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Introducción
El receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) es un componente principal en la trasmisión excitatoria en el sistema nervioso central. Está asociado con funciones cerebrales normales como la plasticidad sináptica (Li et al., 2007) y con los procesos de aprendizaje y memoria (Morris, 2013). Enfermedades neurodegenerativas, depresión, esquizofrenia, dolor, epilepsia, incluido Alzheimer, son patologías donde se ha descrito una disfunción del receptor NMDA (Liu et al., 2019; Zhang et al., 2016; Zhou & Sheng, 2013). Las implicaciones de este receptor NMDA en la fisiología y fisiopatología del sistema nervioso central son razones suficientes para su estudio multidisciplinario, con la finalidad de comprender mejor su papel en la fisiología cerebral y con la esperanza de descubrir posibles blancos o mecanismos terapéuticos. Queda claro que la enseñanza-aprendizaje de este tema resulta fundamental en estudiantes de medicina, enfermería, biomedicina, biología y todas las carreras afines. Hasta la fecha, en internet, no se encuentra disponible un programa de cómputo desarrollado específicamente para la enseñanza del NMDAR. En este trabajo se desarrolló un software interactivo de la electrofisiología básica del receptor NMDA con fines de enseñanza.
Estructura del receptor NMDA
Los receptores NMDA son macromoléculas tetraméricas. Están formados por cuatro subunidades de entre siete diferentes tipos: NR1, NR2A, NR2B, NR2C, NR2D, NR3A y NR3B. Las subunidades más frecuentes encontradas en los receptores NMDA son: dos de tipo NR1, subunidad obligatoria expresada ubicuamente (Chaffey & Chazot, 2008) y dos del tipo NR2. El tipo NR2 cuenta con cuatro isoformas (A-D) que se presentan diferencialmente de acuerdo al tipo de neurona, estado de desarrollo y localización sináptica o extrasináptica (Laube et al., 1998). En consecuencia, un receptor NMDA presenta combinaciones de subunidades y forman un heterotetrámero (Kutsuwada et al., 1992). Existen evidencias de diferentes combinaciones en el sistema nervioso central y neuronas del ganglio de la raíz dorsal (NR1/NR2B/NR2A, NR1/NR2B/NR2D, entre otras). Se trata de receptores heterólogos con propiedades funcionales y farmacológicas distintas (Chaffey & Chazot, 2008; Dingledine et al., 1999). Los receptores NMDA homoméricos NR2 forman canales no funcionales, y los homoméricos NR1 presentan una corriente muy pequeña. Estudios de recombinación han mostrado que las propiedades del receptor NMDA están definidas por las subunidades (Cull-Candy et al., 2001).
Cada subunidad presenta tres regiones (Figura 1): (1) región extracelular con dos dominios: dominio amino terminal (DAT) y dominio para la unión de ligando (DUL); (2) región transmembranal, con tres segmentos transmembranales (M1, M2, M3) y un segmento M2 que forma el poro (DTM); y (3) una región intracelular con el dominio carboxilo terminal (DCT), más largo en NR2 y más corto en NR1 con sitios de unión a Ca2+ y calmodulina. El receptor NMDA se activa por la unión simultánea de glutamato y glicina. El dominio DUL en NR1 tiene sitio de unión a la glicina. El dominio DUL en NR2 tiene sitio de unión al glutamato y al agonista NMDA (Hansen et al., 2017; Martínez-Visbal et al., 2020; Sibarov et al., 2018)(Figura 1). En la parte profunda del poro el Mg2+ bloquea al canal. Este tipo de bloqueo depende del ensamble del canal, los receptores NR1-NR2A y NR1-NR2B se bloquean más fuertemente que NR1-NR2C y NR1-NR2D (Kuner & Schoepfer, 1996). En el dominio amino terminal (DAT) de NR2 se localiza un sitio de unión para el Zinc (Amico-Ruvio et al., 2011). El efecto de diferentes agentes farmacológicos depende de los subtipos del receptor NMDA (Cull-Candy et al., 2001).
Fuente: Elaboración propia con base en Hansen et al. (2017), Sibarov & Antonov (2018) y Martínez-Visbal et al. (2020).
Figura 1 (a) Esquema del receptor canal NMDA. Se muestra una subunidad NR1 donde se une la glicina (triángulo verde) y una subunidad NR2 donde se une el glutamato (círculo azul). Cada una se divide en cuatro dominios: dominio amino terminal (DAT), dominio de unión a ligando (DUL), dominio transmembranal (DTM) y dominio carbono terminal (DCT). (b) heterotetrámero formado por dos subunidades NR1 (verdes) y dos NR2 (café).
