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Introducción
El género Agave es endémico de América, se distribuye desde el sur de EE.UU. hasta Colombia y Venezuela, incluyendo las islas del Caribe (García-Mendoza, 2007) y está constituido por 210 especies y cerca del 75 % las encontramos en México (García-Mendoza et al., 2019). México no es sólo el centro de mayor riqueza de especies de Agave, sino también su centro de domesticación (Gentry, 1976). La historia de diversificación de la planta, bajo cultivo y selección humana inició hace por lo menos 9,000 años y desde entonces, los agaves se han utilizado como bebida, alimento, vestido, material para escritura y herramienta (Arellanes et al., 1997; Bellon et al., 2009; Trejo et al., 2018; Pérez-Zavala et al., 2020). En México hay registro de 53 especies del género Agave empleadas en la elaboración de bebidas fermentadas y destiladas-mezcales (Torres et al., 2015), y 12 de ellas son las más importantes, por el manejo que se lleva a cabo: A. tequilana Weber, A. angustifolia Haw., A. karwinski Zucc., A. marmorata Roezl, A. potatorum Zucc., A. americana L. var. oaxacensis Gentry, A. cupreata Trel. y Berger, A. rhodacantha Trel., A. salmiana Otto ssp crassispina (Trel.) Gentry, A. wocomahi Gentry, A. durangensis Gentry y A. maximiliana Baker (García-Mendoza, 1998; Colunga-GarcíaMarín et al., 2017).
Estas especies se propagan en su mayoría de forma asexual a partir de hijuelos (brotes de rizoma) y ocasionalmente por bulbillos (brotes en el escapo floral), lo que da como resultado la formación de clones con características deseables, pero esto también facilita la formación de plantas susceptibles a enfermedades (Valenzuela-Sánchez et al., 2006). Su propagación a partir de semilla requiere de largos periodos para la generación de una nueva planta, además la madurez sexual en algunas especies, como en A. tequilana, se alcanza luego de 6 a 10 años (Robert et al., 1992; García-Mendoza, 2007) y de 12 a 14 años en A. maximiliana.
A. maximiliana crece comúnmente en las laderas de las montañas rocosas de los estados de Sinaloa, Durango, Zacatecas, Nayarit, Jalisco y Colima, cuya altitud va de 930 a 2,000 m en bosques de pino y encino (Eggli, 2001). Se le conoce como maguey tecolote o lechuguilla, y se emplea principalmente en la elaboración de bebidas fermentadas y mezcales en la sierra de Jalmich (zona limítrofe entre Jalisco y Michoacán), así como para un mezcal conocido regionalmente como raicilla, producido en el occidente del estado de Jalisco, en las montañas de Talpa, Mascota y San Sebastián del Oeste (Colunga-GarcíaMarín et al., 2007; Vázquez-García et al., 2007; Cabrera-Toledo et al., 2020). Asimismo, A. inaequidens Koch, A. valenciana Cházaro & A.Vázquez, A. angustifolia Haw. y A. rodacantha Trel., también se utilizan para la elaboración de esta bebida de acuerdo a la Denominación de Origen “Raicilla” (Diario Oficial de la Federación, 2019). Debido a que las plantas adultas de A. maximiliana se eligen para elaborar la raicilla justo antes de producir semillas, y aunado a que la especie no produce hijuelos ni bulbillos, está sujeta a una constante sobrexplotación de sus poblaciones naturales. Por lo tanto, urge implementar sistemas de multiplicación masiva de esta especie para que faciliten su incipiente cultivo intensivo de una manera sostenible. El cultivo de tejidos vegetales ofrece herramientas biotecnológicas para producir miles o millones de plantas, a partir incluso de una sola planta madre.
