ANTECEDENTES

La pérdida gestacional recurrente afecta al 1.9% de las parejas de todo el mundo.¹ Diferentes organizaciones definieron a la pérdida gestacional recurrente como la coexistencia de tres o más pérdidas del embarazo. Algunos de los consensos más recientes modificaron esta definición a dos o más pérdidas del embarazo antes de las 20 o 24 semanas, independientemente de que sean consecutivas o no.^2,3

Se trata de un problema complejo debido a muy diversas causas: anomalías genéticas, alteraciones anatómicas, endocrinas, infecciosas, trastornos de la coagulación, factores psicológicos, ambientales o inmunológicos.⁴

El embarazo es un estado particular de salud debido al proceso de inmunosupresión necesario para evitar el rechazo histológico del feto y promover que no genere reacciones adversas a lo largo de la gestación.^5,6 Desde el inicio de ésta, las alteraciones en la respuesta inmunitaria pueden afectar de manera importante la implantación, invasión trofoblástica y la supervivencia del feto al ataque de células NK o macrófagos. Esta actividad es regulada, entre otros factores, por el nivel de expresión del factor de necrosis tumoral alfa.⁶

Diversas evidencias experimentales han demostrado que los polimorfismos de nucleótido simple (SNP) -857C/T (rs1799724), -376G/A (rs1800750), -308G/A (rs1800629) y -238G/A (rs361525) del factor de necrosis tumoral alfa afectan sus concentraciones en suero y se relacionan con la pérdida recurrente del embarazo.^6,7 Los más estudiados son los polimorfismos de transición G/A en la posición -308 y -238 de la región promotora, G-308A (rs1800629) y G-238A (rs361525). La asociación de los polimorfismos del gen TNF-α con la pérdida gestacional recurrente se ha estudiado en diversas poblaciones, aunque con desenlaces contradictorios. Hace poco, Hui y colaboradores, en un metanálisis, concluyeron que el polimorfismo del gen TNF-α G-308A (rs1800629) se asocia con la susceptibilidad a la pérdida gestacional recurrente.⁸ Sin embargo, en México, Quintero-Ramos y colaboradores reportaron que no hay asociación entre el polimorfismo G-308A (rs1800629) y el aborto habitual.⁹

Con base en las observaciones previas se planteó el objetivo de determinar si existe asociación entre los polimorfismos G-308A (rs1800629) y G-238A (rs361525) del promotor del factor de necrosis tumoral alfa y la pérdida gestacional recurrente en pacientes atendidas en el Hospital de la Mujer de Aguascalientes, en la región centro de México.

MATERIALES Y MÉTODOS

Estudio observacional, transversal, descriptivo de casos y controles llevado a cabo entre enero de 2020 y diciembre de 2021 en el Hospital de la Mujer de Aguascalientes y en el Laboratorio de Virología e Ingeniería Genética de la Universidad Autónoma de Aguascalientes. Se estudiaron pacientes con pérdidas gestacionales recurrentes y 150 mujeres con embarazo normal y sin antecedente de pérdidas gestacionales (controles).

Variables de estudio: edad de la madre, embarazos, abortos, semanas de gestación al momento de la toma de muestra sanguínea, antecedentes familiares de trombosis, insuficiencia venosa, diabetes, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad endocrina, genotipo G-308A (rs1800629) del promotor del gen TNF-α, y genotipo G-238A (rs361525) del promotor del gen TNF-α.

Criterios de inclusión: pacientes mayores de 18 años, con antecedente de dos o más pérdidas gestacionales espontáneas antes de las 24 semanas, con descarte de alguna causa anatómica corroborada por ultrasonido, síndrome antifosfolipídico, trombofilia hereditaria (factor V Leyden, protrombina G20210A, metilentetrahidrofolato reductasa C677T, inhibidor del activador del plasminógeno-1 4G/5G) o infecciosa (Chlamydia trachomatis, toxoplasma, rubéola, citomegalovirus y herpes simple) y que acudieron al servicio de Ginecología del hospital. Criterios de exclusión: pacientes con diagnóstico de amenaza de aborto o aborto séptico. Controles: pacientes mayores de 16 años, con embarazo en curso normal, antecedente de dos o más hijos sanos, sin abortos o pérdidas fetales, preeclampsia, desprendimiento de placenta, retraso del crecimiento uterino, sin enfermedad autoinmunitaria, sin antecedente de infertilidad y atendidas en el hospital sede del estudio. Se consideró pérdida gestacional recurrente primaria cuando los embarazos previos terminaron en aborto espontáneo y secundaria cuando al menos uno de los embarazos resultó en un nacido vivo o evolucionó a más de las 24 semanas de gestación, según lo descrito por Mateo-Sánez y colaboradores.⁴

Previa autorización del Comité de Ética e Investigación del Hospital de la Mujer se recabó la firma del consentimiento informado de los casos y de las pacientes control. Se tomó una muestra de 3 mL de sangre en tubos con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) para los casos y controles embarazadas y se mantuvieron en refrigeración a 4 °C hasta la práctica de las pruebas moleculares.