Características electrofisiológicas básicas del receptor NMDA
Las investigaciones reportan que la activación del receptor canal NMDA requiere de la acción simultánea de glutamato como neurotransmisor y de glicina como co-agonista (Johnson & Ascher, 1987). La acción del glutamato sobre el receptor NMDA está asociada al proceso de neurotransmisión sináptica. El neurotransmisor excitador que activa al receptor NMDA es el glutamato. Se presume que la acción de la glicina está asociada a la interacción de neuronas con astrocitos. El efecto de la glicina sobre el receptor NMDA se ve modificado por los cambios dinámicos de su concentración extracelular provocados por su captación o liberación del transportador (GlyT1), presentes en astrocitos (glía) y neuronas postsinápticas (Harsing & Matyus, 2013). La homeostasis de la glicina se encuentra perturbada en desórdenes neuronales como esquizofrenia y autismo (Coyle & Tsai, 2004). La glicina en concentraciones del orden cercano a micromolar (EC50 < 1 μM en neuronas y de 1μM a 3 μM en ovocitos transfectados) incrementa la amplitud de la corriente NMDA (Chen et al., 2008). La concentración de glicina en la sinapsis es difícil de medir. En el espacio sináptico, la concentración de glicina medida con métodos de microdiálisis se encuentra entre valores nanomolar a valores bajos micromolar (Cummings & Popescu, 2015; Papp et al., 2008). En investigaciones con la técnica de fijación de voltaje se muestra que la amplitud de la corriente es dependiente de las concentraciones de glutamato y glicina: un incremento en las concentraciones de glutamato (o NMDA) y glicina generan una mayor corriente NMDA (McBain et al., 1989). La corriente NMDA está compuesta del influjo de Ca2+ y Na+ y del eflujo de K+ (canal catiónico). En consecuencia, su potencial de equilibrio es cercano a 0 mV (Ascher & Nowak, 1988). Después de la activación del receptor NMDA por NMDA y glicina, con el paso del tiempo (segundos) la amplitud de la corriente NMDA decrece debido a un proceso de desensibilización dependiente de calcio (Iacobucci & Popescu, 2020; Sibarov & Antonov, 2018).
El Mg2+ externo entra al canal NMDA y lo bloquea. Existe una dependencia del voltaje sobre el bloqueo de Mg2+. En experimentos en presencia de Mg2+, la corriente NMDA es nula o pequeña a valores de voltaje hiperpolarizados (< -50 mV) (Dingledine et al., 1999). La curva I-V se rectifica a esos potenciales. A potenciales de reposo el receptor NMDA, en la mayoría de los subtipos de receptores NMDA, se encuentra bloqueado por Mg2+. En la sinapsis, otros canales como los receptores AMPA (ácido α-amino-3-hidroxi-5-metilo-4-isoxazolpropiónico) despolarizan la membrana y desbloquean al canal NMDA (Chater & Goda, 2014). El sitio de unión para el Mg2+ se localiza en la parte profunda del poro del receptor NMDA (McMenimen et al., 2006), probablemente, cerca o más allá del campo eléctrico (Ascher & Nowak, 1988). La cinética de bloqueo por Mg2+ parece depender del tipo de neurona y de las subunidades NR2 presentes en el receptor (Cepeda et al., 2001). En lesiones traumáticas cerebrales se reduce el bloqueo por Mg2+ y su dependencia de voltaje se encuentra alterada (Zhang et al., 1996). En este tipo de lesión, el daño a los astrocitos produce un aumento en la concentración extracelular de glutamato, lo que ocasiona un incremento en el influjo de Ca2+ por el canal NMDA (excitotoxicidad por glutamato). El alto Ca2+ interno dispara cascadas bioquímicas que a su vez producen daño y muerte neuronal (Arundine & Tymianski, 2004; Carvajal et al., 2016). Las implicaciones del receptor canal NMDA en la función cerebral y en algunas patologías del sistema nervioso han motivado su intensa investigación (André et al., 2004) y refleja la importancia que tiene su enseñanza.
Receptor NMDA y su enseñanza
En diversos cursos de fisiología y biofísica a nivel licenciatura se hace una introducción a los canales iónicos. Por su mecanismo de activación a los canales iónicos, se les puede clasificar en: (1) canales dependientes de voltaje, (2) canales metabotrópicos y (3) canales iónicos asociados al ligando. Los canales iónicos dependientes de voltaje se caracterizan por ser activados por un voltaje característico llamado potencial umbral, fueron descritos por Hodgkin y Huxley (Hodgkin & Huxley, 1952) y básicamente son los que se exponen en licenciatura con cierta profundidad. Los canales metabotrópicos se caracterizan por ser un complejo formado por un receptor con sitio de unión a un ligando y un canal iónico que se localiza distante del receptor. La forma de activación de este canal se logra por la acción de segundos mensajeros. Los canales ionotrópicos asociados al ligando se caracterizan por un canal iónico en cuya estructura se encuentra el receptor. Es el caso del receptor NMDA.
Se realizó una búsqueda de la temática en los cursos de fisiología que se imparten en varias universidades de México a nivel licenciatura (Ciudad de México, Estado de México, Guadalajara, Guanajuato, Puebla, Monterrey y Yucatán), y en ningún caso se aborda el receptor NMDA. Por ejemplo, las prácticas de laboratorio de fisiología en la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional Autónoma de México se centran en temas como la fisiología cardiovascular, respiratoria y muscular, entre otras. Combinan prácticas de laboratorio tradicional con prácticas virtuales. Para este propósito, utilizan el software biopac (Manual Biopac Systems, Inc. Manual Biopac Student Bookstore versión 08.09.06. www.biopac.com). Ninguna de sus prácticas aborda el estudio del receptor NMDA. La página web revisada en marzo 2022 es: https://www.zaragoza.unam.mx/wp-content/Portal2015/Licenciaturas/medico/manuales/Manual_Fisiologia.pdf. La ausencia del estudio del receptor NMDA a nivel licenciatura puede deberse al menos a cuatro razones: (1) lo complicado del tema rebasa los alcances del estudio de la fisiología en la licenciatura, (2) los altos costos para la implementación de prácticas de laboratorio sobre la electrofisiología de los canales iónicos, (3) la inexistencia de simuladores de enseñanza para este tema y (4) la falta de tiempo. No se puede argumentar que el receptor NMDA es un tema poco importante o práctico en la formación médica.
El simulador se diseñó bajo la siguiente hipótesis: Si el simulador genera adecuadamente la electrofisiología básica del receptor NMDA, entonces: (1) reproducirá los experimentos dosis-respuesta generados por la unión de glicina y NMDA con el receptor; además, (2) se podrá reproducir el bloqueo por Mg2+ del canal NMDA cuando se encuentra a potenciales hiperpolarizados y cómo se desbloquea a potenciales despolarizados.
