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Introducción
El petróleo es actualmente la principal fuente de energía del mundo y se espera que su demanda aumente en los próximos años (Janzen & Teresinha, 2018). El petróleo consiste en diversas proporciones de carbono e hidrógeno. Sin embargo, también contiene nitrógeno, azufre y oxígeno en cierta cantidad (Chandra et al., 2013; Varjani, 2017). El petróleo es esencial para las actividades humanas tales como fuente de alimentación, calefacción y vehículos. Sin embargo, su intensa explotación conlleva un incremento en el número de accidentes ambientales, como derrames y fugas que ocurren durante la exploración, producción, transporte y almacenamiento de combustible, liberándose al medio ambiente (Aislabie et al., 2006; Janzen & Teresinha, 2018) y provoca la contaminación del agua y suelo la cual afecta directamente a la flora y la fauna. En México, de 2018 a 2021 Petróleos Mexicanos registra 176 emergencias ambientales, de las cuales 156 fueron provocadas por derrames derivados de hidrocarburos y 20 por fugas de gas, donde Tabasco y Veracruz concentran el 63% de los desastres (Ramírez, 2022). En el suelo, el petróleo forma una capa hidrofóbica, e induce la fragmentación de los agregados; de igual forma, causan la inhibición de la germinación, el brote de meristemos, así como la disminución de la elongación radicular y la fotosíntesis en las plantas (Díaz-Martínez et al., 2013; Eze et al., 2020; Petenello & Feldman, 2012), estos efectos en las plantas podrían deberse a la alteración en la producción de ERO ocasionada por la contaminación por petróleo lo cual induce estrés oxidativo en las células vegetales (Hasanuzzaman et al., 2020; Nardeli et al., 2016). Las ERO son formas reducidas de oxígeno atmosférico y se producen en el metabolismo normal celular de las plantas (Mittler, 2017; Sarma et al., 2012). Cuando el nivel de ERO es moderado funcionan como moléculas de señalización (Singh et al., 2019) involucradas en el control del crecimiento y desarrollo de las plantas expuestas al estrés biótico y abiótico, lo que permite la adaptación y aclimatación de las plantas a su ambiente y la muerte celular programada (del Río, 2015; Mhamdi & van Breusegem, 2018). Sin embargo, varios estreses ambientales entre ellos la contaminación conducen a un exceso de ERO afectando una gran variedad de funciones celulares, fisiológicas y bioquímicas de las plantas hasta que se produce la muerte celular (Huang et al., 2019; Zainab et al., 2021). Las ERO se eliminan mediante la actividad de antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos las cuales trabajan en conjunto para prevenir o minimizar el daño oxidativo causado por las ERO en las células vegetales (del Río, 2015; Huang et al., 2019; Xie et al., 2019).
Leersia hexandra es un pasto forrajero con un alto contenido de proteína cruda y bajo contenido de fibra, la cual es altamente consumida por los bovinos. Esta especie habita lugares húmedos de regiones tropicales y subtropicales, frecuentemente cubiertos de agua (CABI, 2019; Vegetti, 2002). Este pasto desplaza otras especies vegetales establecidas en humedales en el estado de Tabasco, México, contaminados con hidrocarburos del petróleo intemperizado (Rivera-Cruz, 2011). Estudios han informado sobre el potencial de L. hexandra para adaptarse a suelos contaminados con hidrocarburos del petróleo (Arias-Trinidad et al., 2017; Orocio-Carrillo et al., 2019; Rivera-Cruz et al., 2016), sin embargo, se desconoce su respuesta en los compuestos antioxidantes que la hacen capaz de controlar eficazmente el nivel celular de ERO ocasionado por la presencia del petróleo. Por lo tanto, el presente estudio se desarrolló con el objetivo de determinar la respuesta en crecimiento, producción de materia fresca aérea y radical, concentración de pigmentos fotosintéticos y compuestos antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos de Leersia hexandra expuesta a diferentes dosis de petróleo.
Materiales y métodos
Colecta de suelo y cultivo de plántulas
Se estableció un bioensayo durante 180 días bajo condiciones semicontroladas en microtúnel. La colecta de suelo caracterizado como tipo Gleysol a partir del horizonte superficial (0-30 cm) se realizó en el Ejido Blasillo 2da Sección, Huimanguillo, Tabasco. El suelo se secó bajo sombra, se molió y se tamizó con malla de 0.5 cm de abertura. Las propiedades del suelo no contaminado fueron: pH moderadamente ácido (5.5), conductividad eléctrica de 943 µs/cm y contenido muy alto de materia orgánica (20.7 %) (Walkley & Black, 1934).