Se extrajo y purificó el ADN a partir de las muestras obtenidas. Para el análisis de los polimorfismos se aplicó la técnica de reacción en cadena de la polimerasa de los fragmentos de restricción de longitud polimórfica (PCR-RFLP). Para la amplificación de los fragmentos mediante reacción en cadena de la polimerasa se utilizaron entre 100 y 150 ng de ADN purificado, con el siguiente programa de reacción: una desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, un alineamiento a una temperatura de 64 °C para G-308A (rs1800629) y de 62 °C para G-238A (rs361525) durante 45 segundos, y una extensión a 72 °C por 45 segundos. Al final se incluyó una extensión a 72 °C durante 5 minutos. Luego de la electroforesis en gel de agarosa al 1.5%, el resultado positivo de la PCR fue de una banda de 107 pares de bases para TNF-α G-308A (rs1800629), y de 152 pares de bases para TNF-α G-238A (rs361525). La genotipificación se llevó a cabo con 10 U de enzima NcoI para TNF-α G-308A (rs1800629) y HpaII para TNF-α G-238A (rs361525) con 1 μg de producto de PCR, y digerido a 37 °C durante 4 horas. Al final, el genotipo se determinó mediante la visualización de bandas mediante electroforesis en gel de agarosa al 2.5% conforme a lo indicado en el Cuadro 1.

Análisis estadístico

Para el análisis de los datos se utilizó el programa SPSS (Statistical Software versión 23, IBM Corp., Armonk, NY, USA). Los resultados de las variables cuantitativas se reportan en medias, medianas y desviaciones estándar y las cualitativas en porcentajes del total.

Las prevalencias de cada polimorfismo, por separado en cada grupo de estudio y en la población final, se presentan en frecuencias genotípicas y alélicas, con determinación de posibles desviaciones del equilibrio de Hardy-Weinberg mediante una prueba de c² de bondad de ajuste. Para determinar una posible asociación de los genotipos obtenidos y las pérdidas gestacionales recurrentes, se calcularon las razones de momios y los respectivos intervalos de confianza al 95% de cada genotipo y alelo mutado mediante regresión logística binaria u ordinal, con el ajuste necesario de las variables de interferencia. Para los casos se hizo un análisis de regresión logística multivariado para evaluar los factores de forma independiente con la pérdida gestacional recurrente y los polimorfismos de TNF-α estudiados. Para todas las comparaciones se tomó un nivel de significación de 0.05 bilateral, como valor crítico en la regla de decisión.

RESULTADOS

Se estudiaron 300 pacientes: 150 con pérdida gestacional recurrente y 150 con embarazo normal (controles). El análisis de las variables clínicas se muestra en el Cuadro 2. Se encontraron 19 pacientes (12.6%) con pérdida gestacional recurrente primaria y 131 (87.4%) con pérdida gestacional recurrente secundaria. Las pacientes con pérdida gestacional recurrente tuvieron, significativamente, mayor edad (28 ± 6.43 en comparación con 26 ± 6.07 años; p = 0.006), más abortos (mediana de 2 en comparación con 0; p = 0.049) y menos semanas de gestación (13.18 ± 12.51 en compoaración con 34.55 ± 10.99; p = 0.0001) que las pacientes del grupo control. Nueve (6%) de las pacientes con pérdida gestacional recurrente tuvieron antecedente de enfermedad endocrina (7 con hipotiroidismo y el resto con alteraciones en el metabolismo de la glucosa). Las 6 pacientes con embarazos normales tenían una enfermedad endocrina (4 hipotiroidismo y 2 alteraciones en el metabolismo de la glucosa; 6 en comparación con 4%; p = 0.629). En el resto de las variables clínicas tampoco se encontraron diferencias significativas entre ambos grupos.