El objetivo de este trabajo es contar con un software educativo para el estudio del receptor NMDA que permita realizar experimentos virtuales, determinar el efecto de la unión de glicina y NMDA en el receptor, mostrar experimentalmente el bloqueo del canal NMDA por Mg2+ y generar curvas de corriente contra voltaje (curvas I-V).
Materiales y métodos
Se diseñaron tres simuladores interactivos para la enseñanza-aprendizaje de la electrofisiología básica del receptor canal NMDA. Se utilizó el lenguaje de programación Visual Basic® versión 6.0 para ambiente Windows®, y se compiló para ser ejecutable desde Windows® 7 a Windows® 11. Fue desarrollado por un grupo multidisciplinario de las siguientes áreas: educación, diseño digital, computación, medicina, fisiología, biología y patología molecular, neurociencias, matemáticas y biofísica. Brevemente, la estrategia de desarrollo consistió en (secuencialmente): selección de la temática de enseñanza, disposición del equipo de cómputo y software, búsqueda de publicaciones de experimentos con la mayor cantidad de datos para las variables y parámetros, selección de los modelos matemáticos y adecuación, determinación de las variables de referencia, implementación en Visual Basic®, solución de los modelos, pruebas de funcionalidad, manipulación de variables para ajustar la variable de referencia con las variables de los experimentos reales, diseño de la interfaz, pruebas de funcionalidad en diferentes Windows, pruebas en grupo piloto, retroalimentación, compilación, software ejecutable final.
Simulador para el estudio de bloqueo del receptor NMDA por Mg2+
Se diseñó y desarrolló un simulador para el estudio del efecto de la concentración externa de Mg2+ y del voltaje sobre la corriente macroscópica NMDA. En este simulador, la corriente NMDA está gobernada por el modelo matemático de Jahr y Stevens modificado (Jahr & Stevens, 1990b) (ecuación 1):
donde INMDA es la corriente macroscópica NMDA; gmax es la conductancia máxima del receptor NMDA; gNMDA(t) es el cambio de conductancia con respecto al tiempo (ecuación 3); B(V, Mg2+) es la función de activación dependiente de voltaje y de la concentración de Mg2+ externo; F(T) es la función escalón, con T = 1; V es el voltaje; y ENMDA es el potencial de equilibrio NMDA.
La función de activación del receptor canal NMDA derivada del modelo de cuatro estados corresponde a la ecuación 2. Esta ecuación muestra que la conductancia del canal NMDA depende del voltaje y de la concentración externa de Mg2+ (Jahr & Stevens, 1990a, 1990b):
donde B(V, Mg2+) es la función de activación; [Mg2+] es la concentración externa de magnesio; V es el voltaje; 3.57 mM y 16.13 mV son parámetros de ajuste de datos de las curvas experimentales GNMDA -vs- voltaje de registros en neuronas disociadas de hipocampo, con 30 μM y 1 μM de NMDA y glicina, respectivamente, a un voltaje de -60 mV y para una concentración de magnesio extracelular fisiológica de 1 mM (Jahr & Stevens, 1990a, 1990b).
En este simulador, la conductancia NMDA (gNMDA(t)) se modeló con dos exponenciales según la ecuación 3, con constantes de tiempo adecuadas para experimentos de corriente macroscópica (Dave et al., 2021; Sterratt et al., 2011):
donde gNMDA(t) es la conductancia NMDA dependiente del tiempo y τf y τs son las constantes de tiempo rápida y lenta, respectivamente. Las constantes de tiempo fueron modificadas de Hestrin y colaboradores (Hestrin et al., 1990), ajustadas a las corrientes iónicas NMDA, registradas con la técnica de fijación de voltaje en célula entera.
Simulador para el estudio de la interacción receptor NMDA con glicina y NMDA y generación de curvas dosis-respuesta
Este simulador está basado en los datos experimentales de McBain y colaboradores, corresponden al registro de la corriente NMDA de receptores expresados en Xenopus oocytes (McBain et al., 1989). En este trabajo se estudió la co-activación del receptor canal NMDA por el co-agonista glicina con cuatro diferentes concentraciones: 0.0 μM, 0.3 μM, 1 μM y 30 μM. Para cada una de estas concentraciones de glicina, se generó la curva dosis-respuesta correspondiente con diferentes concentraciones del agonista NMDA: 1.0 μM, 5.0 μM, 50 μM, 100 μM, 500 μM y 1000 μM.
Ajuste de curvas experimentales corriente -vs- [NMDA] reportadas por McBain y colaboradores
Los datos de las curvas INMDA -vs- [NMDA] reportadas por McBain y colaboradores (McBain et al., 1989) se ajustaron con modelos matemáticos mediante el algoritmo de Levenberg-Marquardt para ajuste no lineal con mínimo cuadrados, con el programa Origin Pro (OriginLab Corp., Northampton, MA, USA).
Con 0.0 μM de glicina no se registró corriente NMDA. Para valores de glicina, iguales o menores a 0.3 μM, las curvas INMDA -vs- [NMDA] se ajustaron con dos exponenciales (ecuación 4):
Con glicina > 0.3 mM, las curvas INMDA -vs- [NMDA] se ajustaron con una exponencial (ecuación 5):
donde INMDA es la corriente NMDA registrada, y0 es el valor inicial, A1 y A2 son los coeficientes, [NMDA] es la concentración de NMDA aplicada y (1 y (2 son constantes de tiempo.