Los rizomas del pasto Leersia hexandra se colectaron en un sitio contaminado por derrames crónicos de petróleo desde hace 50 años (Rodríguez-Rodríguez et al., 2016) en el Ejido José Narciso Rovirosa, a dos kilómetros al suroeste del Complejo Procesador de Gas la Venta, Huimanguillo, Tabasco. El suelo donde se encuentra el pasto es caracterizado como Gleysol (Rivera-Cruz et al., 2016). Se seleccionaron vástagos con yemas maduras, posteriormente se colectaron en charolas para su traslado al microtúnel. De los tallos maduros se cortaron estolones de 5 cm de longitud con raíces, los estolones se sembraron en charolas de plástico con capacidad de 200 plántulas, con suelo Gleysol tamizado en malla 10 (2 mm de diámetro). A los 30 días después de la siembra (dds) crecieron plantas de 19.5 ± 2.3 cm de altura, las cuales se usaron en el bioensayo experimental.
Tratamientos y diseño experimental
El experimento se llevó a cabo con un diseño experimental completamente al azar con cuatro tratamientos y cuatro replicas. Los tratamientos consistieron en la aplicación de hidrocarburos del petróleo al suelo en las siguientes concentraciones HTP: 0 (control), 30, 60 y 90 g kg-1. El hidrocarburo fue un petróleo crudo mediano (10.8° API), gravedad específica de 0.84 g cm-1, 56.4, 23.7 y 14 % de fracción alifático, aromática y polares + resinas y asfaltenos, respectivamente. Este se obtuvo del campo petrolero “Cinco Presidentes” La Venta, Tabasco, México (18° 12' 11.8" N y 94° 08' 37.8" O) (Orocio-Carrillo et al., 2019). La unidad experimental consistió en un contenedor de plástico (22 X 19 cm, diámetro y altura) con 2 kg de suelo seco. Los sustratos para los ensayos se prepararon a partir de suelo control, el cual en una charola de aluminio con una espátula se mezcló con petróleo disuelto en 15 mL de diclorometano (99.5 % de pureza marca EMDTM) para homogeneizar el suelo. La mezcla se colocó en contenedores de plásticos. En cada unidad experimental de cada tratamiento se trasplantó una planta de L. hexandra. El bioensayo se mantuvo durante 180 días a una temperatura promedio de 34 ± 6 ºC y humedad a capacidad de campo (32 %) por gravimetría.
Variables de crecimiento y producción
Para determinar el efecto de los tratamientos sobre el crecimiento del pasto a los 180 dds, se midió la altura de la planta, número de rebrotes en el macollo (NRM), longitud de raíz primaria (LRP) y numero de raíces primarias (NRP). Para medir el efecto sobre la producción se evaluó la materia fresca aérea (MFA) y materia fresca radical (MFR). La altura de la planta se midió con una regla graduada desde la base del tallo hasta el ápice de la hoja central de la planta. El NRM se realizó contando directamente la cantidad de plantas que emergen del macollo de la planta principal. La LRP se midió con una regla graduada en mm desde la base de la raíz hasta la punta del tercio terminal. La MFA se realizó midiendo el peso de tallos y hojas de los rebrotes y planta principal con la ayuda de una balanza semianalítica (Ohaus, modelo Scout Pro SP202) y la MFR se realizó con similar proceso de MFA.
Análisis bioquímicos
Para los análisis bioquímicos las muestras de hojas se tomaron a los 180 dds, se recogieron cuatro muestras por tratamiento. Se tomó tejido foliar de los rebrotes en el macollo de la plántula las cuales se enjuagaron con agua destilada, posteriormente se secaron al aire. Las muestras se almacenaron a -20 ºC en un congelador. Se liofilizaron en un liofilizador (Yamato Scientific Co. Ltd., Modelo D401, Santa Clara, CA, EE. UU) a -80 ºC durante 120 h, se molieron con un mortero de porcelana hasta obtener un polvo fino y se almacenaron hasta su posterior análisis.
