Artículos científicos

 

Calidad microbiológica de carne de res comercializada en el mercado municipal de Culiacán, Sinaloa

 

Microbiological quality of beef sold in the municipal market of Culiacan, Sinaloa

 

Maribel Jiménez Edeza* Cristóbal Chaidez Quiroz** Josefina León Félix**

 

*Facultad de Ciencias Químico Biológicas. Universidad Autónoma de Sinaloa. Josefa Ortiz de Domínguez y Blvd. de las Américas S/N, Ciudad Universitaria, 80013, Culiacán, Sinaloa, México.

**Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A.C., Laboratorio de Microbiología Ambiental y de Alimentos. Carretera a Eldorado Km 5.5 Campo El Diez, 80129, Culiacán, Sinaloa, México.

 

Responsable de correspondencia:
Josefina León-Félix,
Teléfono: (667) 7605536, extensión 236,
correo electrónico: ljosefina@ciad.mx

 

Recibido el 13 de enero del 2012
aceptado el 9 de noviembre de 2012.

 

Abstract

The microbiological quality of raw meat was evaluated in 18 retail units of the municipal market in Culiacan, Sinaloa. The levels of E. coli were measured using methods from the Bacteriological Analytical Manual, and the O157 sero-group and the H7 antigen were also evaluated using chromogenic media and PCR, respectively. The results were confirmed using real time-PCR (PCR-TR) and PCR to detect virulence genes (vt1, vt2, eaeA and hlyA). Of the samples tested, 31.5% were positive for E. coli, with concentrations between 100 and 700 CFU/g of beef. Nine suspected E. coli O157:H7 strains were isolated from 16 samples, which were then discarded by the PCR-TR test. The virulence genes were not detected. The microbial contamination of beef could indicate the presence of pathogens from fecal sources. To guarantee the quality of these products, it is important to incorporate food safety programs.

Key words: Food safety, NOM-194-SSA1-2004, beef.

 

Resumen

Se evaluó la calidad microbiológica de carne de res en 18 comercios del mercado municipal de Culiacán, Sinaloa. Para determinar E. coli se usó la metodología del Manual Bacteriológico Analítico, y para evaluar el serogrupo O157 y antígeno H7, se usaron medios cromogénicos y PCR, respectivamente. La confirmación se hizo por PCR tiempo real (PCR-TR) y la detección de genes de virulencia (vt1, vt, eaeA y hlyA), por PCR. El 31.5% de muestras resultaron positivas para E. coli, con concentraciones entre 100 y 700 UFC/g. Se aislaron nueve cepas presuntivas de E. coliO157:H7 de 16 muestras, las cuales fueron descartadas con la técnica PCR-TR. No se detectaron genes de virulencia. La contaminación microbiana de la carne de res podría indicar la presencia de patógenos provenientes de fuentes fecales. Por ello es importante incorporar programas de inocuidad para garantizar la calidad de estos productos.

Palabras clave: Inocuidad alimentaria, NOM-194-SSA1-2004, carne de res.

 

Introducción

Las enfermedades de transmisión alimentaria (ETA) constituyen uno de los principales problemas de Salud Pública en el mundo. La incidencia de éstas se relaciona con deficiencias higiénico-sanitarias de los alimentos durante su procesamiento, o por el uso de materia prima contaminada.¹ Los productos cárnicos de origen vacuno pueden contaminarse en cualquiera de las etapas de procesamiento, ya que este tipo de ganado es un reservorio natural de microbiota intestinal y patógenos para el humano, por lo que sus heces son fuente significativa de microorganismos.^2,3 Así, la carne fresca puede resultar contaminada en el ambiente del rastro al momento del sacrificio, por lo que los agentes patógenos pueden permanecer en la superficie de la carne o penetrar con algún utensilio en el tejido muscular.⁴ La NOM-194-SSA1-2004 es el único instrumento para verificar la inocuidad de la carne bovina en México, y se limita a inspeccionar E. coli como microorganismo indicador de contaminación fecal, con un límite permisible de 1000 UFC/g en carne refrigerada y 5000 UFC/g en carne molida; además, especifica la ausencia de Salmonella en 25g de carne.⁵ Sin embargo, se ha descrito un grupo de cepas de E. coli enteropatógenas, que son responsables de un elevado número de infecciones gastrointestinales,⁶ en el que el serotipo de E. coli O157:H7 es considerado como uno de los principales patógenos relacionados con brotes por el consumo de carne contaminada, principalmente en poblaciones rurales de Estados Unidos de América y Escocia, y en países con patrones estacionales muy claros, como Australia.⁷ Actualmente se establece que la carne de res ofrece un ambiente altamente nutritivo a la microflora contaminante, pudiendo satisfacer las necesidades básicas para su persistencia y crecimiento.⁸