Hay varias investigaciones acerca del cultivo de tejidos de diferentes especies de Agave (Robert et al., 2006): A. americana (Chen et al., 2014; Naziri et al., 2018; Cruz-García et al., 2019), A. angustifolia (Monja-Mio et al., 2015; Arzate-Fernández et al., 2016; Reyes-Díaz et al., 2017; Ríos-Ramírez et al., 2017; Sánchez et al., 2020; Monja-Mio et al., 2021), A. cantala Roxburgh y A. fourcroydes Lem. (Binh et al., 1990; Monja-Mio & Robert, 2013), A. inaequidens (Aureoles-Rodríguez et al., 2008), A. marmorata (Aguilar-Jimenez & Rodriguez, 2018; Arzate-Fernández et al., 2020), A. salmiana (Puente-Garza et al., 2015, 2017; Arzate-Fernández et al., 2020) A. sisalana Perrine (Binh et al., 1990; Hazra et al., 2002; Carneiro et al., 2014; Nikam et al., 2019), A. tequilana (Santamaría et al., 1995; Valenzuela-Sánchez et al., 2006; Portillo et al., 2007; Santacruz-Ruvalcaba & Portillo, 2009; Portillo et al., 2012; Delgado-Aceves et al., 2021), A. victoria-reginae Moore (Rodríguez-Garay et al., 1996; Martínez-Palacios et al., 2003; Ramírez-Malagón et al., 2008) sin existir protocolos de propagación in vitro para A. maximiliana reportados a la fecha. Los procedimientos de micropropagación incluyen: la proliferación de yemas axilares, la organogénesis y la embriogénesis asexual (embriogénesis somática), los cuales son una herramienta potente en la obtención de plantas libres de patógenos, propagación masiva, rescate de embriones, clonación y mantenimiento de materiales selectos (Martínez-Palacios et al., 2003; Domínguez et al., 2008; Barreto et al., 2010).
Ya que la producción de mezcales en México es históricamente trascendental, de manera principal en aquellas comunidades para las cuales es una importante fuente de ingresos (Chávez-Guerrero et al., 2010; Trejo et al., 2018; Cabrera-Toledo et al., 2020), se justifica implementar un protocolo de micropropagación para A. maximiliana, pues será una alternativa para la generación de un gran número de plantas de una manera más rápida (respecto a su propagación por semillas) y para facilitar la producción de materiales vegetales deseados por características seleccionadas, como la robustez, la precocidad, la sanidad, etc. En consecuencia, el objetivo del presente estudio fue desarrollar un protocolo eficiente de micropropagación masiva in vitro de A. maximiliana mediante proliferación de yemas axilares.
Materiales y métodos
Material vegetal
Plantas de Agave maximiliana de aproximadamente 25 cm de altura (equivalentes a un año de edad) se recolectaron en el predio El Llano Colorado ubicado en el municipio de La Manzanilla de la Paz, Jalisco, México (19º 59' 59.9" N y 103º 03' 00.9" O) (Fig. 1A). Las plantas se originaron a partir de la germinación de semillas de plantas silvestres de esta especie en la zona de recolección, por lo que cada planta se consideró como genotipo independiente (Fig. 1A). La experimentación se desarrolló en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del Departamento de Producción Agrícola del Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad de Guadalajara. El material vegetal se identificó y se conservó a temperatura ambiente durante 24 h antes de comenzar su manipulación para el cultivo in vitro.
Fig. 1. Micropropagación de Agave maximiliana. A) hábitat de A. maximiliana de donde se tomaron las muestras, B) proliferaciónde yemas axilares con 12 mg L-1 de BA + 0.02 mg L-1 de 2,4-D, C) proliferación de yemas axilares con 8 mg L-1 de BA + 0.02 mg L-1 de 2,4-D, D) raíces cortas amarillentas con vellosidades estimuladas con 5 mg L-1 de ácido indol-3-butírico, E) raíces largas lisas con pocas vellosidades estimuladas con 90 g L-1 de sacarosa, F) tres genotipos de A. maximiliana (G1, G3 y G6) en el área de adaptación en invernadero. Barra = 1 cm.
Para obtener los explantes en el establecimiento in vitro, se eliminaron las hojas de plantas recolectadas de 15 a 20 cm de altura, hasta dejar sólo la que envolvía al meristemo apical, el material vegetal resultante fue lavado con detergente líquido Salvo®, en concentración de 1 mL L-1, después de lo cual se realizaron dos enjuagues en agua corriente. El material fue desinfectado en inmersiones con etanol al 96% durante 1 min, y posteriormente en una solución de hipoclorito de sodio comercial al 3% por 10 min, finalmente se hicieron tres enjuagues de 1 min cada uno con agua destilada estéril.
