Artículos científicos

 

Detección de suero de quesería en leches ultrapasteurizadas mexicanas mediante la cuarta derivada del espectro de absorción

 

Rennet whey solids detection in Mexican ultrapasteurized milk using fourth derivative absortion spectrum

 

Acacia Ramírez Ayala* Salvador Vega y León* Guadalupe Prado Flores* Rey Gutiérrez Tolentino* Cuauhtémoc Pérez González**

 

* Departamento de Producción Agrícola y Animal, Universidad Autónoma Metropolitana–Xochimilco, Calzada del Hueso 1100, Col. Villa Quietud, 04960, México, D.F.

** Departamento de Sistemas Biológicos, Universidad Autónoma Metropolitana–Xochimilco, Calz. del Hueso 1100, Col. Villa Quietud, 04960, México, D. F.

 

Recibido el 13 de septiembre de 2006
Aceptado el 15 de noviembre de 2007.

 

Abstract

Presence of rennet whey solids in ultrapasteurized milk (UHT) commercialized in Mexico City was determined using fourth derivative of absorption spectrum method, which allows to know the variation in whey protein/total protein ratio (WP/TP). The quantification of WP/TP ratio was used as an indicator of adulteration with rennet whey solids. The method was standardized to evaluate the accuracy, linearity and repeatability by rennet whey addition in concentrations between 0–15%, in raw milk. Thirty samples of skim ultrapasteurized milk were analyzed during September, October and November; found values were compared to the ones of raw milk added with rennet whey solids (0–15%, in levels of 2.5%). A marginal difference was found in the WP/TP ratio for the 0% concentration between the two types of milk, while the rest of the concentrations showed a high significance (P < 0.01). Values above 13.5% of WP/TP showed rennet whey solids addition; 36.7% of the UHT milk samples were between 5% and 12% positive to rennet whey solids addition. The results indicated that fourth derivative of the absorption spectrum of the WP/TP ratio was a sensitive indicator to rennet whey solids additions.

Key words: Rennet whey Protein/Total Protein Ratio, Fourth Derivate of UV Absorption Spectrum, UHT Milk, Adulterations.

 

Resumen

Se determinó la presencia de suero de quesería en leches ultrapasteurizadas (UHT) comercializadas en la Ciudad de México mediante el método de la cuarta derivada del espectro de absorción, el cual permite conocer la variación de la relación proteínas de suero/proteína total (PS/PT). La cuantificación de la relación PS/PT se utilizó como indicador de la adulteración con suero de quesería. El método fue estandarizado evaluando la exactitud, linealidad y repetibilidad mediante la adición de suero en concentraciones entre 0%–15% a leche cruda. Se analizaron 30 muestras de leche ultrapasteurizada descremada durante septiembre, octubre y noviembre; los valores encontrados se contrastaron con los de leche cruda adicionada con suero de quesería (0%–15%, en niveles de 2.5%. Se encontró una diferencia marginal en la relación PS/PT para la concentración 0% entre los dos tipos de leche, mientras que el resto de las concentraciones mostró una significancia alta (P < 0.01). Valores por encima de 13.5% de PS/PT expresaron adición de suero; 36.7% de las muestras de leche UHT fueron positivas a la adición de suero entre 5% y 12%. Los resultados indicaron que la cuarta derivada del espectro de absorción de la relación PS/PT fue un indicador sensible a adiciones de suero de quesería.

Palabras clave: Suero de quesería, Relación proteínas de suero/proteínas totales , Cuarta derivada del espectro de absorción UV, Leche UHT, Adulteraciones.

 

Introducción

Tecnologías tanto de concentración por membranas como de ultrafiltración, que han sido desarrolladas por la industria láctea, han hecho posible la elaboración de nuevos productos como los concentrados de proteínas de suero, que pueden ser utilizados como adulterantes en la leche.^1,2 En México, la importación de estos concentrados ha ido en aumento en los últimos años; en 1996 se importaron 51 328 toneladas, y para 2004 se alcanzaron 66 816 toneladas de lactosueros con valor de 68 079 dólares. Este producto se ha importado principalmente de Estados Unidos y de la Unión Europea³ (UE) con el fin de utilizarlo como medio para bajar costos y aumentar la rentabilidad en la elaboración de "productos lácteos" de menor calidad y bajos precios.⁴

