Artículos

 

Biomasa, actividad enzimática y compuestos nitrogenados en plantas de frijol ejotero bajo diferentes dosis de potasio*

 

Biomass, enzymatic activity and nitrogen compounds in snap bean plants under different potassium doses

 

Esteban Sánchez Chávez¹, Juan Manuel Soto Parra¹, Juan Manuel Ruiz Sáez² y Luis Romero Monreal²

 

¹ Facultad de Ciencias Agrotecnológicas, Universidad Autónoma de Chihuahua. Ciudad Universitaria s/n (Campus Universitario 1). 31310 Chihuahua, Chihuahua, México.

² Departamento de Fisiología Vegetal, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada. Granada, España.

 

Autor para correspondencia:
ecsanchez@uach.mx

 

* Recibido: Mayo de 2005
Aceptado: Enero de 2006

 

RESUMEN

Uno de los principales factores que regulan la producción de biomasa, actividad enzimática y cantidad de compuestos nitrogenados en raíces y hojas de plantas de frijol ejotero (Phaseolus vulgaris L.) es el estado nutricional de K, por lo que en esta investigación se estudiaron las respuestas de estos procesos fisiológicos a diferentes concentraciones de K. Las plantas de frijol ejotero cv. Strike se establecieron en cámara de cultivo en la primavera de 2000 en Granada, España, bajo condiciones ambientales controladas: humedad relativa de 60–80%, temperatura 28/22 °C (día/noche), fotoperiodo de 16/8 h (día/noche) y una intensidad luminosa de 350 µmol m^–2 s^–1. El K fue aplicado a la solución nutritiva en la forma de KOH en dosis crecientes: K1= 1.0 mM, K2= 2.0 mM, K3= 4.0 mM, K4= 8.0 mM, K5= 12.0 mM y K6= 16.0 mM de K+. Los resultados indicaron que tanto la deficiencia como la toxicidad de K⁺ ejercieron un efecto sobre el metabolismo nitrogenado similar al que produce el estrés por N. Es decir, bajo condiciones deficientes de K⁺ (K1 y K2) se observó una disminución de las enzimas implicadas en la asimilación de N, tales como: nitrato reductasa, nitrito reductasa, glutamina sintetasa, glutamato sintasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa, resultando en bajas concentraciones de aminoácidos, proteínas, N orgánico y N total en las plantas de estos tratamientos, explicándose así una reducción en la producción de biomasa de 15% con respecto al tratamiento K3. Con respecto a los tratamientos elevados de K⁺, se observó que las plantas de frijol tratadas con K4, K5 y K6 se caracterizaron por presentar concentraciones elevadas de NO₃^– y NH₄⁺, mayor asimilación de N y las máximas concentraciones de compuestos nitrogenados, sin embargo, esto no se vio reflejado en la producción de biomasa, sino al contrario se observó una reducción del 35% en la producción de biomasa radical y foliar. Las dosis muy por encima del óptimo, K5 y K6, se consideraron tóxicas por la disminución del crecimiento de la parte radical y parte aérea, siendo esta última la más afectada.

Palabras clave: Phaseolus vulgaris L., asimilación de nitrógeno, nutrición.

 

ABSTRACT

One of the main factors regulating biomass production, enzymatic activity and the amount of nitrogen compounds in roots and leaves of snap beans (Phaseolus vulgaris L.) is the nutritional status of K, hence the objective of this research was to understand the effect of different potassium concentration on these physiological plant responses. The experiment was carried out with the snap bean cv. Strike in growth chambers during the spring of 2000 in Granada, Spain. The controlled environment conditions were: relative humidity 60–80%, temperature 28/22 °C (day/night), photoperiod 16/8 h (day/night) and luminosity of 350 µmol m^–2 s^–1. Potassium was applied as nutrient solution of KOH in increasing concentrations: K1= 1.0 mM, K2= 2.0 mM, K3= 4.0 mM, K4= 8.0 mM, K5= 12.0 mM, and K6=16.0 mM of K⁺. Results indicated that both deficiencies and excess of K affected the nitrogen metabolism in the same way that the effect caused by N stress. Under K⁺ deficiencies (K1 and K2) there was a decrease in the content of enzymes related to N assimilation such as nitrate reducíase, nitrite reductase, glutamine sintetase, glutamine sintase, and phosphoenolpyruvate carboxylase, causing in the plant low concentrations of amino acids, proteins, nitrogen organic compounds, all of which diminished biomass production in 15% when compared to K3. Treatments with higher concentrations of K⁺ such as K4, K5 and K6 had the greater concentrations of NO₃^– and NH₄⁺, increased assimilation of N and higher concentration of nitrogen compounds. However, these increments were not related to biomass, acummulation, on the contrary, dry weight of roots and shoots were diminished in 35% due to the toxic effects observed in treatments K5 and K6. Therefore, K⁺ doses above the optimal were detrimental for root and shoot growth, being the shoot more diminished.

Key words: Phaseolus vulgaris L., nitrogen assimilation, nutrition.

 

INTRODUCCIÓN

Al igual que el N, el K⁺ es el nutriente que se necesita en concentraciones elevadas para un adecuado crecimiento de las plantas, oscilando su concentración en un rango de 2 a 5% de materia seca de la planta, tanto en partes vegetativas, frutos o tubérculos (Daliparthy et al., 1994; Marschner, 1997). El potasio juega un papel esencial en el crecimiento y metabolismo de la planta, puesto que actúa activando enzimas (Evans y Sorger, 1966), funciona como un osmorregulador para mantener la presión de turgencia de los tejidos (Kaiser, 1982), regula la apertura y cierre estomático de los estomas (Humble y Raschke, 1971), y equilibra la carga de los aniones (Streeter y Barta, 1984). Una deficiencia de K⁺ puede disminuir la fotosíntesis de la planta mediante la reducción del área foliar (Huber, 1985) y la fijación neta de CO₂ (Ozbun et al., 1965).

