaron 750 μL de la fase orgánica. La eliminación del acetato de etilo se realizó por calentamiento a 95 ºC durante 15 min. El residuo de ácido hipúrico se disolvió en 1000 μL de agua destilada y tras agitar, se midió la absorbancia a 228 nm en un espectrofotómetro. El porcentaje de inhibición de la ACE se calculó con la ecuación 2.
Donde:
A: |
Absorbancia del control negativo (enzima + sustrato) |
B: |
Absorbancia de la muestra (enzima + sustrato + muestra) |
C: |
Absorbancia del control positivo (enzima + sustrato + farmaco) |
Los resultados se reportan como porcentaje de inhibición de la enzima tomando como referencia el losartan (farmaco comercial usado para el tratamiento de la hipertensión)
Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE)
La electroforesis se realizó utilizando condiciones desnaturalizantes con dodecil sulfato de amonio (SDS-PAGE por sus siglas en ingés), de acuerdo con la metodología de Laemmli (1970), en una celda vertical Mini Protean 3 (Bio-rad Laboratories, Hercules, CA 94547 USA). Los pesos moleculares se calcularon usando un estándar de proteínas (Bio-rad Laboratories, Hercules, CA 94547 USA) que contiene fosforilasa b (94 kDa), albúmina de suero bovino (67 kDa), ovalbumina (45 kDa), anhidrasa carbónica (30 kDa), inhibidor de tripsina (20.1 kDa) y α-lactoalbúmica (14.4 kDa). Las muestras fueron disueltas en regulador de muestra (0.1 mol/L de Tris-HCl a pH 6.8, 20 mL/100mL de glicerol, 2 g/100 mL de SDS y 0.005 g/100 mL de azul de bromofenol). La electroforesis fue realizada a 120 V durante 1.5 H. Los geles fueron teñidos con azul brillante de Coomasie R-250 por 24 h, posteriormente se destiñeron con una disolución de alcohol: agua destilada: ácido acético en proporciones 30: 60:10.
Análisis estadístico
Todos los análisis se realizaron por triplicado y los resultados se expresaron como la media ± la desviación estándar. Se realizó el análisis de varianza (ANOVA) y una prueba de Tukey para detereminar la diferencia entre medias. Se utilizó el programa SAS v. 8.0 (Institute Inc., Cary, NC, USA), para el análisis estadístico de los resultados.
Resultados y discusión
Características físicas
Las semillas de los frutos de anacahuita utilizados en el presente trabajo presentaron un peso promedio de 0.8129 ± 0.15 g. Considerando la forma de la semilla, se dividió en 3 secciones, para determinar sus dimensiones, como se indica en la Figura 1.
Las semillas de anacahuita analizadas en el presente trabajo son más grandes y de mayor peso que las provenientes de Nuevo León, de acuerdo con Alvarado et al. (2004), quienes reportaron un peso de 0.71 ± 0.11g, con dimensiones de 0.847 ± 0.76 de ancho y 1.73 ± 1.06 de largo. Estas diferencias podrían ser atribuidas a factores como la zona de procedencia, las condiciones climáticas, la época de florecimiento y la fructificación, así como su variabilidad génetica, ya que, de acuerdo con López et al. (2017), estos factores pueden afectar las características morfométricas tanto de las semillas como de los frutos de donde proceden. Es importante mencionar, que la caracterización física de la semilla no ha sido reportada en artículos recientes.
Composición químico proximal
Los resultados indicaron que la semilla de anacahuita podría ser una fuente importante de fibra y proteína, principalmente, ya que entre ambos representan el 79.2% del total de los componentes de la semilla (Tabla 1).
