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INTRODUCCIÓN
El desarrollo de biomateriales para regeneración de tejidos es una disciplina relativamente nueva que ha permitido resolver problemas asociados a la perdida de tejidos y deficiencia de órganos. En los últimos años, los nanocompuestos de polímeros y nanopartículas metálicas han sido ampliamente estudiados, debido a que la incorporación de cargas nanométricas representa un incremento significativo en sus propiedades físicoquímicas, que pueden ser aprovechadas en diferentes áreas, principalmente en el área biomédica.
Uno de los biopolímeros de mayor interés en el área de ingeniería de tejidos es el quitosano (QS), el cual se define como un polisacárido lineal formado predominantemente por unidades de glucosamina, que se obtiene a partir del proceso de desacetilación de la quitina [1]. El QS posee propiedades de biocompatibilidad y biodegradabilidad, no es tóxico [2] e incluso se ha demostrado que presenta propiedades antimicrobianas al contacto con patógenos, tales como bacterias y hongos [3], [4]. De acuerdo a lo anterior, el QS puede ser considerado como un material prometedor para una amplia variedad de aplicaciones biomédicas, como material para medicina regenerativa e ingeniería de tejidos, sustitutos de piel, hueso, cartílago, hígado, nervios y vasos sanguíneos, entre otros [5].
A pesar de que se ha reportado que el QS por si solo presenta actividad antimicrobiana, esta capacidad puede ser potencializada al incorporar cargas nanométricas específicas. Se ha reportado que existen diversos tipos de nanopartículas metálicas con características antimicrobianas, dentro de las cuales destacan plata [6], oro [7], cobre [8], zinc [9] y dióxido de titanio [10] entre otras. Recientemente, se ha despertado el interés científico e industrial por el estudio de nanopartículas de cobre (nCu), debido a que poseen propiedades antimicrobianas y fisicoquímicas similares a las nanopartículas de plata, con la diferencia de que su costo de producción es mucho menor [11].
De acuerdo a lo anterior, es posible que al formular nanocompositos quitosano/nanopartículas de cobre (QS/nCu) se puedan incrementar sus propiedades físico-químicas y antibacterianas, manteniendo la biocompatibilidad del biopolímero. En estudios preliminares, se han desarrollado diferentes nanocompositos con quitosano y nanoparticulas metálicas, que han sido aplicados para la regeneración en lesiones térmicas en un modelo animal [12], por lo cual el material presentado es un candidato efectivo para aplicaciones en ingeniería tisular.
En el presente trabajo se reporta la preparación de nanocompositos basados en quitosano-nanopartículas de cobre (QS/nCu) mediante mezclado en solución asistido con ultrasonido a diferentes concentraciones, con el objetivo de obtener un nanocomposito con alta actividad antibacteriana y con aplicación potencial en el área biomédica e ingeniería de tejidos.
METODOLOGÍA
Se utilizó QS proveniente de Sigma Aldrich con un peso molecular medio y un grado de desacetilación del 75 - 85%. La solución de QS fue preparada disolviendo 1 gr del biopolímero en 99 mL de solución de ácido acético al 1 % v/v, dejándose en agitación durante 4 h a temperatura ambiente. Posteriormente, se retiró la fracción no soluble del biopolímero mediante centrifugación. Como carga nanométrica se emplearon nanopartículas de cobre (nCu) sintetizadas mediante el método de descomposición térmica descrito por Betancourt y col. [13], con un diámetro promedio de entre 4 y 18 nm y morfología esférica. Para la evaluación antibacteriana, se utilizó como modelo la bacteria Gram positiva Staphylococcus aureus ATCC #6538, empleando como medio de cultivo para su crecimiento LB (Luria Bertani) proveniente de BD-BIOXON.
Preparación de nanocompositos QS/nCu
Para la preparación de los nanocompositos QS/nCu, se preparó una solución madre de nCu al 10 % p/v, la cual fue mezclada en 25 mL de la solución de QS y se dispersó con un equipo de ultrasonido de frecuencia fija marca Branson en un baño de hielo durante 6 minutos, con una amplitud del 60 %. Se prepararon tres concentraciones de nCu: 0.01, 0.57 y 5.30 % p/v. Las concentraciones de nanocompositos Qs/nCu fueron establecidas a partir de resultados previos obtenidos en trabajos anteriores [12]. Cada nanocomposito fue vertido en cajas Petri de 10 cm con un volumen promedio de 20 mL colocándose en estufa a 60 °C durante 8 horas para la obtención de películas, con un espesor promedio de 100 µm.