Los macronutrientes, N y K⁺, están íntimamente involucrados en el metabolismo y crecimiento de las plantas, en donde estos nutrientes participan de manera conjunta en diferentes procesos bioquímicos. En el caso del nitrógeno, éste participa directamente en la síntesis de aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos y otros constituyentes celulares necesarios para el desarrollo. La asimilación de N por las plantas requiere la absorción de NO₃^–, su reducción y la conversión de NO₂^– a NH₄⁺, y la incorporación deNH₄⁺ inorgánico a compuestos orgánicos (Sivasankar y Oaks, 1996; Stitt, 1999). Los factores que influyen en la regulación de las enzimas responsables de la asimilación del N son: la etapa fenológica de la planta (Ireland y Lea, 1999); la luz/obscuridad (Migge y Becker, 1996); la concentración de sacarosa (Lam et al., 1996); la fuente nitrogenada: NO₃^– y NH₄⁺ (Ruiz y Romero, 1999); el nivel de CO² (Edwards y Coruzzi, 1989); la temperatura (Woodall et al., 1996); nutrientes (López–Lefebre et al., 2000; Ruiz y Romero, 2002), reguladores del crecimiento (Ruiz et al., 2000), productos de la asimilación de N (Padgett y Leonard, 1996) y la variabilidad genética de la especie de que se trate (Ruiz y Romero, 1998).

Por otro lado, un aporte adecuado de K⁺ puede ser necesario para el uso eficiente de la fertilización nitrogenada. Dado que el uso del N, esencialmente en la forma de NO₃^–, como fertilizante es un tema importante en la agricultura actual, ya que el NO₃^– como fertilizante es relativamente caro y si no se emplea de manera adecuada puede contribuir a la contaminación de las aguas subterráneas y superficiales a través de la lixiviación y erosión del suelo (Sisson et al., 1991), lo que ha obligado hoy en día a buscar nuevos cultivos, genotipos y sistemas de producción que hagan más eficiente el uso de los nitratos aplicados como fertilizantes.

En diferentes trabajos se ha mostrado la relación del K⁺ en la absorción, translocación y asimilación de los NO₃^– en las plantas. Rufty et al. (1981) demostraron la estrecha relación entre K⁺/NO₃^– a nivel de absorción y transporte.

Por otro lado, se ha demostrado que la ausencia de K⁺ afecta también la asimilación de NO₃^–, ya que los NO₃^– son absorbidos y en gran parte asimilados por las raíces (Foster y Jeschke, 1993; Siebrecht y Tischner, 1999). En resumen, un aporte adecuado de K⁺ incrementa la absorción y transporte de NO₃^– hacia la parte aérea y conduce a una alta acumulación de NO₃^– (Ruiz y Romero, 2000) y consecuentemente produce una elevada actividad del nitrato reductasa (NR) in vivo en hojas (Blevins et al., 1978), mientras que la actividad NR en las raíces declina con la presencia de K⁺ (Blevins et al., 1978; Foster y Jeschke, 1993). El K⁺juega un papel importante para la síntesis y activación de la NR, siendo esta considerada la enzima clave del proceso de asimilación de N (Marschner, 1997). Sin embargo, pese al efecto directo del K⁺ sobre la absorción, translocación y asimilación de NO₃^–, existe poca información sobre la relación entre estos dos nutrientes inorgánicos, los cuales son básicos para el crecimiento y desarrollo de la planta. Además, la literatura disponible está enfocada sobre el efecto que tiene la deficiencia de K⁺ sobre el metabolismo de NO₃^–, examinando solamente la relación raíz–hoja. Con base a lo anterior, el objetivo de este trabajo fue analizar la influencia de diferentes dosis de K⁺ sobre la producción de biomasa, actividad enzimática y compuestos nitrogenados en raíces y hojas de plantas de frijol ejotero cv. Strike.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Manejo del cultivo y diseño experimental

Las semillas de Phaseolus vulgaris L. cv. Strike se germinaron en una cámara a 28 °C durante 48 h. Posteriormente, las plantas de frijol ejotero fueron desarrolladas en cámara de cultivo en la primavera de 2000 en Granada, España, bajo condiciones ambientales controladas: humedad relativa de 60–80%, temperatura 28/22 °C (día/noche), fotoperíodo de 16/8 h (día/noche) y una intensidad luminosa de 350 µmol m^–2 s^–1. Las plantas crecieron en macetas individuales (25 cm de diámetro superior y 25 cm de altura) con un volumen de 8 L llenas completamente con vermiculita. Durante 30 días, antes de la aplicación de los tratamientos experimentales, las plantas recibieron una solución nutritiva completa de Hoagland (pH 6.0–6.1), la cual fue renovada cada tres días.

Posteriormente, 30 días después de la germinación, se aplicaron los diferentes tratamientos de K⁺ en la forma de KOH: K1–1.0 mM, K2= 2.0 mM, K3= 4.0 raM, K4= 8.0 mM, K5= 12.0 mM y K6= 16.0 mM de K⁺ considerándose la dosis K3 como la óptima según Carbonell–Barrachina et al. (1997). El diseño experimental consistió en la distribución completamente al azar de los distintos tratamientos y de sus repeticiones. Cada tratamiento tuvo seis repeticiones con cuatro plantas por repetición.