Tabla 1 Composición químico proximal de la semilla de anacahuita (base seca).
| Componente | Contenido (%) |
| Humedad | 7.17 ± 0.542d |
| Extracto Etéreo | 4.38 ± 0.340a |
| Proteína | 21.80 ± 0.063b |
| Cenizas | 1.57 ± 0.035f |
| Fibra | 57.45 ± 0.123a |
| Hidratos de Carbono | 14.7766c |
Nota: Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (p ≤ 0.05). Los valores son la media ± desviación estándar de tres repeticiones.
Fuente: Elaboración propia.
La semilla de anacahuita analizada en el presente trabajo mostró mayor contenido de proteína que los reportados para las semillas de otros frutos de consumo común como son el aguacate papelillo (5.68%), la guanábana (14.77%), el maqui (9.24%), la calabaza (0.1%), el mango (6.3% -10%) y la naranja (3.6%), de acuerdo con Ceballos & Montoya (2013); Vit et al. (2014); Araneda et al. (2016); Rossel et al. (2018); Mwauah et al. (2020) y Mazloomi et al. (2020), respectivamente.
Por otra parte, el contenido de extracto etéreo de la semilla de anacahuita analizada en este trabajo se encuentra dentro del intervalo reportado para semillas de parota (2.0%) y aguacate papelillo (3.31%), de acuerdo con lo reportado por Serratos et al. (2008) y Cevallos & Montoya (2013), respectivamente; sin embargo, se encuentra por debajo de lo reportado para semillas de tomate, xoconostle almendra de durazno, almendra de mango, guanábana, el maqui y calabaza con 17.1%, 19.2%, 54.4%, 9.7%, 25.7%, 11.9% y 28.3%, respectivamente (Araneda et al., 2016; Belén-Camacho, 2004; Medina et al., 2010; Prieto-García et al., 2006; Rossel et al., 2018; Vit et al., 2014).
Determinación del punto isoeléctrico y obtención del aislado proteínico
Se ha demostrado que la mayoría de las proteínas de las semillas solubilizan en un intervalo de pH´s de 9 a 12 (Pergande & Cologna, 2017), en el caso de la semilla de anacahuita la mayor cantidad de proteína solubilizada se logró a pH 12, valor semejante al reportado para las proteínas de semilla de maracuyá y guanábana (Chaparro et al., 2014; Medina et al., 2011); sin embargo, es un valor superior a los reportados para la proteína de la semilla de mango (pH 9), jitomate (pH 8), papaya (pH 10) y naranja (pH 10), de acuerdo con Chaparro-Acuña et al. (2015); Sarkar et al. (2016); Kadiri et al. (2017) y Mazloomi et al. (2020), respectivamente.
Por otra parte, de acuerdo con Pergande & Cologna (2017), el punto isoeléctrico de las proteínas obtenidas a partir de semillas, generalmente, se encuentra dentro del intervalo de pH´s ácidos (entre 2 y 6), en el caso de la semilla de anacahuita el punto isoeléctrico se encontró a pH 4 (Figura 2), valor semejante al reportado para semillas de maracuyá, guanábana y papaya (Chaparro et al., 2014; Kadiri et al., 2017; Medina et al., 2011), pero inferior a los reportados para semillas de mango (pH 6), de acuerdo con Chaparro-Acuña et al. (2015) y superior al de la semilla de jitomate (pH 3.5) y naranja (pH 3), de acuerdo con Sarkar et al. (2016) y Mazloomi et al. (2020), respectivamente.
La cantidad de proteína presente en el aislado proteínico obtenido a partir de la semilla de anacahuita fue del 83.48%, valor superior al reportado en el aislado de semilla de guanábana (63%), de acuerdo con Chaparro et al. (2014), sin embargo, fue inferior al reportado para la semilla de maracuyá (95.6%) y jitomate (91.8%) de acuerdo con Medina et al. (2011) y Sarkar et al. (2016), respectivamente.
La diferencia existente entre el punto isoeléctrico de la proteína de la semilla de anacahuita y las semillas de otros frutos reportados en la literatura es un indicio de la diferencia existente en la composición de aminoácidos y la organización 3D de la estructura de la proteína de acuerdo con Pergande & Cologna (2017).