Determinación de la corriente NMDA pico para el simulador NMDA-glicina (dosis-respuesta)
En el simulador, primero se calculó la conductancia NMDA pico a partir de la ecuación 6 (experimentos con V = -60 mV y [Mg2+] = 1 mM):
Los valores teóricos de la conductancia pico resultantes de la ecuación 6 se igualan con las ecuaciones de los ajustes de los datos experimentales de McBain y colaboradores para las diferentes concentraciones de glicina (McBain et al., 1989). Así, para los datos experimentales con glicina ( 0.3 μM se ajustan a la función con dos exponenciales (ecuación 4) y se divide por el voltaje (V - ENMDA).
donde ENMDA = 0 mV (ecuación 7).
En los experimentos con glicina > 0.3 μM, el valor teórico para gNMDA(pico) se iguala con la función de ajuste de los datos experimentales (ecuación 5) y se divide por el voltaje (ecuación 8).
La corriente NMDA pico depende de la concentración externa de NMDA, de la concentración de glicina con valores experimentales (0.0 μM, 0.3 μM, 1.0 μM, 30 μM) y del voltaje (V = -60 mV) (ecuación 9).
Determinación de la corriente NMDA durante el tiempo de duración de la función escalón
En el simulador que reproduce los experimentos dosis-respuesta para diferentes concentraciones de NMDA y glicina, la función gNMDA(D-R)(t) sigue un comportamiento exponencial. Inicia con el valor pico de corriente NMDA calculado para cada concentración de NMDA y de glicina y finaliza al tiempo de terminación la función escalón (función modificada de Sterratt y colaboradores) (Sterratt et al., 2011) (ecuación 10):
donde (NMDA es la constante de tiempo de decremento de la corriente NMDA pico (desensibilización) y t es el tiempo.
La corriente NMDA (INMDA(D-R)) resultante sigue la ecuación 11:
donde A es un parámetro de ajuste para que la función gNMDA(D-R)(t) inicie en INMDA(pico). Las demás variables están definidas arriba.
Simulador de canal único
Este simulador reproduce la apertura y cierre del canal receptor NMDA único en dos condiciones experimentales: Mg2+ = 0.0 μM y Mg2+ = 500 μM.
Los experimentos sin magnesio generan una curva INMDA -vs- voltaje de tipo lineal, con un potencial de inversión ENMDA = 0 mV (Jahr & Stevens, 1990a, 1990b). Los experimentos con 500 μM de magnesio generan curvas INMDA -vs- voltaje de tipo no lineal. Tanto el tiempo de aparición de apertura del canal como la duración de apertura del canal están determinados mediante un algoritmo al azar (Jahr & Stevens, 1990b). La amplitud de la corriente está gobernada por la ecuación 12.
donde INMDA(único) es la amplitud de la corriente del canal único, gNMDA(único) es la conductancia NMDA, V es el voltaje y ENMDA es el potencial de equilibrio NMDA. B(V, Mg2+) es la función definida anteriormente.
Resultados
Se desarrolló el programa de cómputo interactivo Lab-NMDAR versión 1.0, integrado por tres simuladores: (1) el simulador NMDAR-Bloqueo Mg2+ permite el estudio de la dependencia de voltaje del bloqueo por Mg2+ de la corriente NMDA; (2) el simulador NMDAR-Glicina permite realizar experimentos virtuales dosis-respuesta -se aumentan o disminuyen las concentraciones de NMDA y glicina y se registran las corrientes NMDA correspondientes-; y (3) el simulador canal único NMDA-Bloqueo Mg2+ permite el estudio del bloqueo de Mg2+ en canal único y su dependencia con el voltaje.
La ventana inicial del programa muestra un menú con botones para acceder a cada uno de los simuladores (Figura 2). El menú presenta además un botón para acceder a un leccionario, el cual introduce a los alumnos a los principios básicos del tema.
Fuente: Elaboración propia.
Figura 2 Menú principal del acceso a los simuladores. De arriba abajo: El botón <Fijación de voltaje (Investigación)> permite acceder al simulador para el registro de la corriente macroscópica NMDA en neuronas de hipocampo variando el voltaje de estímulo en condiciones experimentales con y sin magnesio. El botón <Fijación de voltaje (Dosis-Respuesta)> abre el simulador para experimentos de dosis-respuesta variando la de concentración NMDA y de glicina en ovocitos transfectados. El botón <Técnica de canal único)> acceder al simulador para el registro de la corriente NMDA unitaria variando el voltaje de estímulo en condiciones experimentales con y sin magnesio. El botón <Leccionario> lleva a las lecciones introductorias del tema.
Simulador NMDAR-Bloqueo Mg2+
Interfaz de usuario
La Figura 3 muestra la interfaz de usuario del simulador NMDAR-Bloqueo Mg2+. Cuenta con un módulo de ingreso de datos de las variables: Voltaje y concentración externa de Mg2+. En la parte central de la interfaz se muestran cuatro osciloscopios: (A) osciloscopio para el registro de la corriente NMDA, (B) osciloscopio que muestra la conductancia NMDA (gNMDA), (C) osciloscopio para el trazo de la concentración de Ca2+ interno, y (D) osciloscopio que muestra el voltaje de estímulo. Los recuadros verdes que se localizan en el lado izquierdo del osciloscopio superior (A) indican el tiempo y la corriente NMDA medida con el cursor sobre el trazo de la corriente. El color del trazo se puede seleccionar entre los colores negro, azul y rojo. El botón amarillo <Graficar (I-V)> lleva a una ventana donde se puede graficar toda la curva de valores de corriente pico NMDA contra el voltaje de estímulo. El objetivo de este simulador es construir una curva corriente-vs- voltaje en dos condiciones: sin Mg2+ extracelular y con Mg2+ extracelular (1 mM). El alumno puede seleccionar valores de Mg2+ entre 0 mM a 2 mM (concentración fisiológica 1 mM [Nowak et al., 1984]).