Muestreo vegetal

Las plantas completas fueron muestreadas a los 60 días después de germinadas, encontrándose en la etapa fenológica de completo desarrollo y madurez del fruto. Las raíces y hojas fueron lavadas tres veces con agua destilada y detergente no iónico al 1% (Wolf, 1982). Una parte del material vegetal muestreado (5 g de raíz y hoja) fue utilizado en fresco para el análisis de la nitrato reductasa (NR), nitrito reductasa (NiR), glutamina sintetasa (GS), glutamato sintasa (GOGAT), fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPCasa), nitratos (NOy), amonio (NH₄⁺), aminoácidos y proteínas. La producción de biomasa radical y foliar se obtuvo como un promedio de cada órgano estudiado en base a peso seco.

Análisis vegetal

Para la determinación de las actividades enzimáticas NR, NiR y GOGAT, tanto en raíces como en hojas, se utilizó un medio de extracción optimizado con base en los métodos empleados por Farnden y Robertston (1980), Groat y Vanee (1981), Lillo (1984), Kaiser y Lewis (1984), y Singh y Srivastava (1986).

Extracción de las enizmas NR, NiR y GOGAT. Una cantidad de 1 g de material vegetal fresco (hojas y raíces) fue homogeneizado en un tampón fosfato (50 mM K₂HPO₄/ KH₂PO₄, pH 7.5) que contenía 2 mM de EDTA, caseína soluble al 1.5% (p/v), 2 mM de DTT y PVP soluble al 1% (p/v). El homogenado resultante fue filtrado y centrifugado a 5000 rpm durante 5 min; en seguida el sobrenadante obtenido fue centrifugado a 15000 rpm durante 20 min, obteniéndose de esta manera el extracto enzimático utilizado para medir las actividades NR, NiR y GOGAT.

Ensayo de la actividad NR. La medición de la actividad NR se realizó siguiendo la metodología de Kaiser y Lewis (1984). En un volumen final de 2 mL, la mezcla de reacción contenía: 0.6 mL de tampón fosfato (100 mM de K₂HPO₄/KH₂PO₄, pH 7.5), 0.2 mL de KNO₃ 100 mM, 0.2 mL de cisteina 10 mM, 0.2 mL de NADH 2 mM, y 0.6 mL de extracto enzimático. La actividad NR fue detenida por la adición de 0.1 mL de acetato de zinc 1 M después de la incubación de las muestras en oscuridad a 30 °C durante 30 min. Posteriormente, y con el fin de eliminar el precipitado formado tras la adición del acetato de zinc, se centrifugaron las muestras a 2000 rpm durante 15 min.

Los NO₂^– del sobrenadante procedente de la última centrifugación fueron cuantificados por el método de Hageman y Hucklesby (1971). Además, se preparó un blanco, el cual contenía todos los reactivos y en el que se sustituyó el volumen del extracto enzimático por tampón fosfato. La actividad NR se expresó como µmol de NO₂^– formados por mg proteína^–1 min^–1.

Ensayo de la actividad NiR. La medición de la actividad de NiR fue determinada a través de la desaparición de los NO₂^– del medio de reacción (Lillo, 1984). El medio de reacción contenía 0.25 mL de tampón fosfato (50 mM disuelto K₂HPO₄/KH₂PO₄, pH 7.5), 50 µL de KNO_2^– 20 mM, 75 µL de dimetil–viológeno 5 mM, 75 µL de ditionito sódico 145 mM disuelto en NaHCO₃ 300 mM, y 50 µL de extracto enzimático. Después de una incubación en oscuridad a 30 °C durante 30 min, la mezcla de reacción se agitó vigorosamente hasta la oxidación del dimetilviológeno (variación del color azul a blanco) que conlleva la detención de la actividad NiR. Después de la adición de 5 mL de agua desionizada (Millipore RX–21), se tomó una alícuota de 1 mL y se procedió a la cuantificación de los NO₂^– no trasnformados por la actividad NiR, por el método de Hageman y Hucklesby (1971).

Se realizó un blanco que consistió en la omisión de KNO₂ en el ensayo y extracto enzimático, un estándar de KNO₂ 20 mM que consistió en la mezcla de ensayo sin extracto enzimático, y finalmente, también se realizó un control para cada muestra sin KNO₂ con el fin de determinar la cantidad de KNO₂ presente en el extracto enzimático. La actividad NiR se expresó como µmol NO₂^– transformados por mg proteína^–1 min^-1.

Ensayo de la actividad GOGAT. La actividad GOGAT fue ensayada espectrofotométricamente a 30 °C por medio de la oxidación de NADH a una longitud de onda de 340 nm, esencialmente como indican Groat y Vanee (1981), y Singh y Srivastava (1986). La disminución de la absorbancia lineal, al menos durante 10 min, fue registrada durante 5 min. La mezcla de reacción consistió en 0.75 mL de tampón fosfato (50 mM K₂HPO₄/KH₂PO₄, pH 7.5) que contenía mercaptoetanol al 0.1% (v/v) y 1 mM de EDTA, 0.2 mL de 2–oxoglutarato 18.75 mM, 0.1 mL de amino–oxiacetato 15 mM, 0.1 mL de NADH 1.5 mM, 0.15 mLde extracto enzimático, y finalmente 0.2 mL de L–glutamina 75 mM que inicia la reacción enzimática. Se hicieron dos controles, el primero sin 2–oxoglutarato y el segundo sin L–glutamina, con el fin de corregir la oxidación endógena del NADH. La actividad GOGAT se expresó como fimol NADH oxidados por mg proteína^–1 min^–1.