Una vez desinfectados los explantes, para su establecimiento e inducción de yemas axilares en condiciones in vitro, se trasfirieron a frascos de vidrio de alimento infantil Gerber® con tapa plástica autoclavable no hermética, con 25 mL de medio de cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962) que contenía 0.025 mg L-1 de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), 10 mg L-1 de 6-benciladenina (BA) y 30 g L-1 de sacarosa. El pH del medio se ajustó a 5.8 ± 0.05 y se utilizaron 8 g L-1 de agar (SIGMA No. Cat: A-1296) como agente gelificante. El medio de cultivo se esterilizó en autoclave a 121 °C y 1.27 kg cm-2 durante 15 min. Los cultivos se incubaron a 27 ± 2 °C, con un fotoperiodo de 16 h luz y 8 h de oscuridad con una intensidad lumínica de 25 µmol m-2 s-1. El material vegetal necesario para realizar los experimentos se obtuvo después de 60 días de cultivo en el medio mencionado.
Estimulación de brotes a partir de yemas axilares
En un medio MS suplementado con 30 g de sacarosa y gelificado con 8 g L-1 de agar, se evaluó el efecto de dos reguladores de crecimiento y la aptitud de dos genotipos de A. maximiliana (G1 y G6) para inducir la brotación a partir de yemas axilares. El diseño experimental tuvo tres factores: 1) auxina (2,4-D) 0, 0.01, 0.02 y 0.03 mg L-1; 2) la citocinina (BA) 0, 4, 8 y 12 mg L-1; 3) los genotipos G1 y G6. Las repeticiones empleadas fueron diez para el G1 y seis para G6. La unidad experimental fue un frasco de vidrio con un brote de alrededor de 4 cm de longitud con presencia de tres hojas; cada frasco contenía 25 mL del medio de cultivo. Las condiciones de incubación empleadas fueron las mismas ya citadas. La variable de respuesta fue el número de brotes obtenidos por planta a los 45 d de establecido el experimento.
Enraizamiento in vitro
Para la formación de raíces a partir de los brotes inducidos in vitro, se evaluaron tres genotipos: G1, G3 y G6 en combinación con cinco medios de cultivos: M1- medio MS + 30 g L-1 de sacarosa; M2- medio MS + 30 g L-1 de sacarosa + 2 g L-1 de carbón activado; M3- medio MS + 90 g L-1 de sacarosa; M4- medio MS + 90 g L-1 de sacarosa + 2 g L-1 de carbón activado; M5- medio MS + 30 g L-1 de sacarosa + 5 mg L-1 de la auxina ácido indol-3-butírico (AIB). La unidad experimental con su respectivo medio de cultivo, así como su incubación, fue similar al experimento previo. El diseño experimental tuvo un arreglo bifactorial con nueve repeticiones por tratamiento. Las variables de respuesta fueron el número de raíces formadas por planta, la longitud (medición con una regla) y ramificación de las mismas (número de raíces secundarias ramificadas a partir de la raíz principal), a los 50 d de establecido el experimento.
Adaptación de plantas en invernadero
Una vez enraizadas las plantas in vitro con una altura de 4 a 7 cm y teniendo entre cuatro y seis hojas, fueron extraídas de los frascos, se les eliminó por completo el residuo de agar con remojar en agua corriente a 30 oC de temperatura, para después ser sumergidas en una solución de 1 g L-1 del fungicida Captan® (N-triclorometiltio-4-ciclohexeno-1,2-dicarboximida, 500 g kg-1 de producto). La parte radicular de la planta fue impregnada con enraizador en polvo Radix® (10,000 ppm de ácido indol-3-butírico). Para entonces ser establecidas en macetas plásticas cuadradas de 2.5 in3 de capacidad, las cuales contenían como sustrato una mezcla de turba de musgo (70%) y arena (30%); esterilizado con calor húmedo en autoclave a 121 oC, 1.27 Kg cm-2 durante 15 min.