Caracterización de nanocompositos Qs/nCu
Para evaluar las propiedades químicas de las películas de QS/nCu, se llevó a cabo el análisis mediante la técnica de espectroscopia infrarroja (FTIR) empleando un equipo marca Perkin Elmer, a partir de reflectancia total atenuada (ATR), con una punta de diamante, escaneo de 24 barridos y una resolución de 4 cm -1 . Para determinar la presencia de nanopartículas/iones Cu2+ en las soluciones de Qs/nCu, se llevó a cabo el análisis mediante la técnica de espectroscopia UV Visible (UV-Vis) con un equipo marca Agilent 8453 empleando un barrido de 250 a 800 nm. Con el propósito de determinar las propiedades de superficie de los nanocompositos se realizaron mediciones mediante la técnica de microscopía de fuerza atómica (AFM) con un equipo NT MDT NTEGRA Prima, a partir de una punta de nitruro de silicio en modo contacto y no contacto.
Actividad antibacteriana de nanocompositos QS/nCu
Para determinar la actividad antimicrobiana de los nanocompositos QS/nCu, se cortaron películas circulares con un diámetro de 2 cm y se realizó la neutralización-hidratación de las películas con una solución de NaOH 0.1 M y agua des-ionizada, mediante tres ciclos de lavado. Las películas fueron colocadas al centro de una caja Petri de 10 cm, colocando papel filtro húmedo estéril con el objetivo de simular una cámara húmeda. En la superficie de cada película, se colocaron 25 µm de una suspensión de bacterias S. aureus de 16 horas de crecimiento, a una concentración de 1x106 UFC/mL. Como control se colocó una película de QS sin nanopartículas. Posteriormente, se colocó un cubreobjetos sobre la superficie de cada película a fin de evitar la evaporación de la suspensión de bacterias. Los nanocompositos en sus diferentes concentraciones fueron incubados a 37 °C a diferentes tiempos (10, 90, 180 y 360 min). Posteriormente, cada película fue lavada con 10 mL de una solución buffer de fosfatos (PBS) estéril, agitando durante un minuto a 100 rpm. Finalmente, se tomaron alícuotas de 100 µL de la suspensión de lavado y se colocaron en una caja Petri con Agar LB, incubando a 37 °C durante 14 h.
El cálculo de actividad antibacteriana se efectuó a partir de la diferencia en el crecimiento de colonias que sobrevivieron a la interacción con las películas de QS/nCu (C) al ser comparados con las colonias de bacterias que crecieron en el control sin carga nanométrica (Co). El cálculo se realizó de acuerdo a la siguiente ecuación:
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Análisis mediante FTIR de nanocompositos QS/nCu
En la Figura 1 se presentan los espectros de FTIR obtenidos para el QS y los nanocompositos QS/nCu en sus diferentes concentraciones. Se puede observar las vibraciones características de la molécula del QS, localizadas alrededor de 1000 cm -1 , asociadas al enlace C-O-C del anillo glucopiranosa, además de la señal localizada alrededor de 1300 cm -1 , que corresponde a la vibración del C-N del grupo acetamido; la señal localizada alrededor de 1600 cm -1 que corresponde a la vibración del enlace C-N de la amida I, mientras que la señal localizada alrededor de 3400 cm -1 corresponde a la vibración de los enlaces OH/NH de la cadena principal del QS. Se puede apreciar que la presencia de nCu en la matriz de QS produce una disminución en la intensidad de la señal asociada a las vibraciones de los grupos hidroxilo y amino (OH/NH) de la cadena polimérica, la cual es proporcional a la concentración de nanopartículas. Lo anterior sugiere que las nCu y los iones Cu2+ liberados durante el mezclado en solución pueden interactuar con los grupos HO/NH de la cadena del QS, favoreciendo la formación de quelatos, lo cual coincide con lo reportado por diversos autores [12,14-15], tal como se representa en la Figura 2.