Extracción y ensayo de la actividad GS. La extracción de la enzima GS se realizó siguiendo el método de Rees et al. (1995). Para ello, se homogeneizó una cantidad de 0.5 g de material vegetal fresco con 5 mL de tampón HEPES 0.2 M, pH 7.9. El homogenado se centrifugó a 16000 rpm durante 20 min, y el sobrenadante obtenido se utilizó para medir la actividad GS.

El análisis de la actividad GS se basó en el descrito por Slawky y Rodier (1988). La mezcla de reacción contenía: 0.6 mL de MgC12 50 mM, 0.2 mL de EDTA–Na 5 mM, 0.4 mL de glutamato potásico 100 mM, 0.15 mL acetato amónico 50 mM, 0.4 mL de extracto enzimático, y 0.25 mL de ATP 8 mM que inició la reacción. La mezcla de reacción fue incubada en luz en un baño de agua a 30 °C durante 15 min, tras lo cual se inhibió la reacción enzimática por la adición de 0.25 mL de H₂SO₄ 1 N. La mezcla se centrifugó (11000 rpm, 2 min), y del sobrenadante resultante se tomó 50 µL para cuantificar el Pi procedente de la utilización enzimática del ATP.

La concentración del Pi fue determinada usando el método colorimétrico del vanadomolibdofosfórico (Hogue et al., 1970), a una longitud de onda de 430 nm y frente a una curva patrón de K₂HPO₄ (5–100 µM).

Se realizó un blanco que consistió en la omisión del extracto enzimático y del glutamato, siendo sustituidos los volúmenes correspondientes por tampón HEPES. La actividad GS se expresó como nmol Pi mg proteína^–1 min^–1.

Extracción y ensayo de la actividad PEPCasa. La extracción y actividad de la PEPCasa se realizó siguiendo el método de Vanee y Stade (1984), modificado por Ocaña et al. (1996). Se homogeneizó 0.5 g de material vegetal fresco en 5 mL de tampón maleico–KOH 100 mM, pH 6.8, que contenía 100 mM de sacarosa, B–mercaptoetanol al 2% (v/v), y etilenglicol al 20% (v/v). A continuación el material homogeneizado se centrifugó a 4500 rpm durante 5 min, desechándose el residuo y sometiendo al sobrenadante a una segunda centrifugación de 16000 rpm durante 20 min. El sobrenadante obtenido en la última centrifugación se utilizó para determinar la actividad PEPCasa.

La actividad enzimática PEPCasa se determinó espeetrofotométrieamente por oxidación del NADH a una longitud de onda de 340 nm durante 3 min, adicionando 25 µL de extracto enzimático a 0.975 mL de tampón bicina–KOH 0.1 M, pH 8.5 que contiene 10 mM de NaHCO₃, 5 mM de MgCI₂, 0.2 mM de NADH, y 2 mM de PEP.

Se preparó un blanco que consistió en la omisión del extracto enzimático en el ensayo, el volumen correspondiente fue sustituido por tampón bicina–KOH. La actividad PEPCasa se expresó como µmol NADH oxidados mg proteína^–1 min^–1.

Determinación de aminoácidos y proteínas solubles.

Los aminoácidos y las proteínas solubles se cuantificaron siguiendo los métodos propuestos por Yemm y Cocking (1955) y Bradford (1976), respectivamente.

Se homogeneizó una cantidad de 0.5 g de material vegetal fresco (raíces y hojas) con 5 mL de tampón fosfato (50 mM K₂HPO₄/KH₂PO₄, pH 7.0). El material homogeneizado fue filtrado y centrifugado a 10000 rpm durante 15 min, resultando un sobrenadante que fue utilizado para la cuantificación de estos compuestos nitrogenados. Todos estos procedimientos fueron llevados a cabo a una temperatura de 0 a 4 °C.

Para la cuantificación de los aminoácidos solubles, se adicionó 0.1 mL de extracto a 1.5 mL de reactivo de ninhidrina [1:1 (v/v) cloruro de estaño (80 mg de cloruro de estaño disueltos en 50 mL de tampón citrato 200 mM, pH 5): ninhidrina (2 g de ninhidrina disueltos en 50 mL de etilenglicol)], y esta mezcla se introdujo a 100 °C durante 20 min. A continuación y una vez enfriada la mezcla se le añadió 8 mL de propanol al 50%. Pasados 30 min, se procedió a la lectura de las muestras a una longitud de onda de 570 nm, frente a curva patrón de glicina (solución madre de glicina: 10 mg/50 mL).

En la cuantificación de las proteínas solubles se tomó 0.1 mL de sobrenadante y se adicionó a 0.9 mL de tampón fosfato (50 mM K₂HPO₄/KH₂PO₄, pH 7.0) y a 5 mL de azul cromassie (Cromassie al 10% (p/v) más Etanoi del 96% al 5% (v/v) + H₃PO₄ del 85% al 10% (v/v). Transcurridos 20 min, las muestras se midieron colorimétricamente a una longitud de onda de 595 nm, frente a una curva patrón de albúmina (solución madre de albúmina: 10 mg/50 mL). La concentración de aminoácidos y proteínas solubles se expresaron como mg g^–1 de peso fresco.

Determinación de las distintas formas nitrogenadas.