Escherichia coli 0157:H7 pertenece al grupo de bacterias enterohemorrágicas productoras de toxinas que ocasionan colitis hemorrágica. La toxi-infección se caracteriza por dolor abdominal, diarrea acuosa con sangre y poco o nada de fiebre. Algunas personas infectadas (sobre todo cuando ocurre en los niños) pueden desarrollar el Síndrome Urémico Hemolítico (SUH), una enfermedad grave en humanos, caracterizada por insuficiencia renal y anemia temporal.⁹ En México, no existen registros que asocien los casos de SUH con infecciones por E. coli O157:H7, situación que aún no se ha explicado.¹⁰ Por otra parte, el Sistema Único de Información para la Vigilancia Epidemiológica considera las infecciones por este patógeno dentro de las afecciones intestinales mal definidas, sin precisar información sobre la incidencia del microorganismo.¹¹ La baja dosis infectiva de este agente patógeno (10-100 UFC) lo convierte en un riesgo de relevancia para la salud pública.¹² Aunque la mayoría de los productos cárnicos deben estar adecuadamente cocinados antes de su consumo, la presencia de E. coli O157: H7 en la carne pone a los consumidores en situación de riesgo, ya que este patógeno puede persistir por deficiencias o preferencias de cocción.¹³ Además, puede ocurrir una contaminación cruzada de manos, utensilios o superficies a productos que no recibirán tratamientos térmicos antes de su consumo.¹⁴ Por todo lo anterior, el objetivo de este trabajo fue detectar y cuantificar la presencia de Escherichia coli en carne de res que se comercializa en el mercado municipal de Culiacán, Sinaloa, como parámetro de calidad microbiológica según la Norma Oficial Mexicana NOM-194-SSA1-2004, así como caracterizar los aislamientos por detección de genes de virulencia y presencia del serotipo patógeno E. coli O157:H7, para determinar si la carne de res representa un factor de riesgo para la salud de los consumidores de este tipo de productos.

 

Material y métodos

Toma de muestras

Se seleccionaron 18 de los 36 locales que se dedican al comercio de carne en el mercado municipal de Culiacán; la selección se hizo de acuerdo con la distribución total de los locales, con el fin de obtener muestras representativas de todo el mercado (Figura 1). Las muestras de carne se recolectaron en dos periodos de muestreo, en julio (verano) y octubre (otoño) de 2008, respectivamente. En cada periodo se tomaron tres muestras de cada local comercial seleccionado, con una frecuencia de cuatro días. Así, se obtuvieron 108 muestras para analizar. La carne fue manipulada por el vendedor y depositada en una bolsa plástica de manejo comercial por cada local. Posteriormente, las muestras se colocaron en un depósito frío para su traslado al Laboratorio de Microbiología Ambiental y de Alimentos del Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo (CIAD) de Culiacán, y se procesaron en un plazo no mayor de 4 h.