La leche como producto procesado puede llegar al consumidor en diferentes presentaciones y en cualquiera de ellas puede existir adulteración con diversos propósitos, uno es la obtención de mayor rendimiento en el producto final. Por lo anterior, en la actualidad se ha dado atención especial a la detección de lactosueros que se pueden adicionar de forma fraudulenta a la leche fluida, en especial a la leche ultrapasteurizada, cuyo consumo ha aumentado en México y en otros países.^5–8

La incorporación de sólidos procedentes de suero constituye una clara violación a la reglamentación vigente nacional e internacional. Tanto en países de la UE como en América Latina, la adulteración de leche fluida con suero de quesería va en aumento,⁹ por esta razón continúan realizándose investigaciones en este sentido. Asimismo, la presencia de agregados de suero de quesería en leche fluida representa un problema grave y causa pérdidas económicas tanto para los productores nacionales como para los industriales que elaboran sus productos a partir de leche fresca. Asimismo, es un engaño a los consumidores ofrecerles leche adulterada con suero a un precio tal como si se tratara de un producto que contiene exclusivamente sólidos no grasos provenientes de la leche.

Para detectar leche adulterada con suero de quesería se han desarrollado diversos métodos, que se diferencian por la sensibilidad y complejidad del análisis. Muchos de ellos proporcionan sólo ligeras indicaciones, pero no pruebas definitivas,^10,11 como la electroforesis con agentes desnaturalizantes, que se emplea en la identificación y cuantificación de proteínas lácteas, con el beneficio de estimaciones cualitativas reales; sin embargo, la cuantificación con rigor estadístico requiere equipos de mayor resolución, con programas automatizados, como la electroforesis capilar.

Entre los métodos actuales se ha propuesto la medición de la respuesta espectroscópica de los aminoácidos aromáticos triptófano (Trp) y tirosina (Tyr), que son responsables de señales de absorción específica a 274.5 y 278 nm, respectivamente. El fundamento analítico del método consiste en la medición de la relación Trp/Tyr de las proteínas del suero (0.59), que es diferente de la misma relación para la proteína total de caseínas (0.19). Por lo tanto, dicha relación da cuenta de la proporción natural de los aminoácidos aromáticos presentes en la leche o productos lácteos y, en su caso, si ha sido modificada con adiciones fraudulentas o por tratamientos tecnológicos.¹³ La cercanía y superposición parcial de las señales espectroscópicas de Trp y Tyr pueden ser resueltas con los modelos de derivación de los espectros de absorbencia y la elección de la cuarta derivada, ya que expresa una resolución suficiente en los máximos y mínimos de absorbencia frente a la implementación en los equipos analíticos. De esta manera, el cociente entre el mínimo del Trp a 294 nm (δ⁴A/δλ⁴294nm) y el máximo correspondiente a Trp y Tyr (δ⁴A/δλ⁴283nm) está relacionado linealmente con el contenido de proteínas de suero y caseínas en mezclas que contienen diferente proporción de los dos tipos de proteína.

El Comité del Codex de leche y productos lácteos ha admitido la estandarización del contenido de proteína de la leche en polvo, siempre y cuando la relación proteínas de suero/caseínas no sea afectada por el procedimiento de estandarización; por tal motivo sólo pueden utilizarse "retenidos" obtenidos mediante la ultrafiltración de la leche que contenga caseínas y proteínas de suero en la misma relación que la leche genuina.¹⁴

Por ello, el objetivo de este trabajo consistió en la aplicación de un método analítico espectroscópico para la determinación de la relación proteína de suero/proteína total (PS/PT), que permitiera establecer un intervalo natural y fuera capaz de detectar posibles adiciones fraudulentas de suero en leche ultrapasteurizada.

 

Material y métodos

Muestras

Los N–acetil ésteres de triptófano,* tirosina y fenilalanina** se utilizaron como compuestos modelo para estudiar el espectro de absorción UV de los aminoácidos aromáticos Trp y Tyr, con el fin de obtener una aproximación al entorno químico de estos residuos aminoacídicos en las proteínas lácteas.

Para establecer la relación PS/PT se prepararon muestras de calibrado de proteína de suero en proteína total al 5%, 10%, 15%, 20%, 25% y 30%, mezclando una solución de caseína estándar*** en hidróxido de sodio 0.1 M, pH 6.12 y una solución de seroalbúmina bovina (SA), α–lactoalbúmina (α–La) y β–lactoglobulina (β–Lg) en la proporción 12:5:1, respectivamente.¹⁵

La exactitud de la UV–4 DS en la relación PS/PT depende en gran medida de la disponibilidad de muestras de referencia que tengan diferente relación, para lo cual se utilizaron las muestras NISECAS 0, 15, 20, 25 y 100,**** con relación PS/PT de 0, 15, 20, 25 y 100%, respectivamente.