Las concentraciones de NO₃^– y NH₄⁺ fueron analizadas a partir de una extracción acuosa del material seco. El análisis de los NO₃^– se realizó siguiendo el método de Cataldo et al. (1975). A 100 µL de la extracción acuosa se le añadió 0.4 mL de una solución al 10% (p/v) de ácido salicílico en ácido sulfúrico al 96%, y 9.5 mL de NaOH 2 N. La concentración de N₃^– se cuantificó por colorimetría a una longitud de onda de 410 nm frente a una curva patrón de KNO₃ (50–500 ug/mL). Para el NH/ se tomó un volumen de 100 µL de la extracción acuosa, y la concentración de esta forma nitrogenada se determinó siguiendo el método de Krom (1980). Las concentraciones de NO₃^– y de NH₄⁺ se expresaron como mg g^–1 peso de materia seca.

En relación con el análisis de N orgánico (Norg), se sometió a 0.15 g de material seco a un proceso de mineralización. A 100 µL del mineralizado se le añadieron 1 mL del reactivo A [8.5% (p/v) de salicilato sódico más 0.06% (p/v) de nitroprusiato sódico] y 1 mL del reactivo B [4% (p/v) de NaOH más 0.625% (p/v) de dicloroisocianurato sódico], y transcurridos 45 min se procedió a la medición colorimétricamente a una longitud de onda de 630 nm, frente a una curva patrón de (NH₄)₂SO₄ (0–20 µg/mL) (Krom, 1980). La concentración de N orgánico se expresó como mg g^–1. La concentración de N total (Nt) se obtuvo mediante la suma de las concentraciones de NH₄⁺, NO₃^– y de N orgánico, expresándose como mg g^–1 de materia seca.

Análisis estadístico

Todos los datos fueron sometidos a un análisis de varianza. Las diferencias entre las medias de los tratamientos fueron comparadas utilizando la prueba de la Diferencia Mínima Significativa (DMS) al 0.05% (SAS, 1987). Los niveles de significancia están representados por * p<0.05, ** a p<0.01, *** p<0.001 y NS como no significativo.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El potasio (K⁺) junto con el nitrógeno (N), es uno de los elementos que mayor influencia tiene sobre el crecimiento y desarrollo de la planta (Shuman, 1994; Pettigrew y Meredith, 1997). Los tratamientos de K⁺ afectaron significativamente la producción de biomasa radical (p< 0.01) y foliar (p<0.01) (Figura 1). En lo que se refiere a la producción de biomasa foliar, el tratamiento K3, fue el que presentó el mayor valor, con incrementos de 36 y 15%, con relación a los mínimos valores presentados en K1 y K6 respectivamente, mientras que la producción de biomasa radical obtuvo su máximo valor en K1, con un incremento del 35% con relación a K6 (Figura 1).

Cabe resaltar que la aplicación de 4.0 mM de K (K3) y en menor grado la dosis de 8.0 mM (K4) resultaron ser los tratamientos óptimos para una eficaz producción de biomasa radicular y foliar en las plantas de frijol ejotero cv. Strike, mientras que los tratamientos por debajo de los óptimos (Kl y K2), se consideraron dosis deficientes de K⁺, caracterizándose por mayor crecimiento radicular y reducido crecimiento de la parte aérea. Las dosis por encima del óptimo, K5 y K6, se consideraron tóxicas por la disminución del crecimiento de la parte radicular y parte foliar, siendo esta última la más afectada.

Un adecuado aporte de K⁺ es necesario para el uso eficiente de la fertilización nitrogenada (Sisson et al., 1991; Ruiz y Romero, 2002). Diferentes trabajos han mostrado la implicación del K⁺ en la absorción, translocación y asimilación de NO₃^– en las plantas (Siebrecht y Tischner, 1999). Rufty et al. (1981) demostraron una relación estrecha entre la absorción y transporte de K⁺ NO₃^– . Se ha comprobado que la limitación de K⁺ afecta la asimilación de NO₃^– y y el lugar donde se realiza este proceso (Foster y Jeschke, 1993; Siebrecht y Tischner, 1999). Un adecuado aporte de K⁺ incrementa la absorción y transporte de NO₃^– hacia la parte aérea, lo que produce un aumento de la disponibilidad de NCy induciéndose la actividad de la NR en hojas (Blevins et al., 1978; Ruiz y Romero, 2000). Por el contrario, cuando el K⁺ es limitante se induce la translocación de NO₃^– hacia fuera de las hojas produciéndose su asimilación preferencialmente en las raíces (Blevins et al, 1978; Foster y Jeschke, 1993).

Sin embargo, y pese al efecto directo existente del K⁺ sobre la absorción, translocación y asimilación de NO₃^–, hay poca información disponible sobre la relación entre estos nutrientes inorgánicos cuando el K⁺ sobrepasa los niveles óptimos. En esta investigación, los niveles de NO₃^–en raíces y hojas (p<0.01) (Figura 2) mostraron una respuesta lineal a la fertilización de K⁺, con las máximas concentraciones registradas en el tratamiento K6, con incrementos de 47 y 26% respectivamente en relación con los valores mínimos presentados en el tratamiento K1. Estos resultados en principio concuerdan con el sinergismo K⁺–NO₃^– que ha sido descrito ampliamente (Rufty et al., 1981), definiendo al K⁺ como un catión acompañante de los NO₃^– en la absorción (Blevins, 1985; Rufty et al, 1981). Sin embargo, el efecto positivo que ejerce el K⁺ sobre la translocación de NO₃^– hacia la parte aérea, no se observó debido a que los niveles de NO₃^– en las hojas fueron inferiores a los obtenidos en las raíces (Figura 2). Esto probablemente se explique ya que en la etapa tardía del ciclo de la planta en que se realizaron las determinaciones analíticas, las vainas actúan como una demanda de compuestos nitrogenados que en buena parte son proporcionados por las hojas. Una explicación alternativa podría ser la estimulación de la reducción de NO₃^– por la NR cuando su presencia (anión) es elevada lo que reduciría su acumulación (Foster y Jeschke, 1993; Siebrecht y Tischner, 1999).