Análisis mediante UV-Vis de nanocompositos QS/nCu
En la Figura 3 se presentan los espectros UV-Vis de los nanocompositos QS/nCu en diferentes concentraciones y su comparación con el QS. Se puede observar que el QS no presenta absorción en la región de análisis (300-800 nm). En el caso de los nanocompositos QS/nCu, conforme se incrementa la concentración de nCu, se incrementa la intensidad de las señales localizadas alrededor de 370 nm, asociada a la presencia de iones Cu2+, además de la señal localizada entre 600-700 nm, la cual corresponde a la oscilación colectiva de electrones (surface plasmon resonance, SPR) característica de las nCu. Lo anterior indica que la presencia de nCu y su preparación mediante mezclado asistido con ultrasonido pueden producir la liberación de iones Cu2+, lo que sugiere la presencia combinada de nanopartículas/iones en el nanocomposito en solución [15].
Actividad antibacteriana de nanocompositos QS/nCu
Con el objetivo de elucidar las propiedades de superficie de la película de QS y el efecto de la hidratación de la misma, se llevaron a cabo análisis de AFM sobre el biopolímero antes y después de su hidratación. Además, se efectuó el análisis de bacterias colocadas en el QS hidratado y su comportamiento al contacto con el nanocomposito QS/nCu, tal como se observa en la Figura 4. En la Figura 4a se presenta la imagen 2D de la película de QS seco, en donde se aprecia la presencia de una superficie con una rugosidad promedio de 46.4952 nm, además de algunos agregados, producto de la fracción no soluble del QS durante su preparación en película.
Figura 4 Imágenes 2D obtenidas mediante AFM de películas de QS y QS/nCu. (a) QS seco. (b) QS hidratado. (c) bacteria S. aureus depositada en superficie de QS y (d) QS/nCu 5.3% p/v.
Al hidratar la película de QS (Figura 4b) se puede observar la formación de una malla con microporos con morfología irregular, con un diámetro promedio de 10 µm, además de un incremento en la rugosidad del biopolímero (82.0396 nm). Este comportamiento sugiere que la hidratación del biopolímero y de los nanocompositos QS/nCu pueden favorecer la formación de una malla que permita la posible penetración de bacterias dentro del material. En la Figura 4c se presenta la imagen de bacterias S. aureus depositadas en la superficie de una película de QS, en donde se aprecia una morfología bacteriana característica de S. aureus, con un diámetro promedio de 1.5 µm. El tamaño de las bacterias promueve su penetración a través de la malla del nanocomposito hidratado, incrementando su interacción con las nCu embebidas en el biopolímero. Finalmente, en la Figura 4d se presenta la imagen 2D del nanocomposito QS/nCu en concentración de 5.3 % p/v, en donde se observa la presencia de diversos aglomerados de nCu localizados en los primeros 100 nm de la superficie del biopolímero. Los resultados obtenidos sugieren que la hidratación del nanocomposito QS/nCu es crucial para la penetración de las bacterias y su posible interacción con las nCu soportadas en el material.
Actividad antibacteriana de nanocompositos QS/nCu
En la Figura 5 se presenta la actividad antibacteriana de los nanocompositos QS/nCu y su comparación con el biopolímero sin carga, contra la bacteria S. aureus. Cabe señalar que el QS por sí solo no presenta actividad antibacteriana, posiblemente asociada con la neutralización previa del material. Se puede observar que a los 10 min de interacción de las bacterias con los nanocompositos, la actividad antibacteriana es dependiente de la concentración de nCu en el biopolímero. A partir de los 90-180 min de interacción se inhibe por completo el crecimiento de las bacterias en contacto con el material en todas las concentraciones de QS/nCu analizadas. De acuerdo con los resultados obtenidos, los nanocompositos QS/nCu presentan alta eficacia bactericida al contacto con S. aureus, uno de los principales patógenos causantes de infecciones nosocomiales; por lo que los nanocompositos Qs/nCu pueden ser candidatos efectivos para su uso en el área biomédica, enfocados al diseño de dispositivos aplicados en ingeniería de tejidos.
CONCLUSIONES
El presente trabajo describe la preparación de nanocompositos QS/nCu en diferentes concentraciones, en donde se evaluaron sus características físico-químicas y antibacterianas en comparación con el biopolímero sin carga. Se determinó que los nanocompositos presentan alta eficacia bactericida al contacto con la bacteria S. aureus, en un tiempo promedio entre 90 y 180 min. Nuestros resultados sugieren que el material obtenido presenta las propiedades biológicas y funcionales del QS, así como las propiedades antimicrobianas de las nCu, por lo que los nanocompositos QS/nCu presentan una excelente alternativa como biomaterial para su posible aplicación en ingeniería de tejidos.