El proceso de adaptación de las plantas en invernadero inició al colocar en la parte superior de las macetas, una bolsa de poliestireno sellada con cinta adhesiva para mantener una humedad relativa del 95%, similar a las condiciones de cultivo in vitro y así evitar su deshidratación. Cada semana se realizó un corte en las esquinas de las bolsas, para reducir gradualmente la humedad relativa a la que estaban sometidas las plantas, gradualmente se realizaron más perforaciones y después de un mes la bolsa que cubría la maceta fue retirada. La temperatura media en el invernadero fue de 32 oC y se empleó una malla sombra del 70% para reducir la intensidad lumínica.
Posteriormente, se realizó un experimento bajo un arreglo bifactorial para evaluar cinco fuentes de nutritición en las que se emplearon una solución del fertilizante 20-10-20, un lixiviado de composta de lombriz y una mezcla de Pectimorf® (oligogalacturónido de grado de polimerización entre 10-14. INCA, Cuba) (Cuadro 1), y tres genotipos (G1, G3 y G6), con cinco repeticiones. La unidad experimental constó de una planta por maceta.
Cuadro 1 Fuentes de nutrición empleadas para favorecer una mejor adaptación en invernadero de plantas de
| Tratamiento |
|---|
| T1: Sin fuente de nutrición |
| T2: 10 mL por planta de solución del fertilizante 20-10-20 en una dosis de 5 g L-1 |
| T3: 50 mL por planta de lixiviado de composta de lombriz† |
| T4: 2.5 mL por planta de Pectimorf® a una concentración de 1 mg L-1 más 10 mL por planta de solución del fertilizante 20-10-20 en una dosis de 5 g L-1 |
| T5: 2.5 mL por planta de Pectimorf® a una concentración de 5 mg L-1 más 10 mL por planta de solución del fertilizante 20-10-20 en una dosis de 5 g L-1 |
| T6: 2.5 mL por planta de Pectimorf® a una concentración de 10 mg L-1 más 10 mL por planta de solución del fertilizante 20-10-20 en una dosis de 5 g L-1 |
†El lixiviado de composta de lombriz se realizó al sumergir un costal con 5 kg de composta de lombriz en 15 L de agua dentro de un recipiente con tapa durante 30 d, el costal se agitaba dentro del recipiente dos veces por semana.
Los tratamientos fueron aplicados cada 21 d y las plantas se regaron con 50 mL de agua tres veces por semana.
Las variables de respuesta fueron el número de hojas por planta, la longitud de la hoja central más larga (se seleccionó y se marcó al iniciar el experimento) y el ancho de esa misma hoja, para realizar estas mediciones se empleo un vernier y se realizaron a los 80 d después de establecido el experimento.
Resultados y discusión
Inducción de brotes a partir de yemas axilares
Hubo diferencias significativas entre las dosis de reguladores de crecimiento utilizadas, tanto para BA (p = 0.000) y 2,4-D (p = 0.023), y su interacción (p = 0.031). Basados en la significancia de estos últimos resultados, se procedió a realizar un análisis de los 16 tratamientos resultantes de las combinaciones de los dos reguladores de crecimiento; encontrando una alta significancia estadística entre los tratamientos (p = 0.000). Con esta información y la obtenida de la comparación múltiple de Tukey de los valores promedio (Cuadro 2), fue posible ubicar la dosis de 12 mg L-1 de BA y de 0.02 mg L-1 de 2,4-D, como la combinación con el más alto promedio para maximizar la estimulación de brotes (26.93 brotes) (Fig. 1B) y, además se encontró en algunos tratamientos calidad tanto para la identificación debido al tamaño y la facilidad para la separación de los brotes, sin existir anormalidades (Fig. 1C). La interacción de los reguladores de crecimiento no fue significativa (p = 0.286) con los dos genotipos de A. maximiliana. La combinación de reguladores de crecimiento para el subgénero Agave, con dosis baja de auxina (entre 0.025 y 0.5 mg L-1 de auxina) y alta de citocinina (entre 3 y 10 mg L-1 de citocinina) se ha reportado como exitosa para la estimulación en la producción de brotes apartir de yemas axilares en A. angustifolia (Ríos-Ramírez et al., 2017), A. guiengola (Chávez-Ortiz et al., 2021) y para A. fourcroydes (Robert et al., 1992; Zhang et al., 2013); en el caso de A. guiengola se encontró una producción máxima de brotes de 43 (Chávez-Ortiz et al., 2021).