La concentración de NH₄⁺ en raíces y hojas (p< 0.001) (Figura 3) fue afectada directamente por las dosis elevadas de K⁺, presentando el tratamiento K6 la máxima concentración, con incrementos del 36 y 22% respectivamente, con relación al tratamiento Kl con el que se obtuvo la mínima concentración.

Los resultados son opuestos a lo que se podría esperar ya que existió un claro efecto sinérgico del K⁺ aplicado sobre la concentración de NH₄⁺, cuando diversos autores sugieren en la mayoría de los casos, un antagonismo (Marschner, 1997; Mengel y Kirkby, 2001). Una explicación de estos resultados y que se detalla más adelante, es que el NH₄⁺ presente en raíces y hojas haya tenido su origen en la reducción de NO₃^– estimulada por la aplicación de K⁺.

El efecto de las diferentes dosis de K⁺ sobre la asimilación del N, tanto en raíces como en hojas, se mostró un incremento significativo de las enzimas NR, NiR, GS, GOGAT y PEPCasa a medida que se aumentó la fertilización con K⁺ en el medio externo, presentándose en todos los casos y en los órganos estudiados las máximas actividades en K6 y las mínimas en K1 (Cuadro 1). De todas las actividades enzimáticas implicadas en la asimilación del N quizás sea la NR, por ser la limitante de este proceso, en la que se ha estudiado de forma más intensa su relación con el K⁺. Los resultados obtenidos coinciden con los de Ruiz et al. (2000) quienes observaron en plantas de pepino, una relación directamente proporcional entre la aplicación de K⁺ y la actividad NR.

Ruiz et al. (2000) definieron al K⁺, después del N, como el factor nutricional más determinante en la inducción de esta actividad enzimática y por lo tanto de la regulación de NO₃^–, subrayando la importancia de la fertilización potásica para el crecimiento y rendimiento en el cultivo de pepino.

En definitiva, el K⁺ podría actuar de dos formas sobre la reducción de NO₃^–: 1) Estimulando la absorción su translocación hacia la parte aérea, lo que aumentaría su disponibilidad en este órgano y por lo tanto la actividad NR, 2) Induciendo directamente a la actividad NR. Los resultados sugieren una acción indirecta del K⁺ induciendo a la actividad NR a través del incremento de la disponibilidad de NO₃^–.

Otra actividad enzimática implicada en el metabolismo nitrogenado y que ha sido relacionada con la disponibilidad de K⁺ ha sido la actividad GS. Weidner et al. (1996) mencionaron que bajo deficiencia de K⁺ la actividad GS fue significativamente reducida. El (Cuadro 1) muestra que tanto en raíces como en hojas los resultados de este trabajo concuerdan con los obtenidos por estos autores, ya que la mínima actividad GS se presentó con la aplicación de dosis bajas de K⁺. Los resultados indican que las actividades de todas las enzimas implicadas en la asimilación de N fueron muy superiores en hojas respecto a las obtenidas en raíces por lo que el K⁺ induce que la realización del metabolismo de N se produzca en este órgano (Ruiz y Romero, 2002).

En los compuestos orgánicos nitrogenados, Weidner et al. (1996) observaron una reducción del contenido de proteína bajo condiciones limitantes de K⁺. Setzer et al. (1998) y Rúan et al. (1998) mencionaron que un aporte adecuado de K⁺ se vio reflejado en el almacenamiento de compuestos orgánicos nitrogenados. En las condiciones experimentales, en que se condujo este trabajo, la mayor concentración de aminoácidos, proteínas y N orgánico ocurrió en las raíces y las hojas de las plantas tratadas con la dosis de 16 mM de K⁺ (K6), mientras que la menor concentración se observó con la dosis de 1.0 mM de K⁺ (Kl) (Cuadro 2). El N total mostró una respuesta similar a la de los compuestos nitrogenados orgánicos tanto en raíces como en hojas.

 

CONCLUSIONES

La deficiencia y el exceso de K⁺ ejercen un efecto sobre el metabolismo nitrogenado similar al que produce el estrés por N. Bajo condiciones deficientes de K⁺ se produjo una disminución de las enzimas implicadas en la asimilación de N, y en consecuencia en concentraciones mínimas de aminoácidos, proteínas, N orgánico y N total en los tejidos de las plantas.

Las plantas de frijol tratadas con dosis altas de K⁺ se caracterizaron por presentar concentraciones elevadas de NO₃^– y NH₄⁺, mayor asimilación de N y concentración de compuestos nitrogenados, sin embargo, esto no se vio reflejado en la producción de biomasa.

Las dosis de K⁺ muy por encima del óptimo, causaron un menor crecimiento de la parte radical y parte aérea, siendo esta última la más afectada.