 

Presencia y cuantificación de E. coli

Se utilizó la metodología propuesta en el Manual Bacteriológico Analítico (BAM, siglas en inglés).¹⁵ Se pesaron 25 g de la muestra de carne y se depositaron en una bolsa estéril con cierre hermético; se agregaron 225 ml de agua de peptona al 1%* y se agitó vigorosamente durante 5 min para liberar los microorganismos de la matriz cárnica hacia el caldo de cultivo. Finalmente se tomó 0.1 ml del caldo de cultivo y se inoculó en agar cromogénico ECC** utilizando la técnica de extensión en placa. Las placas se incubaron por 24 h a 45°C, finalmente se realizó la cuantificación de E. coli con base en la aparición de colonias medianas (2-3 mm de diámetro) con coloración azul, tal como la describe el fabricante del medio de cultivo. Para cada ensayo se empleó un testigo positivo de E. coli O157:H7 CECT 4076, para evaluar la eficacia de la técnica utilizada; además, se utilizó un testigo blanco (agua destilada estéril) para determinar posibles fuentes de contaminación cruzada durante el procedimiento.

 

Aislamiento de cepas E. coli O157

Se pesaron 25 g de la muestra de carne en una bolsa estéril y se le adicionaron 225 ml del caldo selectivo E. coli, el cual fue modificado con el antibiótico Novobiocina (n) (mEC+n)*** a una concentración de 20 μg/ ml. El cultivo se agitó vigorosamente durante 5 min y se incubó a 37°C por 24 h. Transcurrido este tiempo, se tomó una porción del caldo de cultivo con un asa de platino estéril y se inoculó por estría cruzada en el agar cromogénico BBL O157,** el cual se complementó con telurito de potasio a una concentración de 2.5 mg/L. Las placas se incubaron a 37°C por 24 h; posteriormente se seleccionaron colonias típicas del serotipo E. coli O157 (colonias color malva o lila, según el fabricante) y se purificaron por pases sucesivos sobre el mismo agar cromogénico. Las cepas presuntivas se cultivaron en caldo de soya y tripticaseína (TSB, siglas en inglés) y se almacenaron en glicerol al 40% por triplicado a -20°C para su confirmación según los análisis descritos a continuación.

 

Detección del gen fliCH7 por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Para este proceso, se utilizó la metodología propuesta por Cagney et al.¹⁶ La obtención del ADN de cada cepa presuntiva se llevó a cabo por lisis celular de 1.5 ml de cultivo bacteriano depositados en un tubo eppendorf y llevado a choque térmico de agua a 100° C por 1 min, seguido por enfriamiento en hielo. La mezcla de reacción de PCR fue de 50 μl, de los cuales 5 μl fueron de ADN bacteriano. Se utilizó un par de iniciadores para la detección del gen que codifica el antígeno flagelar fliCH7 (Cuadro 1) a una concentración de 25 μM mezclados con el amortiguador de amplificación para PCR 10X libre de magnesio,**** 3 mM de MgCl₂, 100 μM de cada deoxinucleótido trifosfato (dATP, dGTP, dTTP y dCTP) y agua nanopura estéril hasta completar el volumen de reacción indicado. La amplificación se llevó a cabo en un termociclador de gradiente***** con un ciclo inicial de 2 min a 94°C y 35 ciclos de 20 s a 94°C para desnaturalización, 1 min a 57°C para hibridación, 1 min a 72°C para extensión, y un ciclo de extensión final a 72°C por 10 min. Finalmente, la reacción se estabilizó a 4°C. Los productos de PCR se separaron en geles de agarosa al 1 % (p/v) con amortiguador TAE 1X***** a 70 V y se tiñeron con bromuro de etidio (0.33 mg/ml). Los fragmentos obtenidos se visualizaron en un transiluminador de luz ultravioleta y se determinó la presencia del gen para el antígeno flagelar según el tamaño molecular esperado (Cuadro 1).