Fuente: Elaboración propia con base en Jahr & Stevens (1990a, 1990b).
Figura 3 Interfaz del simulador NMDAR-Bloqueo Mg2+ y experimento sin magnesio. Registro en neuronas de hipocampo con 30 μM de NMDA y 1 μM de glicina. (A) muestra el registro de la corriente NMDA generada a un voltaje de -90 mV y con cero magnesio. Es una corriente entrante que alcanza una amplitud pico de -414.1 pA (recuadro en verde). Se observa la desensibilización (disminución de la amplitud con el paso del tiempo). (B) muestra la disminución de la conductancia NMDA. (C) muestra trazo del incremento de calcio interno. (D) muestra el registro del voltaje de estímulo.
Modo de uso
Simulación en neurona de corriente NMDA sin Mg2+ externo
La corriente NMDA es dependiente de voltaje. En experimentos sin Mg2+ externo se observa cómo a valores hiperpolarizados la corriente registrada es máxima. La Figura 3 muestra un experimento en neurona con un voltaje de estímulo de -90 mV y una duración de tres segundos. La concentración externa de Mg2+ fue de 0 mM. El trazo superior corresponde a la corriente NMDA simulada (Figura 3a). Se observa una corriente entrante con una amplitud inicial de -414.1 pA (corriente pico). Al paso del tiempo, la corriente NMDA va disminuyendo hasta alcanzar al final del estímulo una amplitud de -86.9 pA (corriente final). Esta disminución se debe al proceso de desensibilización dependiente de calcio interno (grado de desensibilización = 0.79). En el osciloscopio que muestra la concentración de Ca2+ interno se observa cómo la concentración aumenta lentamente (Figura 3c). La conductancia disminuye (Figura 3b).
Para la construcción de la curva corriente -vs- voltaje (curva I-V), se ingresan al simulador valores sucesivos de voltaje de estímulo en un rango de -90 mV a + 30 mV con pasos de 10 mV. El grupo de corrientes simuladas durante estos experimentos se muestra en la Figura 4a. El alumno debe medir la amplitud pico de cada corriente NMDA y anotarla en su bitácora con el voltaje de estímulo correspondiente. Con el botón <Graficar (I-V)> se accede a la interfaz donde se ingresan los datos medidos para generar la gráfica corriente -vs- voltaje. Del lado derecho de la interfaz se ingresan los datos de voltaje de estímulo de -90 mV a +30 mV junto a las amplitudes de corrientes pico simuladas (Figura 4b). El botón <GRAFICAR> traza la curva I-V correspondiente. En condiciones sin magnesio, relación corriente-voltaje (I-V) sigue una cinética lineal semejante a la reportada en ovocitos y células HEK 293 transfectadas con receptores NMDA (NR1a-NR2A) (Paoletti et al., 1997). El potencial de equilibrio para la corriente NMDA fue de 0 mV (Figura 4c).
Fuente: Elaboración propia con base en Jahr & Stevens (1990a, 1990b).
Figura 4 Interfaz de la curva I-V. Experimento sin magnesio. (A) Corrientes NMDA simuladas con voltajes de estímulo de -90 mV a +30 mV en pasos de 10 mV. (B) Las amplitudes pico en potenciales hiperpolarizantes son grandes debido a que no existe bloqueo por Mg2+. (C) La cinética de la relación I-V es lineal.
Simulación de corriente NMDA con Mg2+ externo 1 mM en neuronas
El Mg2+ externo ingresa dentro del poro del canal NMDA y lo bloquea cuando los valores de voltaje de estímulo se encuentran hiperpolarizados (entre -90 mV a -70 mV). Esta dependencia de voltaje domina el papel fisiológico de los canales NMDA (McMenimen et al., 2006; Nowak et al., 1984). A potenciales de reposo, la mayoría de los canales se encuentra bloqueado (no todos) y la corriente NMDA registrada es mínima. La Figura 5 muestra una simulación con Mg2+ = 1 mM y a un voltaje de estímulo de -90 mV con una duración de 3 s. En estas condiciones la corriente NMDA generada es muy pequeña (-3.1 pA), comparada con la corriente NMDA cuando el Mg2+ = 0 mM (-414.1 pA). En estas condiciones prácticamente no se presenta conductancia y no existe incremento notorio de Ca2+ interno.
Fuente: Elaboración propia con base en Jahr & Stevens (1990a, 1990b).
Figura 5 Interfaz del simulador NMDAR-Bloqueo Mg2+ y experimento con magnesio. Registro en neuronas de hipocampo con 30 μM de NMDA y 1 μM de glicina. (A) se muestra el registro de la corriente NMDA generada a un voltaje de -90 mV y con 1 mM de magnesio. Se observa un bloqueo de la corriente NMDA, su amplitud pico solamente alcanza -3.1 pA (recuadro en verde). (B) No se alcanza a ver la conductancia NMDA. (C) Prácticamente no existe incremento de calcio interno. En (D) se muestra registro del voltaje de estímulo.
Se realizaron dos grupos (un grupo sin magnesio y otro con Mg2+ = 1 mM) de simulaciones con estímulos de voltaje de -90 mV a + 30 mV con pasos de 10 mV. Los datos fueron ingresados en la interfaz para graficar simultáneamente las curvas I-V. Las curvas resultantes se muestran en la Figura 6. Para el caso de 0 Mg, el proceso es lineal, y para el caso de Mg2+ = 1 mM, se observa una curva no lineal con rectificación a valores hiperpolarizantes (< -70 mV) debido al bloqueo por Mg2+ externo. A partir de -50 mV, conforme el voltaje de estímulo es menos negativo, se desbloquea el canal NMDA y la cinética se hace lineal.
