Notas de investigación

 

Vulvovaginitis y balanopostitis pustular sugerente a herpesvirus caprino–1 en cabras (Querétaro, México)

 

Pustular vulvovaginitis and balanoposthitis suggestive of caprine herpesvirus–1 infection in goats (Queretaro, Mexico)

 

Irma Eugenia Candanosa Aranda* Mayra Sierra García* Alejandra Sánchez Cervantes* Gerardo Salas Garrido** Adriana Méndez Bernal** Laura Cobos Marín*** Lorenzo Álvarez Ramírez*

 

* Centro de Enseñanza Investigación y Extensión en Producción Animal del Altiplano, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, Carretera km 8.5 Tequisquiapan–Ezequiel Montes, Tequisquiapan, Querétaro.

** Departamento de Patología, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, 04510, México, DF.

*** Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, 04510, México, DF.

 

Responsable de correspondencia:
Irma Eugenia Candanosa Aranda,
Correo electrónico: ieca@servidor.unam.mx

 

Recibido el 22 de junio de 2010.
Aceptado el 19 de mayo de 2011.

 

Abstract

Infectious pustular vulvovaginitis and balanoposthitis in goats is caused by caprine herpesvirus 1 (CpHV–1), from the Herpesviridae family Alphaherpesvirinae subfamily, sometimes produces abortion, neonatal enteritis and respiratory disease in adult goats. In a herd of 244 dairy and meat goats, physical examinations were performed in does and bucks, presenting vulvar and preputial lesions. Necropsies were done in four discarded animals (one male and two females) and one stillborn; immunohistochemistry (IHC) with bovine herpesvirus 1 (BHV–1) antibodies in prepuce and vulva samples was carried out. Penis and prepuce exfoliative cytology was carried out in six bucks. Prepuce biopsies were collected for electron microscopy and viral isolation. Macroscopically, moderate to severe coalescent multifocal pustular and ulcerative vulvovaginitis was observed; and severe coalescent multifocal pustular and ulcerative balanoposthitis. Microscopically, different degrees of inflammatory lesions with presence of eosinophilic and amphophilic intranuclear inclusion bodies were present. In electron microscopy, the prepuce samples and MBDK cell culture showed several intranuclear viral particles of 150 to 230 nm size. There was slight epithelial cell positivity in IHC with BHV–1 antibodies in vulva and prepuce histological cuts made at necropsy. In the viral isolate was observed a cytopathic effect and the presence of viral particles by microscopy electronic suggesting herpes virus. This is the first documented report suggesting the presence of herpes virus outbreak in caprine herds in Mexico.

Key words: Caprine herpesvirus type 1, vulvovaginitis, balanoposthitis, caprine.

 

Resumen

La vulvovaginitis y balanopostitis pustular infecciosa en cabras es producida por herpesvirus caprino 1 (CpHV–1), de la familia Herpesviridae subfamilia Alphaherpesvirinae, que ocasionalmente produce aborto, enteritis neonatal y enfermedad respiratoria en las cabras adultas. En un rebaño de 244 cabras de genotipo lechero y cárnico; se realizaron exámenes físicos de hembras y sementales en los que se observaron lesiones vulvares y prepuciales. Se realizó la necropsia de cuatro animales adultos de desecho (dos hembras y un macho) y un neonato muerto; se realizó inmunohistoquímica (IHQ) con anticuerpos de herpesvirus bovino 1 (BHV1) en muestras de prepucio y vulva. Se analizaron las citologías exfoliativas de pene y prepucio de 6 sementales. Se recolectaron y analizaron biopsias de prepucio para microscopía electrónica y aislamiento viral. Macroscópicamente, en las hembras se observó vulvovaginitis pustular y ulcerativa de moderada a grave multifocal coalescente, además de balanopostitis pustular y ulcerativa grave multifocal coalescente en los machos. Microscópicamente, se presentaron lesiones inflamatorias en diferentes grados, con presencia de cuerpos de inclusión intranucleares eosinofílicos y amfofílicos. En microscopía electrónica, las muestras de prepucio y cultivo celular de MBDK presentaron numerosas partículas virales intranucleares de un tamaño de 150 a 230 nm. En los cortes histológicos de prepucio y vulva de las necropsias se detectó una ligera positividad en las células epiteliales con anticuerpos BHV–1. En el aislamiento viral se observó efecto citopático, y la presencia de partículas virales mediante microscopía electrónica sugerentes a herpes virus. Este es el primer informe documentado que sugiere la presencia de herpes virus en rebaños caprinos de México.