Cuadro 2 Número de brotes formados al utilizar las diversas dosis y combinaciones de los reguladores de crecimiento BA y 2,4-D, evaluación a 45 d de iniciado el experimento para los genotipos G1 y G6.
| 2, 4-D mg L-1 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 0† | 0.01 | 0.02 | 0.03 | Media | ||
| BA mg L -1 | 0 | 1.5±1.93cd | 1.42±2.40cd | 0.57±0.93d | 0.71±0.99d | 1.06±9.74 |
| 4 | 13.71±11.14bc | 16.87±9.42ab | 16.12±13.64ab | 15.23±12.28ab | 15.46±9.78 | |
| 8 | 14.18±9.44c | 15.31±8.21ab | 18.31±13.07ab | 19.14±14.47ab | 16.08±9.84 | |
| 12 | 12.42±9.54bcd | 11.12±11.31bcd | 26.93±7.41a | 14.62±10.41b | 16.41±9.84 | |
| Media | 10.53±9.79 | 11.21±9.84 | 15.15±9.84 | 12.12±9.72 | ||
†Medias ± desviación estándar con la misma letra no son significativamente diferentes (p = 0.05) empleando Tukey.
Enraizamiento in vitro
La formación de raíces fue estadísticamente diferente (p = 0.000) entre los medios utilizados y no presentó interacción significativa con ninguno de los genotipos evaluados (p = 0.216). Mediante la comparación múltiple de medias se encontró que el medio que contenía 5 mg L-1 de AIB indujo mayor número de raíces (Cuadro 3), lo que señala la importancia de utilizar auxina para inducir mayor número de raíces en esta especie (Garriga et al., 2010; Chen et al., 2014); este tratamiento produjo el mismo número de raíces en los tres genotipos (p = 0.591). Sin embargo, las raíces formadas en las plántulas sometidas a dicho medio no fueron de calidad, ya que son raíces efímeras, con las siguientes características: raíces cortas amarillentas poco ramificadas y con vellosidades que no sobreviven al proceso de adaptación ex vitro (Fig. 1D).
Cuadro 3 Número, ramificaciones y longitud en cm de raíces formadas en cinco medios de cultivo.
| Medio | Número de raíces† | Ramificaciones | Longitud (cm) |
|---|---|---|---|
| M1 MS†† + 30 g L-1 sacarosa | 2.56±1.39b | 10.30±9.13b | 16.41±7.63b |
| M2 MS + 30 g L-1 sacarosa + 2 g L-1 carbón activado | 2.96±1.48b | 12.89±8.98ab | 15.48±5.89b |
| M3 MS + 90 g L-1 sacarosa | 4.41±2.67b | 17.85±7.69a | 28.67±15.48a |
| M4 MS + 90 g L-1 sacarosa + 2 g L-1 carbón activado | 3.89±1.98b | 16.67±13.25ab | 24.96±13.34ab |
| M5 MS + 30 g L-1 sacarosa + 5 mg L-1 AIB | 12.78±8.06a | 0.67±1.64c | 23.06±18.30ab |
† Medias ± desviación estándar con la misma letra no son significativamente diferentes (p = 0.05) empleando Tukey.
†† MS Medio de cultivo basal (Murashige & Skoog, 1962).