Se obtuvieron 30 muestras de diez marcas de leche ultrapasteurizada descremada de mayor venta en la Ciudad de México (tres muestras por marca), durante septiembre, octubre y noviembre. Las tomas de muestras fueron de lotes diferentes.

Como testigo negativo se usaron muestras de leche auténtica de vaca, recolectadas durante el ordeño, en presencia del investigador. Como testigo positivo se prepararon por sextuplicado, mezclas de leche fresca auténtica, adicionadas con suero de quesería denominado comercialmente WPC–34, cuyo contenido proteínico estuvo entre 34% y 36%.

 

Preparación de muestras

Las muestras de leche descremada ultrapasteurizada, muestras de referencia y mezclas de calibración (30 µL) se desnaturalizaron con HC1–guanidina 6 M e hidróxido de sodio 0.1 M, pH 6.12. Los viales (5 mL) se colocaron en un baño de ultrasonido durante 20 minutos, e inmediatamente se midió su espectro de absorción. Todas las muestras se analizaron por duplicado. Se registraron los valores absolutos de δ⁴A/δλ⁴ a las longitudes de onda correspondientes a los diferentes máximos y mínimos seleccionados.

 

Condiciones de medición de la derivada del espectro de absorción en el UV

Para las condiciones de medición de la derivada del espectro de absorción en el UV y la preparación de muestras, se tomaron como referencia los estudios de Meisel¹² y Miralles et al.¹⁵ con diferencias menores de respuesta en las absorbencias. Los espectros de absorción de las muestras de referencia y de leche UHT se registraron y se determinó la cuarta derivada entre 250 y 310 nm, velocidad de 1 200 nm min,^–1 empleando un espectrómetro.*****

 

Características analíticas del método

Previamente a la aplicación de la UV–4ª DS para la determinación de la relación PS/PT en las muestras de leche ultrapasteurizada, se llevó a cabo la estandarización del método propuesto. Se estimó la linealidad de respuesta por análisis de regresión lineal, la repetibilidad con la desviación estándar relativa y la reproducibilidad mediante el coeficiente de variación.

 

Cuantificación

Se registraron los valores absolutos δ⁴A/δλ⁴ a las longitudes de onda correspondientes a los diferentes máximos y mínimos en las muestras de calibrado con porcentajes de PS/PT de 5%, 10%, 15%, 20%, 25% y 30% y las muestras de referencia NISECAS. El cociente (δ⁴A/δλ⁴ 294)/(δ⁴A/δλ⁴ 283) x 100 fue correlacionado con la relación de PS/PT, mediante un análisis de regresión lineal.

 

Análisis estadístico

Para obtener la ecuación de la recta de la curva estándar de calibración entre los valores absolutos de la cuarta derivada de los espectros de absorción a diferentes longitudes de onda (>δ⁴A/δλ⁴), contra la relación de proteínas del suero/proteína total (PS/PT) de las mezclas de calibración (5%–30%), se utilizó un análisis de regresión lineal simple. Se seleccionó como variable dependiente δ⁴A/δλ⁴ y como variable independiente PS/PT.

Los resultados obtenidos de las muestras de leche cruda y UHT se sometieron a un análisis de varianza de un factor, seguida de la prueba de Tukey para comparación de medias de la relación PS/PT en cada tipo de leche. Para comparar las medias del cociente PS/ PT con la variación de los diferentes porcentajes de incorporación de suero entre los dos tipos de leche, se utilizó la prueba t de Student. Se usó el programa SPSS, versión 8.5 para Windows.

 

Resultados

Concentración de compuestos modelo y selección de longitud de onda

Se exploraron las concentraciones a manejar en la determinación analítica tomando en cuenta los coeficientes de extinción molar del Trp y de la Tyr, así como la relación entre Trp/Tyr en la leche corresponde a 0.59 y en el suero a 0.19. Las estimaciones encontradas fueron 0.105 mM para el Trp y 0.5 mM para la Tyr y se obtuvieron los máximos y mínimos en la cuarta derivada del espectro de absorción.

Los espectros de orden cero presentaron un solapamiento para los máximos de los N–acetil–ésteres de Trp y Tyr, mientras que los espectros de la cuarta derivada mostraron señales separadas para los péptidos con aminoácidos aromáticos.