 

Detección de genes de virulencia por PCR múltiple (PCR-M)

Para la detección de genes de virulencia se utilizó también la metodología propuesta por Cagney et al.¹⁶ La mezcla de reacción de PCR fue de 50 μl, de los cuales 10 μl fueron de ADN bacteriano obtenido por lisis celular (descrito anteriormente). Se utilizaron cuatro pares de iniciadores (Cuadro 1), de los cuales la concentración del vt1 fue de 10 μM, de vt2 10 μM, de eaeA 12.5 μM y de hlyA 25 μM. Se usó un amortiguador de amplificación para PCR 1X libre de magnesio,**** 2 mM de MgCl₂, 100 μM de cada deoxinucleótido trifosfato (dATP, dGTP, dTTP y dCTP) y agua nano pura estéril hasta completar el volumen de reacción indicado. La amplificación se llevó a cabo en un termociclador de gradiente***** con un ciclo inicial de 2 min a 94°C y 35 ciclos de 20 s a 94°C para desnaturalización, 1 min a 57°C para hibridación, 1 min a 72°C para extensión y un ciclo de extensión final a 72°C por 10 min; finalmente, la reacción se estabilizó a 4°C. Los productos de PCR se separaron en geles de agarosa al 2 % (p/v) con amortiguador TAE 1X**** a 70 V y se tiñeron con bromuro de etidio (0.33 mg/ml). Los fragmentos obtenidos se visualizaron en un transiluminador de luz ultravioleta y se determinó la presencia de genes de virulencia según el tamaño molecular esperado (Cuadro 1).

 

Confirmación de E. coli O157:H7 por PCR en tiempo real (PCR-TR)

Para la confirmación por PCR en tiempo real se utilizó el sistema de detección comercial de Applied Biosystems TaqMan® para E. coli O157:H7 en un termociclador de sistema MiniOpticon.****** La mezcla de reacción de PCR-TR consistió en 15 μl de mezcla maestra EMM, 3 μl de mezcla blanco TAM (ambas incluidas en el sistema de detección) y 12 μl de ADN bacteriano obtenido por lisis (proceso descrito anteriormente). La amplificación consistió en un ciclo para la activación de la enzima Taq ADN polimerasa de 95° C por 10 min seguida de 45 ciclos de 95° C por 15 s para desnaturalización y 60° C por 1 min para hibridación y extensión. La interpretación de resultados se hizo con el software Opticon Monitor 3, utilizando como referencia el ciclo umbral #14 obtenido por el testigo positivo, de acuerdo con los dos fluorocromos; FAM (señal específica para la secuencia blanco) y VIC (señal específica para el control interno).

 

Resultados

Presencia y cuantificación de E. coli

Se determinó la presencia de E. coli en 31.5% (34/108) del total de muestras de carne analizadas, y en 72.2% (13/18) de los locales seleccionados se identificó este microorganismo en, al menos, una ocasión. La mayor incidencia de E. coli en carne de res se presentó en el periodo de verano con 48.1% (26/54) de muestras positivas; mientras que en otoño, sólo 14.8% (8/54) de las muestras resultaron contaminadas. Los niveles de contaminación por E. coli oscilaron entre 100 y 700 UFC/g de carne de res evaluada. Solamente tres muestras mostraron la más alta concentración de la bacteria (700 UFC/g) y correspondieron a tres locales diferentes (9, 12 y 30); sin embrago, las muestras se obtuvieron en verano en la misma fecha de muestreo (M2). Los locales 15 y 32 resultaron contaminados solamente en una ocasión y con los niveles de contaminación más bajos (100 UFC/g) (Cuadro 2).

 

Aislamiento de cepas de E. coli O157

Se aislaron 28 cepas de E. coli O157 a partir de 47% (13/34) de las muestras de carne que resultaron positivas a E. coli genérica. El 50% (9/18) de los locales seleccionados mostraron contaminación por esta bacteria. En verano se detectó esta bacteria en nueve locales seleccionados, mientras que en otoño sólo dos locales mostraron este tipo de contaminación. La mayor incidencia de carne contaminada ocurrió en el periodo de verano, con 81.3% (13/16) de muestras contaminadas. El mayor número de aislamientos también ocurrió en verano, con 64.3% (18/28) del total de cepas obtenidas. Los locales 5 y 22 fueron los únicos que resultaron contaminados con E. coli O157 en ambos ciclos de muestreo (Cuadro 3).