Se genotipificaron las 300 muestras recolectadas para ambos polimorfismos del gen TNF-α. En las Figuras 1y2 se exponen los reportes de las electroforesis de los fragmentos digeridos y genotipificados conforme al patrón de restricción; como control de la restricción se utilizó el fragmento obtenido por reacción en cadena de la polimerasa sin digerir.

Figura 1 Separación electroforética de los amplicones de PCR y su digestión con NcoI para el polimorfismo G-308A del gen TNF. Cada resultado posible de genotipificación se muestra por triplicado. Panel A: carriles 1-3, control PCR; carril M, marcador de peso molecular 100 a 1000 pares de base; carriles 4-6, genotipo GG (silvestre). Panel B: carriles 1-3, genotipo GA (heterocigoto); carril M, marcador de peso molecular 100 a 1000 pares de base; carriles 4-6, genotipo AA (homocigoto mutado). 

Figura 2 Separación electroforética de los amplicones de PCR y su digestión con la enzima HpaII para el polimorfismo G-238A del gen TNF. Cada resultado posible de genotipificación se muestra por triplicado. Panel A: carriles 1-3, control PCR (heterocigoto); carril 4, marcador de peso molecular 100 a 1000 pares de base; carriles 5-7 genotipo AA (homocigoto mutado). Panel B: carriles 1-3, genotipo GA (heterocigoto); carril 4, marcador de peso molecular 100 a 1000 pares de base; carriles 5-7, genotipo GG (silvestre). 

En los Cuadros 3y4 se encuentran los resultados de la genotipificación de algunas de las pacientes separadas por grupo de estudio y genotipo encontrado. El cálculo de las frecuencias alélicas se realizó a partir de las frecuencias genotípicas. Se consideró que cada individuo homocigoto aporta dos alelos del mismo tipo respectivo, y cada paciente heterocigota contribuye con solo uno de cada alelo. Además, cada cuadro incluye el resultado del análisis del equilibrio de Hardy-Weinberg para cada polimorfismo. Se tomaron como referencia las frecuencias genotípicas esperadas del grupo control y se contrastaron con la población total.

Para el polimorfismo G-308A (rs1800629) (Cuadro 3) se encontró que la prevalencia del alelo mutado (A) en pacientes con pérdida gestacional recurrente fue de 9.3% contra 5.7% de las pacientes con embarazos normales (p = 0.088). En las pacientes del grupo control solo una tuvo genotipo homocigoto mutado AA (0.7%) en comparación con 6 del grupo de pacientes con pérdida gestacional recurrente (4.0%; p = 0.127). En la comparación entre genotipos y alelos no hubo diferencias significativas y el polimorfismo se encontró en equilibrio de Hardy-Weinberg para su distribución genotípica (p = 0.627).

En relación con el polimorfismo G-238A (rs361525) (Cuadro 4) se encontraron 5 alelos mutados (A) en el grupo de mujeres con embarazos normales (1.7%) y 20 en el grupo de pérdida gestacional recurrente (6.7%; p = 0.004). En el grupo de mujeres con embarazos normales solo se encontró una paciente con genotipo homocigoto mutado (0.7%) y 4 en el de pacientes con pérdida gestacional recurrente (2.7%). A diferencia del polimorfismo G-308A (rs1800629) la proporción de heterocigotos entre las pacientes con pérdida gestacional recurrente fue cuatro veces mayor que las del grupo control (8.0 en comparación con 2.0%). En este polimorfismo sí se encontraron diferencias significativas en el análisis por genotipos y en el de los alelos (p = 0.021 y 0.004, respectivamente); además, el polimorfismo se encontró fuera del equilibrio de Hardy-Weinberg en esta población particular (p < 0.001).

Con las distribuciones genotípicas y alélicas se calcularon las razones de momios (RM) de probabilidad de riesgo de pérdida gestacional recurrente. Se siguieron cuatro diferentes modelos genéticos: genotípico (homocigoto y heterocigoto), dominante y recesivo (para cada polimorfismo por separado). Según este análisis, se encontró que para ninguno de los cuatro modelos genéticos, el polimorfismo G-308A (rs1800629) tuvo una correlación significativa de probabilidad de riesgo de pérdida gestacional recurrente (la prueba de hipótesis en todos los casos fue bilateral. Además, los intervalos de confianza en todas las situaciones cruzaron el valor de 1) (Cuadros 5,6y7). La situación es diferente para G-238A (rs361525) en donde 2 escenarios de los 4 posibles arrojaron un valor de RM significativo. Esto se traduce en una probabilidad mayor de riesgo: el genotipo GA en el modelo genotípico heterocigoto (RM 4.36; IC95%: 1.2-15.78; p = 0.012), y el conjunto GA + AA en el modelo dominante (RM 4.36; IC95%: 1.42-13.36; p = 0.005). Para los dos casos, el valor de la RM obtenido fue similar, y en todos los casos el nivel de significación fue menor al crítico.