Palabras clave: Herpesvirus caprino tipo 1, vulvovaginitis, balanopostitis, caprinos.

 

Introducción

El Herpesvirus caprino tipo 1 (CpHV–1) afecta a cabras de diferentes edades y puede ser responsable de pérdidas económicas importantes para la granja. En animales adultos, cuya inmunidad y alimentación está comprometida, el CpHV–1 puede ser causa de abortos, muerte embrionaria y muerte neonatal, al igual que de enfermedad respiratoria, vulvovaginitis y balanopostitis pustular de moderada a grave. Además, puede inducir la pérdida de peso y disminución de la producción láctea. En neonatos se manifiesta con enteritis y enfermedad sistémica.^1–4

El CpHV–1 establece un estado de latencia después de la infección en neuronas ganglionares, el cual puede ser reactivado y excretado después de situaciones de estrés, como el transporte, época de empadre y pariciones, tratamiento prolongado con glucocorticoides y carencias nutrimentales. La principal vía de infección ocurre por transmisión sexual y nasal.^5,6

El CpHV–1 pertenece a la familia Herpesviridae y a la subfamilia Alphaherpesvirinae.^7,8 Posee un ADN lineal de doble banda, con una cápside icosahédrica de 100 a 110 nm de diámetro.^9,10 El primer aislamiento del CpHV1 se realizó en 1975 en California,¹ a partir de tejidos de cabritos recién nacidos que habían desarrollado una enteritis severa. Se ha sugerido que la distribución de la enfermedad es mundial con prevalencias variables en Australia, Canadá, Estados Unidos, Nueva Zelanda y parece predominante en Europa, especialmente en la cuenca mediterránea.^1,10,11 En México no se conocen informes sobre la presencia del virus causante de este padecimiento.

El objetivo del presente estudio es describir los hallazgos de la revisión física, histológica e inmunológica de lesiones que sugieren la presencia de CpHV1 en un rebaño de México.

Descripción del caso

El caso se detectó en un rebaño caprino (177 cabras de genotipo lechero, 67 cabras de genotipo cárnico) ubicado en el municipio de Tequisquiapan, Querétaro. Las cabras se encuentran en un modelo de producción semiextensivo, con estabulación y pastoreo rotacional en praderas mixtas compuestas por 90% de alfalfa (Medicago sativa), 10% de rye grass (Lolium perenne) y orchard (Dactylis glomerata), se complementan con sales minerales ad libitum y alimento balanceado en fases críticas (crecimiento–desarrollo, lactación). El rebaño presenta animales seropositivos a paratuberculosis y artritis encefalitis caprina.

Se realizaron exámenes físicos de hembras de genotipo cárnico (Boer) antes del empadre en noviembre de 2008, en los que se observaron lesiones vulvares pustulares y ulcerativas de ligeras a graves en 17 cabras. Se procedió a desinfectar el área afectada y se aplicó antibiótico en aerosol (Furazolidona) como medida curativa inmediata, ya que se ignoraba la causa de las lesiones. Posteriormente, en una segunda revisión en diciembre del 2008 se observaron 18 cabras con lesiones similares, nueve fueron reincidentes y el resto eran casos nuevos. De las cabras que presentaron lesiones en la primera revisión, tres no mostraron lesiones macroscópicas y cinco animales habían salido del rebaño. En febrero del 2009 se realizó una tercera revisión física de toda la población de hembras cárnicas (67 animales adultos), de los cuales 17 cabras presentaron lesiones de leves a moderadas, cinco con regeneración visible. En esta última revisión se presentaron cuatro casos reincidentes desde noviembre y uno con regeneración visible, 13 fueron casos nuevos. Además se realizaron exámenes físicos de seis sementales (dos Toggenbourg, dos Alpino Francés, un Saanen y un Boer) y se apreciaron lesiones prepuciales pustulares y ulcerativas de ligeras a graves, se aplicó un tratamiento similar al de las hembras y se realizaron lavados locales diarios. Las lesiones observadas en vulva y prepucio se clasificaron de acuerdo a su grado, en el cual el grado 1 es ligero, grado 2 moderado y grado 3 grave (Figura 1 y 2).