 

Confirmación de antígeno flagelar H7 por PCR

Las cepas aisladas fueron sometidas al análisis por PCR, para determinar la presencia del gen fliCH7 que codifica para el antígeno flagelar H7. Los resultados obtenidos de esta prueba mostraron la amplificación de un fragmento de ADN inespecífico de aproximadamente 550 pb, en lugar del fragmento de 625 pb esperado en 32.1% (9/28) de las cepas aisladas (Cuadro 3).

 

Confirmación de E. coli O157:H7 por PCR en tiempo real (PCR-TR)

Para confirmar el serotipo de E. coli O157:H7 se utilizó la técnica de PCR-TR. Las cepas que se sometieron a esta prueba fueron aquéllas que mostraron un fragmento de amplificación del gen fliCh7. Como no se obtuvieron cepas que amplificaran el fragmento esperado, se sometieron a esta prueba las nueve cepas que produjeron un fragmento inespecífico, con el fin de confirmar que estos aislamientos no correspondían a E. coli O157:H7. Los resultados de la PCR-TR mostraron que todas las cepas evaluadas fueron negativas, por lo que no se confirmó la presencia de esta bacteria en las muestras de carne de res obtenidas del mercado municipal (Figura 2).

 

Detección de genes de virulencia por PCR múltiple

Ninguna de las cepas evaluadas produjo fragmentos de amplificación para la determinación de genes de virulencia (Cuadro 3).

 

