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Introducción
Z. mays es uno de los cereales más cultivados en el mundo (Agbodjato et al., 2018), y debido a ello, existe una alta demanda del grano, lo cual ha derivado en prácticas de cultivo asociadas al uso intensivo de productos agroquímicos sintéticos, que a su vez, han generado una disminución de la fertilidad del suelo (Amogou et al., 2018), contaminación ambiental, riesgos a la salud, interrupción del ciclo ecológico natural de los nutrientes y la destrucción de comunidades biológicas (Bhardwaj et al., 2017).
Tomando en consideración estas problemáticas, durante los últimos años se han desarrollado e implementado diversas técnicas y prácticas que promueven la restauración del equilibrio biológico de los suelos, una de estas alternativas es el uso de rizobacterias promotoras de crecimiento vegetal (Plant growth promoting rhizobacteria, PGPR), que producen alteraciones de toda la comunidad microbiana en el nicho de la rizósfera a través de la producción de diversas sustancias (Kloepper et al., 1980). aportando beneficios como, tolerancia al estrés por sequía, salinidad y biótico, además de incrementar la absorción de nutrientes, mejorar la tasa de germinación, estimular el crecimiento de las plantas mediante producción de fitohormonas, mejora del suelo, biorremediación de metales pesados y contaminantes, además de modular los metabolitos secundarios de las plantas (Basu et al., 2021).
Las PGPR actúan directamente sobre las plantas facilitando la adquisición de recursos como nitrógeno, fósforo y minerales esenciales a través de la fijación biológica de nitrógeno, la solubilización de fosfato y el secuestro de hierro por el sideróforo, respectivamente, o modulando los niveles de hormonas vegetales como auxinas, giberelinas (GA), citoquininas (CK) y óxido nítrico (NO), o bien, de manera indirecta con la competencia en la rizósfera, la resistencia sistémica inducida (ISR) y biosíntesis de fitohormonas relacionadas con el estrés como el ácido jasmónico (JA), cadaverina (Cad) o con el catabolismo del etileno como la enzima 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) desaminasa (Parray et al., 2016).
En este sentido, se han realizado diversos trabajos sobre el efecto de las PGPR en Z. mays,Kumar et al., (2020) evaluaron el efecto de las nanopartículas de plata y Bacillus cereus LPR2 sobre el crecimiento de Z. mays determinaron que ambos pueden ser empleados como bioinoculantes y estimulantes del crecimiento y, B. cereus LPR2 como un inhibidor de crecimiento de patógenos, por su parte Ferreira et al., (2018) realizaron un estudio sobre el efecto de B. subtilis en la mejora a la tolerancia del Z. mays a la sequía, analizando cuatro niveles de salinidad, encontraron que la salinidad influye negativamente en el crecimiento de Z. mays, sin embargo, la inoculación de B. subtilis mejora el crecimiento de las plantas en condiciones de salinidad al igual disminuye los daños bioquímicos. Mientras que, (Ahmad et al., 2019), empleó Bacillus aryabhattai S10 y Bacillus subtilis ZM63 como bioinoculantes en frijol y Z. mays, encontrando que ambas cepas aumentan el crecimiento de las plantas y el estado nutricional.
Considerando lo antes mencionado, y bajo la hipótesis de que el uso de las cepas GBO3 o IN937b de B. subtillis promueven la organogénesis en plantas de Z. mays, la presente investigación tuvo como objetivo evaluar el efecto de B. subtillis en el crecimiento de Z. mays.