Durante el periodo de empadre (noviembre–diciembre, 2008) se le dio servicio a 39 cabras cruzas de Boer que presentaron lesiones vulvares en algún momento, mediante monta natural con sementales lecheros e inseminación artificial utilizando semen congelado de Boer. En el mes de diciembre volvieron a entrar en calor 11 cabras. En febrero de 2009 se realizó diagnóstico de gestación y 14 cabras resultaron positivas. En abril y mayo parieron 12 cabras que habían presentado lesiones vulvares.

Se realizaron citologías exfoliativas de pene y prepucio de los seis sementales del rebaño que presentaron lesiones prepuciales posteriores al empadre, las muestras fueron teñidas con tinción rápida.*

Se realizaron cuatro necropsias a dos hembras adultas y un macho adulto en el mes de enero y un neonato muerto en junio de 2009. Los animales adultos fueron eliminados de la granja por baja producción, y sacrificados con pistola de émbolo oculto y desangrado en el área de necropsias.

Debido a que este virus no ha sido registrado en México, se realizó la técnica de inmunohistoquímica contra Herpesvirus Bovino 1 (BHV–1) en cortes histológicos de pene y vulva de las tres necropsias de animales adultos. Para demostrar la presencia viral en los tejidos afectados, se empleó el sistema de inmunodetección estreptavidina–biotina (ABC) y anticuerpo primario contra BHV–1,** en dilución 1:200. Cabe señalar, que no existen anticuerpos comerciales anti CpHV–1, por lo que se decidió emplear el anticuerpo mencionado debido a la cercanía genética y antigénica entre el BHV–1 y el CpHV–I.¹²

Se realizó una biopsia de prepucio con lesiones pustulares y ulcerativas, la muestra se fijó inmediatamente con glutaraldehído al 2.5%, se lavó con solución amortiguada de cacodilato a un pH 7.2, 0.1M. Posteriormente se fijó con tetraóxido de osmio al 1%, deshidratada con acetona e impregnada en resina epóxica.*** Una vez procesados los fragmentos, se realizaron cortes semifinos de 0.15 vim, montados en laminillas y teñidos con azul de toluidina, y cortes finos de 60 nm de grosor montados en rejillas de cobre y teñidos con acetato de uranilo y citrato de plomo. Las muestras se observaron en un microscopio electrónico de transmisión.****

Se obtuvo una biopsia de prepucio para aislamiento viral en cultivo celular que se conservó a –20° C hasta su procesamiento. Una vez descongelada, la muestra se maceró y se le agregó solución salina tamponada como diluyente para lograr una concentración al 10%, que posteriormente se centrifugó a 873.43 g/10min; el sobrenadante obtenido se filtró en una membrana de 0.45 micras y se sembró en medios bacteriológicos (agar triptosa y caldo tioglicolato 0.1 ml) que se incubaron a 37°C por 48 horas para verificar la ausencia de contaminación bacteriana. Se tomaron 0.5 ml del inoculo para adicionarlo en botellas de 25 cm² que contenían células MDBK en monoestrato y se incubaron a 37°C por una hora. Después, se retiró el inoculo y se le adicionó medio esencial mínimo (MEM) complementado con 10% de suero fetal bovino (SFB). Las células inoculadas y sin inocular (como testigo negativo) se incubaron a 37°C en una estufa de CO₂ y se observaron diariamente en busca de lesiones. A los cinco días de la inoculación las células se lisaron por congelación y descongelación, para realizar un segundo pase, éste se hizo centrifugando la muestra anterior para inocularla en otra monocapa de células MBDK. Posteriormente, se realizó la reinfección en cultivo celular MDBK mostrando efecto citopático a las 48 h; a las 72 h se tomó la monocapa y se fijó con glutaraldehído al 2.5% para su evaluación en microscopia electrónica de transmisión.***

Los hallazgos citológicos de pene y prepucio de los seis sementales fueron comunes con presencia de abundantes glóbulos rojos, neutrófilos y macrófagos, así como múltiples células epiteliales nucleadas y anucleadas y abundantes bacterias bacilares y cocoides. En dos casos se observaron cuerpos de inclusión intranucleares eosinofílicos y amfofílicos en células epiteliales. Los cuerpos de inclusión intranucleares observados fueron sugerentes a herpesvirus. La presencia de células inflamatorias fue descrita como parte de un proceso infeccioso de curso agudo. La presencia de bacterias se explica debido a que las infecciones bacterianas secundarias son comunes en estos casos.