 

LITERATURA CITADA

Blevins, D. C. 1985. Role of potassium in protein metabolism in plants. In: Munson, R. D. (ed.) Potassium in Agriculture. American Society of Agronomy. Madison, WI. USA. p. 413–424.        [ Links ]

Blevins, D. C; Hiatt, A. J.; Lowe, R. H. and Leggett, J. E. 1978. Influence of K on the uptake, translocation, and reduction of nitrate by barley seedlings. Agron, J. 70:393–396.        [ Links ]

Bradford, M. M. 1976. A rapiad and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein–dyebinding. Anal. Biochem. 72:248–254.        [ Links ]

Carbonell–Barrachina, A. C; Burló–Carbonell, F. and Mataix–Beneyto, J. 1997. Effect of sodium arsenite and sodium chloride on bean plant nutrition (macronutrients). J. Plant Nutr. 20:1617–1633.        [ Links ]

Cataldo, D. A.; Haroon, M.; Schrader, L. E.; and Young V. L. 1975. Rapid colorimetric determination of nitrate in plant tissue by nitration of salicylic acid. Commun. Soil Sci. Plant Anal. 6:71–80.        [ Links ]

Daliparthy, J.; Barker, A. V. and Mondal, S. S. 1994. Potassium fractions with other nutrients in crops: a review focusing on the tropics. J. Plant Nutr. 17:1859–1886.        [ Links ]

Edwards, J. W. and Coruzzi G. M. 1989. Photorespiration and light act in concert to regulate expression of the nuclear gene for chloroplast and cytosolic glutamine synthetase. Plant Cell 1:241–248.         [ Links ]

Evans, H. J. and Sorger, G. J. 1966. Role of mineral elements with emphasis on the univalent cations. Annu. Rev. Plant Physiol. 17:47–77.         [ Links ]

Farnden, K. J. F. and Robertston, J. G. 1980. Methods for studying enzymes envolved in metabolism related to nitrogenase. In: Bergersen, F.J. (ed.) Methodos for evaluating biological nitrogen fixation. Jonh Wile & Sons. New York, USA. p. 265–314.         [ Links ]

Föster, J. C. and Jeschke, W. D. 1993. Effects of potassium on nitrate transport and on the contribution of the root to nitrate reduction in the whole plant. J. Plant Physiol. 141:322–328.         [ Links ]

Groat, R. G. and Vance, C. P. 1981. Root nodule enzymes of ammnonia assimilation in alfalfa (Medicago sativa L.). Plant Physiol. 32:169–204.         [ Links ]

Hageman, R. H. and Hucklesby, D. P. 1971. Nitrate reducíase. Methods Enzymol. 23: 497–503.         [ Links ]

Hogue, E.; Wilcow, G. E. and Cantliffe, D. J. 1970. Effect of soil P on phosphate fraction in tomato leaves. J. Am. Soc. Hortic. Sci. 95:174–176.         [ Links ]

Huber, S. C. 1985. Role of potassium in photosynthesis and respiration. In: Munson, R. D. (ed.) Potassium in Agriculture. American Society of Agronomy. Madison, WI. USA. p. 369–391.         [ Links ]

Humble, G.D. and Raschke, K. 1971. Stomatal opening quantitatively related to potassium transport. Plant Physiol. 48: 447–453.         [ Links ]

Ireland, R. J. and Lea, P. J. 1999. The enzymes of glutamine, glutamate, asparagine and aspartate metabolism. In: Singh B. K. (ed.). Plant amino acids. Biochemistry and Biotechnology. Marcell Dekker. New York, USA. p. 49–109.         [ Links ]

Kaiser, J. J. and Lewis, O. A. H. 1984. Nitrate reducíase and glutamine synlheíase activiíy in leaves and roots of nitrate fed Helianthus annuus L. Plant Soil 70:127–130.         [ Links ]

Kaiser, W. M. 1982. Correlaiion between changes in photosyníheíic activity and changes in total protoplast volume in leaf tissue from hygromeso–, and xerophytes under osmotic stress. Planta.154:538–545.         [ Links ]

Krom, M. D. 1980. Spectrophoiometric determination of ammonia: a study of a modified berthelot reaction using salicylate and dichloroisocyanuraíe. Analyst 105:305–316.        [ Links ]

Lam, H. M.; Coschigano, K. T.; Oliveira, I. C; Melo–Oliveira, R. and Coruzzi, G. M. 1996. The molecular genetics of nitrogen assimilation into amino acids in higher plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47:569–593.        [ Links ]

Lillo, C. 1984. Diurnal varations of nitrite reductase, glutamine syníhetase, gluíamate synthase, alanina aminotransferase and aspartate in barley leaves. Physiol. Plant. 61:214–218.        [ Links ]

López–Lefebre, L. R.; Ruiz, J. M.; Rivero, R. M.; Garcia, P. C; Sánchez, E.; and Romero, L. 2000. Role of CaC12 in ammonium assimilation in roots of tobacco plants (Nicotiana tabacum L.). J. Plant Physiol. 156:672–677.        [ Links ]

Marschner, H. 1997. Mineral nutriiion of higher plants. 2a. ed. Academic Press. San Diego CA. USA. p. 245–281.        [ Links ]

Mengel, K. and Kirkby, E. A. 2001. Principles of plant nutriiion. 5th ed. Kluwer Academic Publishers. The Netherlands, p. 849.        [ Links ]

Migge, A. and Becker, T. W. 1996. In tobacco leaves, the genes encoding ihe nitrate–reducing or the ammonium–assimilating enzymes are regulated differently by exiernal nitrogen–sources. Plant Physiol. Biochem. 34:665–671.        [ Links ]

Ocaña, A.; Cordovilla, M. P.; Ligero, F. and Lluch, C. 1996. Phosphoenolpyruvaie carboxylase in rool nodules of Vicia faba: Partial purificaiion and properties. Physiol. Plant. 97: 724–730.        [ Links ]

Ozbun, J. L.; Volk, R. J. and Jackson, W. A. 1965. Effecis of potassium deficiency on photosynthesis, respiration and the utilizaiion of photosyntheiic reduclant by mature bean leaves. Crop Sci. 5:497–500.        [ Links ]