La Tyr presentó máximos de absorbencia a 276 nm, 283 nm y 293 nm, y mínimos a 278 nm y 287 nm. El Trp presentó máximos de absorbencia a 283 nm y 289 nm y mínimos a 285 nm y 294 nm.

La Figura 1 muestra la superposición del espectro de la cuarta derivada de una muestra de leche UHT y de los compuestos modelo. Los tres máximos 276 nm (a), 283 nm (b) y 289 nm (c) y los tres mínimos a 278 nm (d), 287 nm (e) y 294 nm (f) que aparecen en el espectro de la leche, corresponden a la contribución de la Tyr (a, d), del Trp (c, f) o de ambos (b, e).

 

Caracterísiticas analíticas del método de UV–4 DS

Para establecer la linealidad de la absorbencia frente a distintos volúmenes de leche, se tomaron volúmenes entre 30 µL y 170 µL, se completaron posteriormente hasta 2 mL con NaOH 0.1 M, pH 6.12 y HCl–guanidina 6 M, determinándose la cuarta derivada del espectro de absorción a 283 y 294 nm. La relación (δ⁴A/δλ⁴ 294)/ (δ⁴A/δλ⁴ 283) se mantuvo constante con un volumen de 30 µL, lo que permitió utilizar menor cantidad de reactivos que en los estudios descritos por Meisel¹² y Miralles et al.¹⁵

La exactitud en la determinación de la relación PS/PT se obtuvo estableciendo una recta de calibrado con las muestras de caseína y proteínas de suero con una relación de PS/PT de 5%, 10%, 15%, 20%, 25% y 30%.

El resultado del análisis de regresión líneal simple para la determinación PS/PT en las muestras de calibrado y en las muestras NISECAS se aprecia en el Cuadro 1. Se muestra el coeficiente de regresión, el valor de la pendiente y la variable independiente representada por el cociente PS/PT. La exactitud media del método, calculada como el cociente entre el valor encontrado para las muestras de calibrado y su valor teórico, fue de 103.56%.

La repetibilidad del método se realizó en diferentes días, mediante el análisis de las mezclas de calibración y una muestra de leche ultrapasteurizada– descremada por sextuplicado. La repetibilidad del método expresada como la desviación estándar relativa (RSD) fue de 2.3%.

En el Cuadro 2 se presentan los resultados de la determinación cuantitativa de la relación PS/PT de muestras de leche cruda auténtica y UHT adicionadas de suero de quesería, en proporciones de 2.5% al 15%.

El incremento observado en la relación PS/PT fue mayor para la leche UHT que para la leche cruda. La prueba t de Student permitió definir una diferencia marginal entre la relación PS/PT en la concentración a 0% entre la leche cruda y la leche UHT. Para el resto de las concentraciones se encontró una significancia alta (P < 0.01), lo que significó que valores por encima de 13.5% de PS/PT podrían ser indicativos de adición de suero a la leche, en un nivel de 5%.

 

Cuantificación de la relación de proteínas de suero/proteína total en leches UHT comerciales

En cuanto a las concentraciones de suero de quesería determinadas por la cuarta derivada del espectro de absorción de las diez marcas de leche UHT analizadas, 36.7% de las muestras fueron positivas por lo menos en dos ocasiones durante el periodo de toma de muestras (Cuadro 3). En nueve marcas se detectó la presencia de suero; es decir que 90% de las muestras estudiadas tenían suero de quesería. Sólo la marca 4 no presentó agregado de suero en las repeticiones dos y tres. En las marcas de leche positivas, el nivel de adulteración fue mayor en las tomas de muestras uno y tres. El nivel de adulteración mayor al 10% se estimó en 10% de las muestras durante septiembre, octubre y noviembre, periodo en el cual los sólidos totales son menores, lo que provoca que las industrias recurran a la adición de suero de quesería para estandarizar el contenido de proteínas totales en la leche, para obtener productos con contenido de pro teína constante.