Materiales y métodos
Material vegetal y microorganismos
El presente trabajo se desarrolló en dos fases, durante la primera fase se realizó la reactivación de las cepas de IN937b y GBO3 de B. subtilis en agar de soya tripticaseína (TSA - tryptic soy agar) a una temperatura de 20 °C durante 24 horas (h), y posteriormente, se cultivaron colonias aisladas en caldo soya tripticaseina (TSB - tryptic soy broth) durante 24 h a 28 °C en un agitador orbital a 150 rpm, luego las células se cosecharon por centrifugación a 8000 x g y se resuspendieron en agua destilada estéril a una concentración 1x107 UFC●mL-1 y 1x108 UFC●mL-1 (Pulido Jiménez, 2016), previo a la inoculación en una variedad criolla de Z. mays L. llamada Campeón, de la región Frailesca, Chiapas, México. La determinación de la población bacteriana se realizó con la técnica del Número Más Probable (NMP) (Ranganayaki et al., 2006). Las cepas fueron donadas por el Laboratorio del Departamento de Entomología y Patología Vegetal de la Universidad de Alburn Estados Unidos.
Tratamientos
Para la determinación de los tratamientos se empleó un diseño de bloques al azar, para cinco tratamientos, cuatro de ellos experimentales y un testigo, cada tratamiento constó de 18 repeticiones, el experimento tuvo una duración de 40 días contados a partir de la siembra de las semillas. Los procesos de preparación del inóculo, desinfección de semilla e inoculación se describen mas adelante.
Tabla 1 Tratamientos para la determinación del efecto de la aplicación de las cepas IN937b y GBO3 de
| Tratamientos | Bacillus subtilis | Concentraciones | Unidades Experimentales |
|---|---|---|---|
| T1 | GB03 | 107 UFC●mL-1 | 18 |
| T2 | GB03 | 108 UFC●mL-1 | 18 |
| T3 | IN937b | 107 UFC●mL-1 | 18 |
| T4 | IN937b | 108 UFC●mL-1 | 18 |
| T5 | TESTIGO | Agua destilada | 18 |
Las soluciones bacterianas se aplicaron en tres fases, la primera fue la inoculación previa a la siembra de las semillas, la segunda 15 días posteriores a la siembra, ésto durante la etapa de trasplante a macetas y la tercera fue 30 días posteriores a la siembra, los procedimientos de inoculación, siembra y trasplante se detallan más adelante.
Desinfección e inoculación de la semilla
Se realizó la selección de semillas de tamaño similar, para posteriormente desinfectarlas mediante inmersión en una solución de hipoclorito de sodio comercial (Cloralex®) al 6% durante 2 min, en agitación constante para favorecer el contacto del agente de esterilización. Una vez finalizada la agitación se retiró el hipoclorito de sodio por decantación, y se realizaron tres lavados con agua destilada estéril con una duración de 1 min cada uno (Canto-Martín et al., 2004; Reyes et al., 2008).
Una vez desinfectadas las semillas, se sumergieron en 500 mL de la solución bacteriana o en agua destilada de acuerdo al tratamiento, durante 20 min, posterior a ello las semillas se sembraron a 3 cm de profundidad en charolas de germinación de 70 cavidades (cavidad 6 cm de diámetro por 15 cm de profundidad) con 1 semilla por cavidad; el sustrato empleado fue Peat moss (Premier ®) previamente esterilizado en autoclave a 15 PSI durante 15 minutos y humedecido con agua corriente, finalizada la siembra se agregaron 5 mL de la solución respectiva al tratamiento de cada semilla. Las charolas se llevaron a un invernadero tipo capilla de 9 m de ancho, con una altura de 3 m al canalón y 4.5 m al zenit con cubierta plástica y malla sombra del 40%, con una temperatura máxima de 30ºC, una mínima de 20 ºC y humedad relativa del 65%, las charolas se colocaron en estructuras metálicas que las mantuvieron separadas del suelo, el riego se realizó manualmente hasta el trasplante (Canto-Martín et al., 2004; García-Olivares et al., 2007).
Trasplante
A los 15 días posteriores a la siembra, las plantas de Z. mays se trasplantaron a macetas de plástico de 20 cm de diámetro por 15 cm de profundidad, el sustrato empleado consistió en 50% de Peat moss (Premier ®) y 50% de tierra negra previamente esterilizados en autoclave a 15 PSI durante 15 minutos (Sánchez-López et al., 2012).