En las pacientes con pérdida gestacional recurrente se estudiaron las diferentes variables clínicas respecto de la pérdida gestacional recurrente primaria o secundaria y se encontró una diferencia significativa solo en el antecedente de enfermedad autoinmunitaria (10.52% en pérdida gestacional recurrente primaria vs 0.76% en pérdida gestacional recurrente secundaria, p = 0.005) y en el antecedente heredofamiliar de diabetes mellitus (18.9% en pérdida gestacional recurrente primaria en comparación con 42.74% en la variedad secundaria). Ninguno de los polimorfismos estudiados fue significativo para pérdida gestacional recurrente primaria en comparación con la secundaria.

Además, se hizo un análisis multivariado de los polimorfismos de TNF-a estudiados en las pacientes con pérdida gestacional recurrente y los diferentes factores considerados en el estudio. En el Cuadro 7 puede observarse que ninguno de los factores considerados fue estadísticamente significativo.

DISCUSIÓN

Para clarificar si existe una posible asociación entre los polimorfismos del promotor del gen TNF-α, G-308A (rs1800629) y G-238A (rs36525) con las pérdidas gestacionales recurrentes en la población estudiada, se comparó la prevalencia de los polimorfismos entre pacientes con antecedente de pérdida gestacional recurrente con un grupo control de pacientes sin ese antecedente y embarazos normales. La prevalencia encontrada del alelo mutado (A) en las pacientes con pérdida gestacional recurrente (9.53%) para el polimorfismo G308A (rs1800629) estuvo en el rango referido en una revisión reciente de Alonso-Barragán y colaboradores¹⁰ quienes lo reportan entre 4.1 y 22.5% en poblaciones de diferentes países. Resultó mayor que la reportada previamente por Quintero-Ramos y su grupo⁹ y menor que la de Sudhir en población de la India (34%).¹¹

La prevalencia del alelo mutado (A) para el polimorfismo G238A (rs36525) encontrada en pacientes con pérdida gestacional recurrente (6.7%) del estudio aquí publicado se ubica en el rango comunicado por Alonso-Barragán y coautores de entre 2 y 23.7%.¹⁰

En investigaciones originales, en revisiones y metanálisis se reportan resultados discutibles respecto de la asociación o no entre los polimorfismos de TNF-a aquí estudiados y la pérdida gestacional recurrente.

Tanto Stavros y colaboradores en población griega,¹² Ma y su grupo en población china,¹³ Palmirotta y coautores en mujeres italianas¹⁴ y Quintero-Ramos y su equipo⁹ como los autores de este artículo no encontramos una asociación entre el polimorfismo G-308A (rs1800629) y la pérdida gestacional recurrente, a pesar de haberlo estudiado con diferentes modelos genéticos.

A diferencia de nosotros, otros autores sí han encontrado asociación entre el polimorfismo G308A (rs1800629) y la pérdida gestacional recurrente en poblaciones de la India, Brasil y Polonia.^11,15,16

Por lo que se refiere al polimorfismo G-238A (rs36525) nosotros, al igual que Aboutorabi y su grupo, en población iraní¹⁷ y Zammiti y colaboradores en mujeres tunecinas,¹⁸ sí encontramos una asociación entre este polimorfismo y la pérdida gestacional recurrente. En cambio, Kim y coautores y otros autores reportan que este polimorfismo no tiene asociación con la pérdida gestacional recurrente en población coreana, griega e italiana.^12,19,20,21

En un metanálisis de Dong y colaboradores,¹⁹ en relación con el polimorfismo G-308A (rs1800629), que se estratificó entre poblaciones caucásica y asiática concluyeron que, si bien no existía una relación global entre G-308A (rs1800629) y la pérdida gestacional recurrente al momento de llevar a cabo la estratificación por grupo étnico, sí encontraron una asociación en la población asiática, pero no en la caucásica. Este estudio arrojó parte de la evidencia inicial de que la relación de los polimorfismos de TNF-α con el aborto de repetición podría estar influida por el grupo étnico, ¹⁹ lo que explicaría, en parte, que en un grupo tan heterogéneo como la población mexicana esas correlaciones no sean tan fáciles de encontrar debido al mestizaje.