Fuente: Elaboración propia con base en Jahr & Stevens (1990a, 1990b).
Figura 6 Interfaz de la curva I-V. (A) Experimentos sin magnesio. Se muestran las corrientes NMDA simuladas con voltajes de estímulo de -90 mV a +30 mV en pasos de 10 mV. (B) Las amplitudes pico en potenciales hiperpolarizantes (-90 mV a -70 mV) son pequeñas debido al bloqueo por Mg2+. A partir de -60 mV a -30 mV se observa un incremento en la amplitud pico de la corriente NMDA (trazos en negro, A). Con valores depolarizantes a partir de -30 mV la curva se hace lineal (círculos en rojo, C, trazos en rojo en A). (B) Datos de voltaje de estímulo y corriente generada para el caso con Mg2+. (C) Comparativa de las simulaciones con magnesio (círculos en rojo) y sin magnesio (círculos en negro).
Simulador NMDAR-Glicina
Trabajos pioneros reportaron que el receptor canal NMDA se activa por la acción del glutamato en las sinapsis excitatorias del cerebro (Watkins & Evans, 1981). En ovocitos transfectados con canales NMDA se probó la participación de la glicina como un coagonista que incrementa la amplitud de la corriente NMDA (Dingledine et al., 1999). Minuciosos estudios describen que el glutamato o el NMDA se une a la parte del dominio de unión al ligando (DUL) del segmento NR2, y la glicina se une al correspondiente dominio en el segmento NR1 (Traynelis et al., 2010). En este simulador se usaron los datos reportados por McBain y colaboradores en ovocitos transfectados con canales NMDA y se realizaron curvas dosis respuesta variando la concentración de NMDA de 1 μM a 1000 μM para grupos de investigación con glicina: 0 μM, 0.3 μM, 1 μM y 30 μM. Las condiciones de voltaje de estímulo fueron de -60 mV y Mg2+ = 1 mM (McBain et al., 1989). El simulador reproduce las amplitudes de la corriente NMDA (nA) reportadas en McBain y colaboradores. La corriente NMDA registrada presenta una corriente pico que disminuye con el tiempo (segundos). Se considera un registro con dos electrodos en el ovocito en una cámara de superfusión, donde se alcanza rápidamente la concentración adecuada de los coagonistas (NMDA y glicina) cerca del canal.
Interfaz de usuario
La Figura 7 muestra la interfaz de usuario del simulador NMDA-glicina. Del lado derecho, se encuentran tres módulos: MOD1 para seleccionar la concentración de glicina (0 μM, 0.3 μM, 1 μM y 30 μM), MOD2 para seleccionar el color del trazo y MOD3 para seleccionar la concentración de NMDA. El osciloscopio A muestra los trazos de la corriente NMDA simulada.
Figura 7 Interfaz del simulador NMDAR-Glicina y simulación dosis-respuesta. MOD1: módulo para seleccionar la concentración de glicina; MOD2: selector de color de trazo; MOD3: ingreso de la concentración de NMDA. (A) Osciloscopio de registro de la corriente NMDA, muestra varios trazos de corriente NMDA de simulaciones en condiciones de voltaje de estímulo en -60 mV, Mg2+ = 1 mM, glicina = 1 μM. Se realizaron experimentos dosis-respuesta modificando la concentración de NMDA (μM): 10, 50, 100, 150, 200 y 1000. Se observa un incremento en la amplitud de la corriente conforme se incrementa la concentración de NMDA. A partir de 150 μM de NMDA, la corriente se incrementa cada vez menos, hasta llegar a un máximo.
Modo de uso
Simulación de la corriente NMDA con glicina 1 μM en ovocito
Como ejemplo, se realizaron un grupo de simulaciones para la construcción de una curva dosis-respuesta. Las condiciones fueron glicina de 1 μM, voltaje de estímulo -60 mV y 1 mM de Mg2+. Se activó el receptor NMDA con diferentes concentraciones de NMDA (10 μM, 50 μM, 100 μM, 150 μM, 200 μM, 1000 μM). La amplitud de la corriente NMDA aumenta conforme se incrementa la concentración de NMDA. A partir de 150 μM de NMDA, la amplitud de la corriente NMDA prácticamente se mantiene sin cambio (Figura 7). La curva dosis respuesta obtenida de los datos simulados se muestra en la Figura 8. La EC50 = 37.98 μM.
Fuente: Elaboración propia con base en McBain et al. (1989).
Figura 8 Curva dosis-respuesta en condiciones de glicina 1 μM. Se graficaron las amplitudes pico de las corrientes generadas en los experimentos anteriores (cuadros en negro) (Figura 7). La línea roja continua es el ajuste matemático (Boltzmann). El valor calculado para EC50 fue de 37.98 μM.
Simulación en ovocito de la corriente NMDA con glicina 30 M
Se realizaron otro grupo de simulaciones para la construcción de una curva dosis- respuesta a una concentración de glicina de 30 μM (Vh = -60 mV, Mg2+ = 1 mM). La concentración de NMDA se aumenta, y con cada dosis se registra una corriente. Por ejemplo, con NMDA 10 μM, 50 μM, 100 μM, 150 μM, 200 μM y 1000 μM se generan las corrientes NMDA mostradas en el osciloscopio (A) (Figura 9). Se puede observar que la amplitud de la corriente es mayor que las simuladas con una concentración de glicina de 1 μM. Cada corriente presenta una cinética semejante: Iniciado el estímulo con los coagonistas, se alcanza la corriente pico que disminuye su amplitud con el tiempo (segundos). La curva dosis-respuesta se muestra en la Figura 10. La EC50 = 33 μM. Se trata de una EC50 menor que la encontrada con 1 μM de glicina. Esto significa que a mayor concentración de glicina la acción del NMDA se ve aumentada, y la corriente NMDA generada alcanza mayor amplitud para las mismas concentraciones de NMDA.