Al momento del trasplante las raíces de cada planta fueron sumergidas durante 1 min en la solución respectiva a su tratamiento; una vez trasplantadas se aplicaron 10 mL de solución correspondiente junto al tallo. Las macetas se colocaron en estructuras metálicas en invernadero y se regaron manualmente de forma homogénea con 300 mL de agua por unidad experimental, con un intervalo de 3 días; 15 días después del trasplante se aplicaron 10 mL de la solución del tratamiento correspondiente.
Una vez finalizado el periodo de 40 días posteriores a la siembra de las semillas, se retiraron manualmente las plantas de las macetas y removieron los restos de sustrato sacudiendo las raíces cuidadosamente, para posteriormente medir los siguientes parámetros (Tabla 2).
Tabla 2 Parámetros y criterios de medición del crecimiento en Z. mays L.
| Parámetros | Método | |
|---|---|---|
| 1.- | Longitud del tallo/parte aérea (cm) | Se midió desde la base del tallo hasta el ápice de la hoja más nueva, con un vernier digital Traceable® |
| 2.- | Longitud de raíz (cm) | Se midió desde la base de las raíces hasta la punta de la raíz más larga, con un vernier digital Traceable® |
| 3.- | Diámetro del tallo (cm) | Se midió el diámetro basal del tallo con un vernier digital Traceable® |
| 4.- | Peso fresco del tallo/parte aérea (g) | Se determinó pesando el tallo con sus hojas en una balanza analítica Ohaus®. |
| 5.- | Peso fresco de la raíz (g) | Se determinó retirando los residuos de sustrato del sistema radical para después pesar todas las raíces en una balanza analítica Ohaus®. |
| 6.- | Peso Total (g) | Se determinó pesando la parte aérea y el sistema radical de cada planta con una balanza analítica Ohaus®. |
Resultados
En el presente estudio se observó que las cepas B. subtilis GBO3 y IN937b presentan efectos sobre el crecimiento general de plántulas de Z. mays (Tabla 3), obteniéndose pesos de raíz de 7.3 y 6.67 g para los tratamientos 2 y 3, respectivamente (cepas GBO3 1x108 UFC●mL-1 y IN937b 1x 107 UFC●mL-1), superando los 3.54 g del testigo, si bien existió un mayor peso en las raíces de las plántulas, esto no se vio reflejado en su longitud (P=0.2532).
Tabla 3 Efecto de las cepas GBO3 y IN937b de B. subtilis en el crecimiento de plantas de Z. mays.
| Tratamiento | Longitud de raíz (mm) | Peso de raíz (g) | Longitud de tallo (mm) | Diámetro de tallo (mm) | Peso de tallo (g) | Peso total (g) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| T1 | 67.92±20.84 a | 6.03±2.36 bc * | 18.6±1.98 ab | 0.51±0.08 a | 3.8 ±1.13 b* | 9.84±3.23 b* |
| T2 | 82.75±17.77 c | 7.3±2.02 c * | 21.6±3.86 cd | 0.54±0.07 ab | 3.99±0.84 bc* | 11.29±2.34 b* |
| T3 | 75.96±13.67 bc | 6.67±1.39 bc * | 23.67±3.15 d* | 0.6±0.06 b* | 4.62±0.65 c* | 11.29±1.57 b* |
| T4 | 78.17±21.08 bc | 5.95±1.37 b * | 16.51±3.44 a* | 0.51±0.09 a | 3.95±0.97 b* | 9.91±2.05 b* |
| T5 | 73.03±18.32 bc | 3.54±1.41 a | 19.97±4.18 bc | 0.5±0.05 a | 3.04±0.67 a | 6.58±1.79 a |
Medias con letras diferentes pertenecen a grupos estadísticamente heterogéneos (Tukey, alfa= 0.05). Los valores después del signo ± corresponden a la desviación estándar de la media. * Diferencias estadísticamente significativas con respecto al testigo, mediante contraste múltiple de Duncan.