Determinación de la digestibilidad in vitro
Los resultados mostraron diferencia estadísticamente significativa entre la digestibilidad in vitro de la harina de la semilla de anacahuita con respecto al aislado proteínico, siendo este último el que mostró mayor digestibilidad (Tabla 2), lo cual podría ser debido a que el proceso de aislamiento provoca la desnaturalización de la proteína, incrementando la disponibilidad de esta macromolécula, según lo indicado por Pergande & Cologna (2017).
Tabla 2 Digestibilidad in vitro y actividad antihipertensiva de la harina y aislado proteínico de la semilla de anacahuita.
| Muestra | Digestibilidad in vitro (%) |
IC50*1 (mg/ml) |
Actividad antioxidante (µmol ET/g muestra) |
% inhibición de ECA*2 |
| Harina | 82.29 ± 0.31b | 302.4 ± 0.29a | 3.037 ± 0.017b | 57.11 ± 0.04a |
| Aislado | 87.36 ± 0.57a | 79.6 ± 0.24b | 11.265 ± 0.073a | 64.10 ± 0.01b |
Nota: Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (p ≤ 0.05).
Los valores son la media ± desviación estándar de tres repeticiones.
*1 Actividad antioxidante.
*2 Actividad antihipertensiva, usando como control el losartan.
Fuente: Elaboración propia.
La harina y el aislado proteínico de semilla de anacahuita muestran valores de digestibilidad in vitro entre 12% y 17% menor que el de la caseina (99.08%), esta proteína es considerada como referencia en lo relativo a la calidad nutricional de una proteína (Msarah & Alsier, 2018), al encontrarse por arriba del 80% podría considerarse de buena calidad nutricional.
Por otra parte, la digestibilidad mostrada por la harina y el aislado fue superior al reportado para semillas de calabaza (77.91%) y mezquite (72.52%) (Atuonwu & Akobundu, 2010; Gallegos-Infante et al., 2013), sin embargo, el aislado presenta un valor de digestibilidad semejante al de las semillas de melón (88%), de acuerdo con Iakshmi & Kaul (2011).
Actividad antioxidante
Los resultados indican que la actividad antioxidante es una propiedad que no se ve alterada por efecto del aislamiento (Tabla 2), toda vez que para alcanzar el IC50 (cantidad de compuesto antioxidante que se requiere para inhibir el 50% del DPPH) se requiere la misma cantidad de muestra en ambos casos, si se considera la proporción de proteína en cada muestra.
De acuerdo con la clasificación propuesta por Kuete & Efferth (2010), tanto la harina como el aislado son compuestos con baja actividad antioxidante, ya que el IC50 > 0.1 mg/mL; considerando que se trata de un subproducto, la capacidad antioxidante mostrada por ambas muestras podría ser aprovechada para la elaboración de alimentos funcionales.
La actividad antioxidante mostrada por el aislado y la harina podría ser atribuida a la capacidad que presentan las proteínas para inactivar especies reactivas de oxígeno, eliminar radicales libres, quelar metales prooxidantes, reducir hidroperóxidos y eliminar oxidantes específicos, además de dar un indicio de la posible presencia de histidina, tirosina y triptofano, aminoácidos que se ha demostrado presentan actividad antioxidante (Elias, 2008).
La actividad antioxidante de la harina y aislado de la semilla de anacahuita es inferior a la reportada para harina de semilla de calabaza (3.4 - 0.94 mg/mL), semilla de guanábana (5.44 mg/mL), semilla de yaca (0.78 mg/mL), y aislado proteínico de semilla de papaya (2.5 mg/mL), de acuerdo con lo reportado por Dash & Ghosh (2016); Adefgha et al. (2015); Gupta et al. (2011) y Kadiri et al. (2017), respectivamente.