En la necropsia de los animales adultos, el macho presentó balanopostitis ulcerativa y pustular grave multifocal (Figura 3), y en las hembras, vulvovaginitis pustular y ulcerativa grave multifocal. Algunas lesiones que se presentaron en diferentes grados incluyen hiperplasia epitelial, edema intracelular, úlceras, infiltrado linfoplasmocítico subepitelial y presencia de cuerpos de inclusión intranucleares amfofilicos grandes con halo principalmente en las células del estrato espinoso (Figura 4). Adicionalmente, se observaron otras lesiones como enteritis proliferativa en diferentes grados, asociadas con paratuberculosis; además, las hembras presentaron artritis y bursitis linfoproliferativa grave y fibrosis glandular grave difusa en glándula mamaria.

El neonato fue cría de una hembra Boer con lesiones vulvares asociadas con la entidad, no fue posible recuperar la placenta. Macroscópicamente se observó abundante espuma en tráquea, pulmones, piel, bazo, páncreas y linfonodos mesentéricos mostraron edema de moderado a grave con aspecto gelatinoso. Microscópicamente se observó edema en diferentes órganos, así como hepatitis linfohistiocítica multifocal con distribución al azar, degeneración vacuolar moderada difusa con cuerpos de inclusión intranucleares intralesionales. En el Cuadro 1 se refieren únicamente las lesiones observadas sugerentes a CpHV–1.

La inmunohistoquímica de los cortes histológicos de pene y vulva de los animales afectados mostraron tenue positividad intranuclear en las células epiteliales, probablemente debido al uso del anticuerpo contra BHV–1.

En microscopía electrónica de transmisión se revisaron varias secciones de piel de prepucio, compuesto por abundantes queratinocitos, que exhibieron uniones intercelulares discontinuas, entre las cuales se observaron espacios claros compatibles con edema. En otras regiones se apreciaron núcleos con heterocromatina escasa y adosada a la periferia y escasos cuerpos de inclusión intranucleares. Ultraestructuralmente, las células están separadas por espacios electrolúcidos ocupados por material fibrilar. Asimismo, los queratinocitos exhibieron abundantes tonofilamentos electrodensos y un número variable de gránulos de queratohialina, también electrodensos en su citoplasma; sus mitocondrias estuvieron ligeramente tumefactas; se apreciaron numerosas vacuolas intracitoplasmáticas, en cuyo interior se encontraron partículas virales de distinta electrodensidad. El núcleo se observó desplazado hacia la periferia por vacuolas de gran tamaño que contenían un material electrolúcido fibrilar; en el núcleo se identificaron numerosas cápsides virales con una envoltura electrodensa, las cuales miden de 26 a 50 nm de diámetro; asimismo, la medida de los viriones se estableció entre 150 a 230 nm de diámetro. Los núcleos en su mayoría se observaron de forma alargada y con bordes redondeados, algunos presentaron la membrana nuclear irregular (contracción nuclear). La heterocromatina (regiones electrodensas), se encontró adosada a la lámina nuclear interna, mientras que en algunos núcleos, la eucromatina ocupó la mayor parte situándose hacia el centro. En ocasiones, dentro de la cisterna perinuclear se observaron estructuras compatibles con virus, exhibiendo un centro ligeramente electrodenso, rodeado por una zona electrolúcida y envueltas por una fina membrana electrodensa. Los nucléolos fueron escasos y en general ausentes. Los hallazgos ultraestructurales como la tendencia de los núcleos a presentar abundante eucromatina y escasa heterocromatina adosada a la lámina nuclear interna, presencia de numerosas identaciones profundas (contracción nuclear), y de numerosas vesículas intracitoplasmáticas, son criterios que sugieren una infección de tipo viral.¹³ El diagnóstico emitido por microscopia electrónica fue: partículas virales de herpes virus (Figura 5). Los cultivos celulares del segundo pase mostraron efecto citopático (lisis celular) a las 48 horas de incubación, mientras que las células no infectadas no mostraron alteraciones (Figura 6). Ultraestructuralmente se revisaron varias secciones del cultivo celular infectado de 72 h, el citoplasma presentó numerosas vacuolas electrolúcidas de diversos tamaños y con escaso material fibrilar electrodenso, donde se apreciaron escasas partículas virales con morfología icosaédrica, en ocasiones en vacuolas y con una medida de 130 nm, mismas que se observaron emergiendo de la membrana plasmática. En el núcleo de las células se apreciaron algunas partículas virales electrodensas con morfología semi hexagonales, las cuales miden de 84 a 125 nm de diámetro, y se localizan entre el nucléolo y la heterocromatina, misma que se encuentra adosada a la envoltura nuclear interna. El diagnóstico emitido fue de partículas virales intranucleares e intracitoplasmáticas compatibles con herpes virus (Figura 7).