En lo referente al peso del tallo, la totalidad de los tratamientos experimentales presentaron una media significativamente superior al testigo siendo los tratamientos 2 y 3 los de mayor peso con 3.99 y 4.62 g, respectivamente, mientras que el testigo presentó un peso de 3.04 g, por otra parte para el diámetro del tallo el único tratamiento estadísticamente diferente del testigo fue el tratamiento 3, con un promedio de 0.6 cm, que representa un incremento del 20% respecto al tratamiento testigo, los resultados obtenidos muestran además un incremento en el peso total, siendo los tratamientos 2 y 3 los mayores, ambos con 11.29 g, mismos que equivalen a un incremento del 72% respecto a los 6.58 g del testigo (Tabla 3).
Discusión
Los resultados obtenidos señalan que las cepas B. subtilis GBO3 y IN937b, presentan efecto sobre el peso de las raíces de Z. mays, obteniéndose un peso significativamente mayor (P= 5.5X10-6), sin embargo en la longitud de la raíz no se observaron diferencias estadísticamente significativas (P= 1.661). El incremento en peso de la raíz coincide con los resultados reportados por Rodríguez-Hernández et al., (2020) quienes obtuvieron un mayor peso fresco, ésto podría deberse a que de acuerdo con lo referido por García et al., (2015) las cepas tienen la capacidad de solubilizar fosfatos, produciendo un aumento en el crecimiento y el contenido de fósforo en los tejidos de las plantas. Otros estudios han caracterizado bacterias endofíticas de raíces de Z. mays entre ellas Bacillus sp. cuyas cepas presentan características positivas en la fijación de nitrógeno mediante la caracterización del gen 16S rDNA, donde cuatro cepas presentan características positivas para la producción de nitrógeno (Rodríguez-Hernández et al., 2020).
Por otra parte la cepa GBO3 ha sido reportada como una cepa con la capacidad de producir compuestos orgánicos implicados en la interrupción del la producción de etileno mediante la enzima 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) desaminasa, (Choudhary et al., 2011), la interrupción en la producción del etileno permite mejorar el crecimiento general de las plantas al aumentar su capacidad de fitoextracción y mejorar la movilidad de los metales pesados y aumentar su biodisponibilidad mediante la liberación de agentes quelantes, acidificación, solubilización de fosfato y cambios redox (Parray et al., 2016), además de evitar la generación de etileno y con ello los procesos de senescencia derivados del mismo. Por lo que, la inhibición del etileno es en sí un estímulo para el crecimiento. Por tanto, el incremento general del peso de la planta es el resultado de este conjunto de estímulos.
Lo anterior concuerda con lo observado en otros órganos, ya que el crecimiento de las plantas inoculadas fue mayor en la longitud (P=1.4x10-5), diámetro (P=1.9x10-5) y peso de los tallos (P=1.9x10-5). Estos resultados concuerdan con lo reportado por García et al., (2015), quienes lograron incrementar la longitud y peso seco del tallo de Z. mays mediante el empleo de especies del género Bacillus. De igual manera Rojas-Badía et al., (2020), emplearon cepas de Bacillus en Z. mays obteniendo plantas con mayor vigor.
Uno de los compuestos mas importantes para la obtención de plantas vigorosas es el nitrógeno, en este sentido se ha demostrado que los efectos benéficos de los microorganismos rizosféricos están relacionados con la fijación del mismo, en el caso del género Bacillus, se consideran fijadores de dinitrógeno, por lo que se utilizan en la promoción del crecimiento de plantas de maíz, además, Rojas et al. (2016) demostraron que la totalidad de las cepas de Bacillus de su estudio presentaron capacidad para crecer en medios carentes de nitrógeno y fijarlo, permitiendo así obtener plantas más vigorosas.
Conclusiones
A nivel de invernadero las inoculaciones de B. subtilis cepas GBO3 y IN937b presentan efectos estimuladores en el crecimiento de plantas de Z. mays, de la variedad Campeón de la región Frailesca, Chiapas, México incrementando el peso total, el peso fresco en raíz y la longitud, diámetro y peso fresco en tallo. Siendo cepas promisorias para la promoción del crecimiento vegetal.