El estudio de Li y su grupo se centró en el polimorfismo G-308A (rs1800629), exclusivamente referido a poblaciones asiáticas. ²⁰ Ese metanálisis tuvo la particularidad de llevar a cabo, además, un estudio de riesgo, con análisis de cuatro modelos genéticos de manera independiente: genotípico, dominante, recesivo y aditivo. Además de encontrar evidencia de una probable asociación global entre G-308A (rs1800629) y el aborto de repetición, este metanálisis confirmó que la elección del modelo genético es decisiva para interpretar los resultados de un estudio similar, incluso observacional. ²⁰ Esto se confirmó en un metanálisis más reciente, donde además de los polimorfismos G-308A (rs1800629) y G-238A (rs36525) se consideraron otros. Los autores del metanálisis concluyeron que G-308A (rs1800629) podría estar asociado con la pérdida gestacional recurrente, incluso en poblaciones no asiáticas, mientras que G-238A (rs36525) se encontraría más limitado a tener influencia en poblaciones asiáticas y vecinas. ²¹

En el estudio aquí publicado se encontró que si bien G-308A (rs1800629) no incrementó la probabilidad de riesgo en las pacientes con pérdida gestacional recurrente, el G-238A (rs361525) sí aumenta el riesgo y bajo dos modelos genéticos diferentes donde los resultados que tienen significación estadística denotan, en común, la existencia de un solo alelo mutado (GA del genotípico heterocigoto, GG+GA del dominante), mientras que el genotipo homocigoto mutado no tiene mayor probabilidad de riesgo por sí mismo; hallazgo similar al reportado por Liu C y colaboradores en población china. ²² Se deduce, entonces, que el alelo A en la posición -238 (rs361525) del gen TNF-α podría tener correlación con una mayor probabilidad de pérdida gestacional recurrente. La existencia de un segundo alelo mutado en el otro autosoma no incrementa más esa probabilidad, al menos desde el punto de vista observacional.

Al estratificar a las pacientes en pérdida gestacional recurrente primaria y secundaria se encontró que el antecedente heredofamiliar de diabetes mellitus es significativamente mayor entre las pacientes con pérdida gestacional recurrente secundaria, que en las pacientes con la variedad primaria. Si bien no se encontró una diferencia significativa entre el total de pacientes con pérdida gestacional recurrente y el grupo control, ello pudiera explicarse por las pocas pacientes con la variedad primaria incluidas en el estudio, y estar en línea con lo referido por Hantoushzadeh y colaboradores, ²³ quienes reportan un vínculo importante entre las pruebas anormales del metabolismo de la glucosa y la pérdida gestacional recurrente aunque, de nuevo, valga reiterar que en el estudio no se recurrió a ninguno de los parámetros para búsqueda de alteraciones en el metabolismo de la glucosa.

En las pacientes con pérdida gestacional recurrente primaria se encontró que también padecían una enfermedad autoinmunitaria en proporción significativamente mayor que las pacientes con la variedad secundaria (10.52 en comparación con 0.76%; p = 0.005), lo que difiere de lo informado por Ticconi y su grupo, ²⁴ quienes refieren que no hay diferencias en este sentido entre las pacientes con pérdida gestacional recurrente primaria o secundaria; esto a pesar de que la cantidad de pacientes aquí analizada haya sido escasa.

Nosotros, además, hicimos un análisis multivariado en nuestras pacientes con pérdida gestacional recurrente primaria para determinar si algún otro factor clínico posee mayor efecto que el polimorfismo G238A del TNF-a, y no se encontró significación en los efectos de las variables clínicas ni en las posibles asociaciones entre ellas.

Limitaciones del estudio: su naturaleza observacional, la pequeña cantidad de pacientes incluidas y corresponder a un solo centro hospitalario.

Lo encontrado en el estudio sugiere que la participación del gen TNF-α en la pérdida gestacional recurrente es compleja y aún no comprendida del todo. Los diferentes estudios muestran evidencia contradictoria en asociación y en efecto. Sin duda se requiere información adicional de la prevalencia de estos polimorfismos en la República Mexicana y sus estados y el análisis correspondiente en protocolos de estudio.

CONCLUSIÓN

En el grupo estudiado, el polimorfismo G-238 A (rs361525) del gen TNF-α mostró asociación con la pérdida gestacional recurrente, no así el polimorfismo G-308A (rs1800629).