Hasta el momento se desconoce cómo se introdujo la enfermedad en el rebaño, aunque una posibilidad es el haber entrado al ingresar varios animales de otras granjas, previo al brote. Aunque se sabe que CpHV–1 afecta la fertilidad, no se puede afirmar que la baja fertilidad de este rebaño haya sido provocada por el agente viral involucrado en las lesiones, ya que algunas cabras fueron servidas mediante inseminación artificial utilizando semen congelado, lo que tiende a reducir los índices de concepción.

Las lesiones observadas de vulvovaginitis y balanopostitis fueron similares a las descritas por varios autores.^1,6–8 En inmunohistoquímica se observó una reacción cruzada ligera con BHV–1, lo cual ha sido referido por diferentes autores.^2,12,14,15 Si bien no es una evidencia de la presencia del CpHV–1 es muy sugerente a que las células se encuentran infectadas con algún herpes virus. La microscopía electrónica y el aislamiento viral ayudaron en gran manera para describir la estructura del virus, sin embargo se debe continuar con su identificación molecular. Varias investigaciones utilizan como herramienta diagnóstica a la histopatología, microscopía electrónica y la inmunohistoquímica.^6,15,16 Se acepta incluso que el diagnóstico de la enfermedad rara vez se realiza por aislamiento viral.¹⁷

La permanencia de este virus en el rebaño es indeseable ya que se puede mantener en forma subclínica y reactivarse naturalmente durante la época de empadre debido a los cambios hormonales y situaciones de estrés a los que se somete a los animales de manera cíclica.^11,18 La posibilidad de abortos por esta causa se incrementa cuando los animales presentan inmunodepresión.^3,16

En la actualidad, uno de los tratamientos eficaces para el control de la enfermedad en caprinos consiste en la administración vaginal del antiviral aciclovir;^19–22 sin embargo, el tratamiento resulta costoso y requiere de un manejo excesivo. Algunos tratamientos preventivos aún se encuentran en fase experimental, como la vacuna viva atenuada con base de BHV1 que limita la infección natural del herpes caprino y al parecer aporta buena protección contra la infección respiratoria y genital.¹⁶ También se está desarrollando una vacuna inactivada de CpHV–1 que sólo protegerá contra la infección local.²³

Estudios serológicos refieren que la infección con CpHV–1 tiene distribución mundial con alta seroprevalencia;^1,3,17 sin embargo, estos estudios no han sido realizados en México. El CpHV–1 tiene un fuerte impacto económico en los rebaños caprinos, ya que afecta la fertilidad de las hembras e induce abortos en el último tercio de la gestación.^2,6,7 Debido a que es una enfermedad latente es importante establecer programas de control de la misma.

En este estudio, de acuerdo a la presencia de cuerpos de inclusión intranucleares eosinófilos y amfofílicos en cortes de tejidos de vulva, pene y prepucio; el diagnóstico emitido por microscopia electrónica de partículas virales de herpes virus y la seropositividad débil por inmunohistoquímica a BHV–1 sugiere que las lesiones son causadas por un herpes virus; se requieren realizar estudios posteriores para confirmar la especie viral.

Es importante considerar la posible presencia de este virus en los rebaños caprinos de México, por lo que debe implementarse una prueba que confirme la enfermedad en el país, para ser incluida como diagnóstico diferencial en problemas reproductivos y genitales en la especie.

 

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Notas

* Hycel. Cat 548.

** Goat anti IBR, Cat. 210–70–IBR Lot. V00071, VMRD, Inc.

*** Epon 812.

**** Zeiss EM 900 a 80 kv.