 

Discusión

Con el fin de seleccionar la longitud de onda para el análisis espectroscópico, Meisel¹² y Lüthi–Peng y Puhan¹⁶ usaron la misma relación mínimo/máximo, para cuantificar las proteínas de suero con sus correspondientes máximos y mínimos de 282 y 296 nm, respectivamente, mientras que en este estudio las longitudes de onda utilizadas fueron 283 y 294 nm, similar a lo registrado por Miralles et al.¹⁵

 

Cuantificación de la relación de proteínas de suero/proteína total en leches UHT comerciales

Los valores obtenidos tras el análisis de las muestras problema expresaron una relación PS/PT media de 14.2% (n = 30). Dicho valor fue diferente al registrado por Miralles et al.¹⁵ de 18.1 ± 2.3% en leches UHT descremadas. En este trabajo y de acuerdo con los valores registrados en el Cuadro 2, se estableció que los porcentajes mayores a 13.5 PS/PT indicaban adición de suero.

Urbán et al.,⁹ usando la técnica de electroforesis (PAGE–SDS), encontraron que 50% (n = 96) de la leche ultrapasteurizada comercializada en la Ciudad de México, presentaba adulteración con suero de quesería, contraviniendo lo establecido en la legislación sanitaria mexicana,¹⁷ que descarta el uso de lacto–suero aun en época de lluvias cuando disminuye el contenido de proteína.

La relación natural de proteínas de suero/proteína total puede variar por diversos factores; Lüthi–Peng y Puhan¹⁶ encontraron valores para leche cruda de vaca (n = 34) entre 12.7% y 21 %, utilizando un método espectroscópico, valor que coincide con el obtenido en este estudio para leche cruda de vaca (12.43%). Coulon et al.¹⁹ revisaron los factores genéticos, fisiológicos y dietéticos que afectan la proporción de caseína en la proteína total de la leche, y mostraron que existen variantes genéticas de la P–Lg, siendo las más comunes las llamadas A y B, que difieren en dos aminoácidos. La variante A tiene valina en la posición 118, y aspartato en la posición 64, mientras que la variante B tiene alanina y glicina, respectivamente.

La variante genética de la β–Lg es el principal factor que afecta la relación caseína/proteína en la leche, mientras que los factores ligados a la dieta tienen una influencia menor. La relación PS/PT encontrada por esos autores fue de 16.8% en la leche con presencia de P–Lg BB, de 18.4% en la leche con β–Lg AB y 19.6% en la leche con β–Lg AA. Por tanto, aunque este factor tiene influencia por cada vaca, no puede ser detectable en leche que procede de grandes mezclas como las muestras estudiadas.^18,19

Por lo anterior, se considera que para evaluar la relación natural de proteínas de suero/caseínas, habría que establecer un intervalo "normal" de esta relación, que incluyera todos los intervalos que pudieran darse.

Meisel¹² y Miralles et al.¹⁵ han encontrado datos controvertidos en el contenido de grasa y la relación PS/PT. Mientras que el primero señaló que en la cuarta derivada del espectro de absorción no hubo influencia del contenido graso, Miralles, en cambio, al trabajar con leche entera UHT encontró diferencias en la desviación estándar relativa, al compararla con leches descremadas. Los procedimientos industriales de ultrapasteurización no afectan la relación PS/PT.¹⁵

El Comité del Codex de leche y productos lácteos recomienda que la relación proteínas de suero/caseínas no debe ser afectada por el procedimiento de estandarización, por lo que ha propuesto límites para la relación de proteínas de suero/caseínas en leches evaporadas, condensadas edulcoradas, en polvo, queso y nata en polvo.¹⁴

En conclusión, la determinación de la relación PS/ PT a través de la cuarta derivada del espectro de absorción permitió detectar adiciones de suero de quesería en 36.7% de las muestras de leche UHT analizadas. Se detectó que 56.7% de las muestras estudiadas presentó menos de 5% de adición de suero de quesería, lo que demostró el empleo fraudulento de dicho subproducto conforme a lo que establece la legislación nacional vigente.

El modelo analítico propuesto para estimar las adiciones de suero de quesería en leches UHT quedó justificado por sus características analíticas, por las apreciaciones cuantitativas encontradas y por el estudio estadístico realizado.

El método ofrece las siguientes ventajas: a) es más rápido y no fue destructivo, ya que las proteínas no son alteradas; b) es posible obtener resultados de gran número de muestras con alta eficiencia; c) puede aplicarse a productos lácteos que contienen proteínas hidrolizadas, y d) se adapta a cualquier mezcla de proteínas.

 

Referencias

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NOTAS

*Aldrich, 857726, Estados Unidos de América.

**Sigma, Estados Unidos de América, A–6751 y A– 4251, respectivamente.

***Sigma, Estados Unidos de América.

****NIZO Food Research, Ede, Holanda.

*****Beckman Du ®–600, Estados Unidos de América.