La semilla de nacahuita presenta mayor actividad antioxidante que la semilla de mandarina (1.41 a 1.87 mmol Equivalentes de Trolox/Kg), naranja (1.49-1.72 mmol Equivalentes de Trolox/Kg) y limón (mmol Equivalentes de Trolox/Kg) de acuerdo a lo reportado por İnan et al. (2018).
Determinación de la Actividad Antihipertensiva
Los resultados (Tabla 2) mostraron que el aislado proteínico de la semilla de anacahuita no mantuvo la actividad antihipertensiva con respecto a la presentada por la harina, considerando la proporción de proteína que contiene cada muestra, lo cual podría indicar que esta propiedad está determinada, no solo por la proteína, si no por otros componentes presentes en la harina, que se pierden durante el proceso de aislamiento.
La capacidad antihipertensiva mostrada por el aislado en particular podría ser debida a que el proceso de aislamiento desarrolla la estructura proteínica dejando disponibles aminoácidos aromáticos, que han demostrado favorecer la interacción con el sitio activo de la ECA (Cheung et al., 1980). Mientras que, en el caso de la harina, además de la presencia de los aminoácidos aromáticos, también podría contener compuestos fenólicos, que han demostrado tener actividad antihipertensiva según lo indicado por Vargas-León et al. (2018).
Son escasos los estudios enfocados a la actividad antihipertensiva de semillas y en el caso de subproductos como las semillas de frutos difícilmente es analizada esta propiedad, en el caso de la semilla de anacahuita se observó que tanto la harina como el aislado mostraron tener buena capacidad antihipertensiva, ya que los valores obtenidos en ambos casos están por arriba del IC50 y comparados con el control (losartan) mostraron valores menores a este en un 28.47% y 36.47% para aislado y harina respectivamente (Tabla 2). Nuevamente, se considera que es un valor adecuado, toda vez que se trata de un subproducto de la agroindustria.
Comparado con valores de otros productos, la semilla de anacahuita se encuentra dentro del intervalo reportado para la flor de jamaica (Vargas-León et al., 2018), sin embargo, se requiere mayor concentración tanto de semilla como de aislado (100 mg/mL) para alcanzar el IC50, en comparación con las semillas de semilla de mezquite (1 mg/mL), guanábana (0.20 mg/mL) y maracuyá (0.017 mg/mL) (Adefgha et al., 2015; Gallegos-Infante et al., 2013; González et al., 2019).
Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE)
El perfil electroforético de la harina y del aislado (Figura 3) presenta subunidades similares ubicadas en 12 kDa, 52kDa, y 220 kDa, lo cual es un indicio de la estabilidad de la estructura proteínica sobre los cambios de pH (Sorgentini et al., 1996). Por otra parte, se ha reportado que un tratamiento de extracción alcalina genera residuos proteínicos derivado de la ruptura de algunos aminoácidos modificando la estructura de la proteína (Zhang et al., 2018), lo cual se reflejó en la aparición de nuevas bandas ubicadas en 32 kDa, 45 kDa, 160 kDa y 200 kDa (Figura 3).
Conclusiones
La desnaturalización de la proteína provocada por el proceso de aislamiento fue observada en el patron electroforético con la aparición de nuevas bandas, lo cual fue debido a que el pH al que se encuentra su punto isoeléctrico fue 4.0. Estas condiciones incrementaron la digestibilidad in vitro del aislado proteínico en aproximádamente 5% con respecto a la harina, la actividad antioxidante se mantuvo considerando la proporción de la proteína contenida en cada muestra, sin embargo, la capacidad inhibitoria de la Enzima Convertidora de Angiotensina del aislado fue 3.8 veces menor a la esperada, considerando la proporción de proteína contenida en la muestra, lo que indica que esta propiedad está determinada por otros componentes que están presentes en la harina y se pierden durante el aislamiento.
Conflictos de intereses
Los autores declaran que no existen conflicto de intereses.