Fuente: Elaboración propia con base en McBain et al. (1989).
Figura 9 Simulación dosis-respuesta. Las condiciones experimentales fueron: voltaje de estímulo en -60 mV, Mg2+ = 1 mM, glicina = 30 μM. Se realizaron experimentos dosis-respuesta modificando la concentración de NMDA: 10 μM, 50 μM, 100 μM, 150 μM, 200 μM y 1000 μM. Se observa que las amplitudes de las corrientes son mayores cuando se incrementa la glicina de 1 μM a 30 μM.
Fuente: Elaboración propia con base en McBain et al. (1989).
Figura 10 Curva dosis-respuesta en condiciones de glicina 30 μM. En cuadros negros se presentan los datos experimentales simulados. La línea roja continua es el ajuste matemático (Boltzmann). El valor calculado para EC50 fue de 33 μM.
Simulador NMDAR-Bloqueo Mg2+ en canal único
Interfaz de usuario
Trabajos tempranos fueron realizados para investigar el bloqueo del receptor NMDA por Mg2+ externo en canal único en neuronas de ratón (Nowak et al., 1984). Las condiciones experimentales fueron: glutamato = 10 μM y Mg2+ = 0 μM o 500 μM. Las amplitudes máximas de la corriente NMDA en condiciones de Mg2+ = 0 μM alcanzan alrededor de 20 pA. La concentración de glutamato fue de 1 μM. Se pueden realizar experimentos en dos condiciones de magnesio: Mg2+ = 500 μM y Mg2+ = 0 μM.
La ventana de interfaz del simulador cuenta con un osciloscopio para el registro de la corriente del canal único NMDA (Un recuadro verde en el eje Y de la corriente indica la amplitud de la corriente NMDA en cada estímulo de voltaje.) Del lado derecho, se encuentra un recuadro para las curvas corriente NMDA -vs- voltaje de estímulo. En la parte inferior se muestra un módulo para ingresar datos: (1) voltaje de estímulo y (2) concentración externa de Mg2+ (Figura 11). Con este simulador, el alumno puede realizar la curva corriente -vs- voltaje en condiciones sin bloqueo o con bloqueo por magnesio externo. En las simulaciones se observa que la amplitud de las corrientes es mucho menor, comparada con las corrientes macroscópicas de los experimentos descritos arriba. La curva I-V sigue una cinética lineal cuando el magnesio externo es 0. Los resultados son parecidos a los obtenidos por Kloda y colaboradores en canales NMDA (NR1a-NR2A) reconstituidos en liposomas (Kloda et al., 2007). La cinética de la dependencia de voltaje del bloqueo del canal NMDA es igual a la obtenida en corrientes macroscópicas.
Fuente: Elaboración propia.
Figura 11 Interfaz del simulador NMDAR-Bloqueo Mg2+ en canal único. (A) módulo de entrada de datos. (B) Osciloscopio para trazos de corriente NMDA en canal único. (C) Graficado de curvas I-V. Se corrieron dos grupos de simulaciones para la construcción de las curvas I-V en condiciones con Mg2+ = 0 μM. Curva I-V en puntos negros (lineal), y con Mg2+ = 500 μM. Curva I-V en puntos rojos (no lineal). En (B), se observa la apertura de dos canales NMDA (-3.2 pA) con un voltaje de estímulo de -50 mV y cero magnesio.
Discusión
El modelo matemático tipo Hodgkin y Huxley para el receptor NMDA se ha modificado para ser utilizado en diversos trabajos de investigación. Por conveniencia, los experimentos se realizan sin Mg2+ con la finalidad de reducir la ecuación 1. La función escalón y la función de conductancia con respecto al tiempo son sustituidas por la probabilidad de apertura del canal (Po). Esta probabilidad es determinada con un modelo multicompartamental donde cada compartimiento representa un estado del canal como: receptor, receptor unido al ligando, cerrado 1, cerrado 2, desensibilizado, abierto, etc. Estas adecuaciones transforman al modelo en un modelo cinético (ecuación 12).
Po es (Clements & Westbrook, 1991):
donde C0 es cerrado cero, C1 es cerrado uno, C2 es cerrado dos, D es desensibilizado y O es abierto.
El número de compartimientos depende de la pregunta a investigar. Para el estudio de la sensibilidad y saturación del glutamato en el receptor NMDA se realizaron experimentos dosis-respuesta (Chen et al., 2001). El modelaje de los resultados se realizó con un modelo cinético con cinco compartimientos (Clements & Westbrook, 1991). El valor experimental de referencia para ajustar las variables del modelo fue EC50 de la curva dosis-respuesta. En el caso de investigar la cinética de interacción glicina y glutamato con el receptor, se realizaron experimentos en canal único (Keller et al., 2017). Para la simulación, se utilizó un modelo cinético de 15 estados que describe cada paso de la interacción (Schorge et al., 2005). Singh y colaboradores estudiaron dos subtipos de receptores NMDA con modelos cinéticos de ocho compartimientos para un receptor diheteromérico y de nueve compartimientos para un receptor triheteromérico (Singh et al., 2011). A mayor número de compartimientos, se incrementan las ecuaciones que se tienen que resolver simultáneamente. Para su solución se emplean cadenas de Markov y se utilizan lenguajes de programación especializados. En los ejemplos citados, se utilizaron NEURON (lenguaje especializado para neurociencias), Systems Biology Markup Language (SBML) (lenguaje especializado para cadenas de Markov) y Smoldyn (lenguaje especializado para redes de reacción bioquímica), respectivamente. En cambio, los simuladores presentados en este trabajo están diseñados para ser ejecutables y que no requieran de ningún otro programa. El tiempo de aprendizaje de su uso es muy rápido comparado con el tiempo de capacitación necesario para dominar un lenguaje especializado. Estos simuladores utilizan un modelo matemático básico que incluye el bloqueo por Mg2+ dependiente de voltaje y tienen como referencia la corriente pico NMDA experimentales para ajustar los valores de las variables correspondientes. Están pensados para ser utilizado en una sala de cómputo o a distancia durante la clase. Como limitaciones, se puede decir que solamente abarca los casos experimentales referidos.