Padgett, P. E. and Leonard, R. T. 1996. Free amino acid levels and the regulation of nitrate uptake in maize cell suspension cultures. J. Exp. Boi. 47:871–883.        [ Links ]

Pettigrew, W. T. and Merediih, W. R. Jr. 1997. Dry matter production, Nutrient uptake, and growth of cotton as affecied by potassium fertilization. J. Plant Nutr. 20:531–548.        [ Links ]

Ress, T. A. V.; Larson, T. R.; Heldens, J. W. G. and Huning, F. G. J. 1995. In situ glutamine synthetase activity in a marine unicellular alga. Development of a sensitive colorimeric assay and ihe effecis of nitrogen status on enzyme activity. Plant Physiol. 109:1405–1410.        [ Links ]

Ruan, E.; Nerson, H. and Edelsíein, M. 1998. Eggplant dry matter composition fruit yield and qualify as affected by phosphate and total salinity caused by potassium fertilizers in the irrigation solution. J. Plant Nutr. 23:431–442.        [ Links ]

Rufty, T. W. Jr.; Jackson, W. A. and Raper C. D. R. J. 1981. Nitrate reduction in roots as affected by the presence of potassium and by flux of nitrate through the roots. Plant. Physiol. 68:605–609.        [ Links ]

Ruiz, J. M. and Romero, L. 1998. Calcium impact on phosphorus and its main bioindicators: response in the roots and leaves of tobacco. J. Plant Nutr. 21:2273–2285.        [ Links ]

Ruiz, J. M. and Romero, L. 1999. Cucumber yield and nitrogen metabolism in response to nitrogen supply. Sci. Hort. (Amsterdam). 82:309–316.        [ Links ]

Ruiz, J. M. and Romero, L. 2000. Nitrogen metabolism and yield response of cucumber (Cucumis sativus L. Cv. Brunex) plants to phosphorus fertilisation. J. Sci. Food Agrie. 80:2069–2073.        [ Links ]

Ruiz, J. M. and Romero, L. 2002. Relationship between potassium fertilization and nitrate assimilation in leaves and fruits of cucumber (Cucumis sativus) plants. Assoc. Appl. Biol. 140:241–249.        [ Links ]

Ruiz, J. M.; Castilla, N.; and Romero, L. 2000. Nitrogen metabolism in pepper plants applied with different bioregulators. J. Agrie. Food Chem. 48:2925–2929.        [ Links ]

Statistical Analysis System Institute, (SAS Institute) 1987. SAS/STAT Guide for Personal Computers. Versión 6. Cary, NC. USA. p. 1028–1056.        [ Links ]

Setzer, S. J.; Locascio, M. and Hochmuth, G. J. 1998. Nitrogen and potassium application scheduling effects on drip–irrigated tomato yield and leaf tissue analysis. J. Plant Nutr. 23:91–101.        [ Links ]

Shuman, L. M. 1994. Mineral Nutrition. In: Wilkinson, R.E. (ed.) Plant–Environment interactions. Marcel Dekker. New York, USA. p. 149–182.        [ Links ]

Siebrecht, S. and Tischner, R. 1999. Changes in the xylem exudate composition of poplar (Populus treniula x P. alba) dependent on the nitrogen and potassium supply. J. Exp. Bot. 50:1797–1806.        [ Links ]

Singh, R. P. and Srivastava, H. S. 1986. Increase in glutamate synthase activity in maize seedlings in response to nitrate and ammonium nitrogen. Physiol. Plant 66:413–416.        [ Links ]

Sisson, V. A.; Rufty, T. W. and Williamson, R. E. 1991. Nitrogen–use efficiency among flue–cured tobacco genotypes. Crop Sci. 31:1615–1620.        [ Links ]

Sivasankar, S. and Oaks, A. 1996. Nitrate assimilation in higher plants: the effect of metabolites and light. Plant Physiol. Biochem. 34:609–620.        [ Links ]

Slawky, G. and Rodier, M. 1988. Biosynthetically active glutamine synthetase in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum: optimization of the forward–reaction assay. Mar. Bol. 97:269–274.        [ Links ]

Stitt, M. 1999. Nitrate regulation of metabolism and growth. Curr. Opin. Plant Biol. 2:178–186.        [ Links ]

Streeter, J. G. and Barta, A. L. 1984. Nitrogen and minerals. In: Munson, R. D. (ed.) Physiological basis of crop growth and development. American Society of Agronomy. Madison, WI. USA. p. 175–200.        [ Links ]

Vance, C. P. and Stade, S. 1984. Alfalfa root nodule carbon dioxide fixation. II. Partial purification and characterization of root nodule phosphoenolpyruvate carboxylase. Plant Physiol. 75:261–264.        [ Links ]

Weidner, D.; Johnson, C; and Decoteau, D. R. 1996. Nitrogen and potassium fertility affects jalapeño pepper plant growth, pod yield, and pungency. HortScience 31:1119–1123.        [ Links ]

Wolf, B. 1982. A comprehensive system of leaf analysis and its use for diagnosing crop nutrients status. Comm. Soil Sci. Plant Anal. 13:1035–1059.        [ Links ]

Woodall, J.; Boxall, J. B.; Forde, B. G. and Pearson, J. 1996. Changing perspectives in plant nitrogen metabolism: The central role of glutamine synthetase. Sci. Prog. 79:1–26.        [ Links ]

Yemm, E. W. and Cocking, E.C. 1955. The determination of amino acids with ninhydrin. Analyst (Cambridge) 80:209–213.        [ Links ]