La longitud de las raíces mostró una alta diferencia significativa entre los medios (p = 0.000), y con la comparación múltiple de medias se identificó a los medios 3, 4 y 5 como los que mayor longitud de raíces generaron. Asimismo, los medios con mayor ramificación (p = 0.000) fueron 2, 3 y 4. En el caso del factor genotipo, solamente se tuvo significancia para la longitud de raíces (p = 0.025) mostrando los genotipos G3 y G6 el mayor crecimiento radicular (Cuadro 4) y no se encontró interacción con los medios (p = 0.763).
Cuadro 4 Longitud de la raíz de acuerdo al genotipo.
| Genotipo | Longitud de la raíz (cm)† |
|---|---|
| G1 | 17.43±12.72b |
| G3 | 23.47±12.75ab |
| G6 | 24.24±15.00a |
† Medias ± desviación estándar con la misma letra no son significativamente diferentes (p = 0.05) empleando Tukey.
Estos resultados muestran que los medio 3 y 4, con mayor contenido de sacarosa (90 g L-1), facilitan un mejor desarrollo de raíces en los genotipos empleados de A. maximiliana; no sólo en longitud, sino también en una mayor ramificación de las mismas con alta significancia (p = 0.000), el mismo comportamiento ya fue reportado (Kumar et al., 1999; Ragonezi et al., 2010), independientemente de la adición de carbón activado. Por lo tanto, el medio 3 se destaca al producir raíces largas, ramificadas y no efímeras (raíces largas ramificadas sin vellosidades, que siguen desarrollándose y generando nuevas raíces en la adaptación ex vitro) (Fig.1E).
Adaptación de plantas en invernadero
No se encontraron diferencias significativas para el número de hojas, tanto para los tratamientos (p = 0.148) y genotipos (p = 0.530), como para su interacción (p = 0.703). La variable de respuesta ancho de la hoja mostró ser independiente de la adaptación con las fuentes de nutrición evaluados (p = 0.920), y que más bien se debe a la genética de cada material vegetal (genotipo), ya que este factor resultó significativo (p = 0.023). Ambos factores no mostraron interacción (p = 0.990).
Al analizar los datos de longitud de la hoja central más larga de cada planta, se observó que las fuentes de nutrición no indicaron diferencias significativas (p= 0.668), pero el factor genotipo registró diferencia estadística alta (p = 0.009). En el Cuadro 5 se señala el diferencial existente para el tamaño de hojas (longitud y ancho) que muestran los genotipos evaluados, donde resaltan los genotipos G1 y G3 (Fig. 1F). Nuevamente no se encontró interacción significativa (p = 0.950). Estos resultados permiten señalar que en la especie es posible ubicar materiales vegetales con características particulares; previamente en diversas especies de Agave ya se había observado este tipo de respuestas en el desarrollo al micropropagarlas (Domínguez et al., 2008). Durante el proceso de aclimatación se encontró un 100 % de supervivencia.
Cuadro 5 Longitud de la hoja central más larga y ancho de la hoja de acuerdo al genotipo.
| Genotipo | Longitud de la hoja (cm) † | Ancho de la hoja (cm) |
|---|---|---|
| G1 | 5.73±1.66ab | 0.89±0.44b |
| G3 | 6.97±2.08b | 0.67±0.57ab |
| G6 | 5.37±2.08a | 0.52±0.42a |
† Medias ± desviación estándar con la misma letra no son significativamente diferentes (p = 0.05) empleando Tukey.
Conclusiones
La micropropagación de Agave maximiliana es factible de llevarse a cabo desde la estimulación de los brotes por yemas axilares hasta la adaptación ex vitro. Para la etapa de estimulación, la presencia de la auxina ácido 2,4-diclorofenoxiacético en proporción baja (0.02-0.03 mgL-1) respecto a la citocinina 6-benciladenina (4-12 mgL-1), favoreció el incremento en la generación de brotes. Así mismo, para la estimulación significativa de raíces largas, ramificadas y no efímeras en dichos brotes, es necesaria la adición de sacarosa en cantidades mayores (9%) con respecto al 3%, comúnmente utilizada en los protocolos de propagación in vitro. La adaptación de plantas en invernadero depende del genotipo, siendo el G1 y G6 los de mayor desarrollo, tanto en la longitud como en el ancho de las hojas, pero no así en el número de éstas.