Existen diferentes razones que motivan el desarrollo de software para la enseñanza de la electrofisiología. En primer lugar, se encuentran las características propias de la fisiología y la biofísica. La mayoría de las investigaciones efectuadas en estos campos son fuertemente cuantitativas. La medida de variables de estudio y su relación con otras propicia el surgimiento de teorías que al final llevan al planteamiento de un modelo matemático (Gavaghan et al., 2006; Hodgkin & Huxley, 1952). En ciertas condiciones, la solución de estos modelos reproducen los datos experimentales (Pérez-Bonilla et al., 2020); en otros casos, se pueden calcular valores de variables que no pueden ser medidas directamente. En segundo lugar, están los altos costos que implica la implementación de prácticas de laboratorio reales para la enseñanza de la fisiología y la biofísica: aparatos especializados, reactivos y drogas muy costosas (Diwakar et al., 2014). En tercer lugar, se encuentra el uso indiscriminado de animales de experimentación para la enseñanza (Doke & Dhawale, 2015). Una alternativa es implementar simuladores computacionales para sustituir las prácticas de laboratorio reales (Badyal et al., 2009). La utilización de modelos matemáticos ayuda a integrar los conocimientos sobre un tema en específico. Permite probar ideas sin la necesidad de utilizar modelos experimentales animales. En internet no existe un simulador del receptor NMDA con fines de enseñanza-aprendizaje. En este trabajo se diseñó y desarrolló un software educativo e interactivo de las funciones electrofisiológicas básicas del receptor NMDA. El simulador NMDAR-Glicina permite estudiar la interacción de NMDA y glicina con el receptor NMDA. El alumno descubre la existencia de una interacción entre el receptor NMDA con la glicina y el NMDA y observa cómo se afecta la respuesta del receptor NMDA a diferentes concentraciones. Los simuladores presentados en este trabajo permiten la reproducción de los aspectos electrofisiológicos básicos del receptor NMDA e introduce al alumno al tema mediante un aprendizaje activo.
Desde los años ochenta a la fecha, la investigación del receptor NMDA ha sido continua y profunda. Actualmente, se conoce mejor la estructura molecular del receptor canal NMDA y las afinidades del neurotrasmisor (glutamato y NMDA) y del co-activador (glicina) (Chou et al., 2020). Se ha encontrado afinidad de otras moléculas al sitio de la glicina (Islas et al., 2022). Existe una relación entre el tipo de subunidad y la sensibilidad al Mg2+ (Cull-Candy et al., 2001). La disminución de la sensibilidad al Mg2+ está implicada en alteraciones neuronales (André et al., 2004). Se tiene establecido que la desensibilización del canal se debe al Ca2+ intracelular (Sibarov & Antonov, 2018). Se sabe que el receptor NMDA participa en diferentes alteraciones como el dolor (Martínez-Visbal et al., 2020) y el Alzheimer (Zhang et al., 2016), entre otras (Arundine & Tymianski, 2004). Como perspectivas del trabajo está pendiente la conclusión de un simulador que aborde la desensibilización por Ca2+. El software se utiliza en la sala de cómputo durante el curso de biofísica. El programa de cómputo ejecutable se comparte solicitándolo al correo del autor de correspondencia para ser utilizado sin fines de lucro (no subministrar a terceros) y dando crédito a sus autores.
Conclusiones
El programa de cómputo interactivo presentado posibilita un aprendizaje activo de la electrofisiología del receptor canal NMDA. Está formado de tres simuladores. (1) El simulador NMDAR-Bloqueo Mg2+ permite explorar el bloqueo del Mg2+ sobre el poro del receptor NMDA y su dependencia con su concentración y con el voltaje. Con los datos generados, se construye la curva corriente -vs- voltaje y se analiza su cinética con y sin magnesio. Este simulador es capaz de reproducir las corrientes macroscópicas NMDA y de generar la cinética de las curvas I-V de experimentos efectuados en neuronas. (2) El simulador NMDAR-glicina permite implementar experimentos dosis-respuesta en ovocitos transfectados con receptores NMDA. Este simulador reproduce las amplitudes de los experimentos de McBain y colaboradores. Se puede explorar la activación del receptor NMDA con diferentes concentraciones de NMDA y glicina. Con los datos generados en los experimentos virtuales es posible construir curvas dosis-respuesta y realizar su análisis. (3) El simulador de canal único permite analizar de bloqueo del receptor NMDA por magnesio y su dependencia con voltaje en canal único. El programa cuenta con un leccionario para introducción al tema. El software se probó en ambiente Windows desde Windows 7 hasta Windows 11 en una PC con recursos mínimos: Windows®, espacio en disco de 50 MB, se visualiza mejor en una resolución de pantalla de 1366 X 768p. Este software educativo debe considerarse una herramienta didáctica y no sustituye al profesor.