Discusión

En el presente trabajo se determinó la calidad microbiológica de la carne de acuerdo con la presencia y cuantificación de E. coli. Los resultados indican que los niveles de contaminación por este microorganismo en la carne de res evaluada se encuentran dentro de límites permisibles (1000 UFC/g de carne refrigerada) según las especificaciones que establece la NOM-194-SSA1-2004. Por su parte, Hernández et al.¹⁷ evaluaron la calidad microbiológica de la carne de canal en un rastro municipal de Hidalgo, México, y encontraron que los niveles de E. coli registrados en ese estudio representaban un riesgo sanitario para los consumidores. Es frecuente identificar E. coli en niveles bajos en las áreas de procesamiento de productos cárnicos y durante su distribución, debido a que esta bacteria es parte de la flora entérica normal del ganado bovino.¹⁸ Sin embargo, es importante considerar que el hallazgo de E. coli indica contaminación de origen fecal y es considerada como un indicador de mala calidad del alimento por un manejo inadecuado, ya sea durante su procesamiento o durante su mercadeo; además, permite sospechar la presencia de microorganismos patógenos provenientes del mismo origen.¹⁹ Los resultados mostraron un efecto estacional, ya que se obtuvo mayor incidencia de E. coli en verano que en otoño, con 48.1% y 14.8% de muestras positivas, respectivamente. Por su parte, Chapman et al.²⁰ y McEvoy et al.²¹ también registraron una alta incidencia de E. coli O157:H7 en venta de carne al menudeo y en superficie de carne de res en canal, respectivamente, durante primavera y verano, ya que en verano, la temperatura medio ambiental propicia condiciones que favorecen el desarrollo microbiano; además, la carne per se constituye una excelente fuente de nutrimentos y humedad que permite la permanencia y multiplicación de muchos microorganismos patógenos para el humano.²² En este estudio también se planteó la identificación de E. coli O157:H7 en las muestras de carne de res evaluadas, debido a que comparte el hábitat primario con E. coli; sin embargo, no se pudo determinar la presencia del patógeno. Algunos trabajos realizados en México demuestran la presencia de E. coli O157:H7 en carne de res.^3,23,24 Por su parte, Varela-Hernandez et al.²³ registraron E. coli O157:H7 en 2.7% (7/258) de las muestras analizadas. La prevalencia del microorganismo en estos trabajos es comparable con la registrada en Francia, Reino Unido, Suiza y Argentina, con 0.12%, 1.1%, 2.3% y 3.8%, respectivamente.^20,25-27 Aunque la prevalencia parezca ser baja, este microorganismo patógeno representa un gran riesgo para la salud; en Estados Unidos de América ocurrieron 350 brotes por infección de E. coli O157:H7 entre 1982 y 2002, de los cuales 52% fueron de origen alimentario.²⁸ La carne de res contaminada sigue siendo el principal alimento implicado, como se informó en el brote epidemiológico ocasionado por esta bacteria en noviembre de 2009, y en el que resultaron infectadas 26 personas a lo largo de ocho estados.²⁹ En México, no existen registros de brotes epidemiológicos ocasionados por E. coli O157:H7; sin embargo, se debe establecer una rutina de diagnóstico adecuado de enfermedades. De ahí la importancia de la detección oportuna y precisa de este microorganismo, ya que generalmente se encuentra en bajas concentraciones, son fácilmente superados por la flora de competencia, su aislamiento toma mucho tiempo y depende de la sensibilidad de los medios y técnicas utilizados.³⁰ En este trabajo se utilizó un enriquecimiento selectivo (mEC+n) y posteriormente un agar cromogénico (CHROMagar O157) que ha mostrado una alta sensibilidad y especificidad en el reconocimiento de cepas de E. coli O157.³¹ Los resultados confirmaron la presencia de 16 cepas correspondientes a este serotipo, en las cuales no se logró identificar el gen fliCh7 que corroboraba el serotipo O157:H7. Sin embargo, se detectó un fragmento de amplificación inespecífico en nueve de estas cepas. Wang et al.³² estudiaron la diversidad de los genes que codifican para los antígenos flagelares H7 (fliC) en cepas de E. coli y demostraron que la diferencia entre 10 secuencias analizadas fue de 0.06% a 3.12%, concluyendo así que la especificidad de los iniciadores utilizados en la reacción de PCR se ve afectada y recomiendan complementar los resultados con pruebas adicionales. En este sentido, las nueve cepas que mostraron este comportamiento fueron evaluadas por la técnica PCR-TR para determinar si correspondían al serotipo O157:H7. Esta técnica ha mostrado ser menos laboriosa y más sensible y rápida.³³ Los resultados de esta prueba demostraron que las cepas evaluadas no correspondían al serotipo O157:H7. Sin embargo, se han registrado serotipos de E. coli No-O157:H7 portadores de genes de virulencia capaces de ocasionar enfermedades en humanos,³⁴ por lo que las nueve cepas antes analizadas fueron sometidas a la prueba de PCR-M. Con los resultados obtenidos de esta prueba no se logró determinar la presencia de genes de virulencia, por lo que podría suponerse que las cepas de E. coli encontradas en las muestras de carne no son patógenas para el humano. Debido a los hallazgos encontrados en este trabajo es posible concluir que la calidad microbiológica de la carne de res que se comercializa en el mercado municipal de Culiacán, Sinaloa, se encuentra dentro de las especificaciones establecidas en la NOM. Aun así, la presencia de E. coli en alimentos sugiere una contaminación de origen fecal y puede representar un riesgo para la salud pública. Por ello se recomienda implementar programas de buenas prácticas higiénicas y de manufactura que permitan un control sanitario estricto y constante para asegurar la inocuidad de los alimentos, y así minimizar el riesgo de enfermedad que podría representar el consumo de productos cárnicos.

 

Agradecimientos

Los autores agradecen a la M. en C. Cecy Berenice Núñez Sánchez, a la Q.F.B. Célida Martínez y a la I.B.T. Gabriela Gaxiola, su colaboración técnica . Este trabajo de investigación fue financiado por el Fondo Sectorial de la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación-Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (SAGARPA-CONACYT) 2006-1 proyecto 48134.

 

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Notas

*BD Difco ®, Estados Unidos de América.

**CHROMagar®, Francia.

***BD Difco ®, Estados Unidos de América.

****Promega®, Estados Unidos de América.

*****Eppendorf, Estados Unidos de América.

******BIO-RAD, Estados Unidos de América.