Determinación de pigmentos fotosintéticos
El contenido de pigmentos fotosintéticos (clorofila a, clorofila b y clorofila total) (mg 100 g-1 de peso seco (PS)) se determinaron siguiendo el método de Nagata & Yamashita (1992). Para esto se mezcló 0.1 g de tejido vegetal fresca liofilizada con 20 mL de solución hexano: acetona (3:2, v: v). Se centrifugó la suspensión (12500 rpm) durante 10 min a 4 ºC y se tomó una alícuota del sobrenadante para la lectura en un espectrofotómetro UV-Vis (Espectrofotómetro UNICO Modelo UV2150, Dayton, NJ, EE. UU) a valores de absorbancia de 453, 505, 645 y 663 nm. La clorofila total es la suma de Chl a y Chl b.
Determinación de compuestos antioxidantes no enzimáticos
Los compuestos antioxidantes no enzimáticos se determinaron según técnicas estándar. El contenido de β-caroteno (mg 100 g-1 PS) se determinó según el método de Nagata & Yamashita (1992). Se tomó la lectura a una absorbancia a 453, 505, 645 y 663 nm.
La vitamina C (VC) (mg g-1 PS) se determinó por el método colorimétrico como lo describe Hung & Yeng (2002), usando 2,6 diclorofenol, 1 g de tejido liofilizado y 1 mL de ácido metafosfórico al 1%.
Los fenoles totales (FT) (mg g-1 PS) se determinaron con el reactivo Folin-Ciocalteu, como se describe en Cumplido-Nájera et al. (2019). La muestra (0.2 g) se extrajo con 1 mL de una solución agua: acetona (1:1). La mezcla se agitó en vortex durante 30 s. En un tubo de ensayo, se agregaron 50 μL del sobrenadante, 200 μL del reactivo Folin-Ciocalteu, 500 μL de carbonato de sodio al 20% (Na2CO3) y 5 mL de agua destilada fría, y luego se sometió a vortex durante 30 s. Las muestras se colocaron a baño maría a 45 °C durante 30 min. Finalmente, la lectura se tomó a una absorbancia de 750 nm en un espectrofotómetro UV-Vis (Espectrofotómetro UNICO Modelo UV2150, Dayton, NJ, EE. UU.) usando celda de cuarzo.
Los flavonoides (FV) (mg 100 g-1 PS) se evaluaron por el método descrito por Arvouet-Grand et al. (1994). Para la extracción, se pesó 100 mg de tejido liofilizado en un tubo de ensayo, a esta se añadió 10 mL de metanol grado reactivo y se agitó durante 30 s, hasta homogeneizar la mezcla. La mezcla se filtró en papel Whatman No. 1. Para la cuantificación se añadieron al tubo de ensayo 2 mL del extracto y 2 mL de solución metanólica de tricloruro de aluminio (AlCl3) al 2%, se dejó reposar durante 20 min en oscuridad y se tomó la lectura a una longitud de onda de 415 nm en espectrofotómetro UV-Vis (Espectrofotómetro UNICO Modelo UV2150, Dayton, NJ, EUA) usando una celda de cuarzo.
Determinación del contenido de proteína total y enzimas antioxidantes
La cuantificación de los flavonoides (FV) (mg g-1 PS) se realizó mediante la técnica colorimétrica de Bradford (1976). En una microplaca, se colocó en cada pocillo 5 μL del extracto enzimático y 250 μL de reactivo Bradford, seguidamente la mezcla se incubó durante 10 min a temperatura ambiente (26 °C) y luego se leyeron en el lector de microplacas (Allsheng, modelo AMR-100, Hangzhou, China) a una longitud de onda de 630 nm.
Para determinar enzimas antioxidantes se pesaron por separado 200 mg de hoja liofilizadas y se agregó 20 mg de polivinilpirrolidona. Posteriormente se agregó 1.5 mL de tampón fosfato al 0.1 M con un pH de 7-7.2 y la mezcla se centrifugó a 12500 rpm durante 10 min a 4 ºC. El sobrenadante se filtró en filtros de membrana PTFE de 0.45 µm de poro. La actividad de la catalasa (CAT) (EC 1.11.1.6) (U g-1 PrT) se cuantificó por el método espectrofotométrico de Dhindsa et al. (1981). La actividad enzimática de fenilalanina amoníaco liasa (PAL) (EC 4.3.1.5) (U g-1 PrT) se determinó de acuerdo con Sykłowska-Baranek et al. (2015).
Determinación del contenido de peróxido de hidrógeno
Las concentraciones de peróxido de hidrógeno (H2O2) (µmol g-1 PS) se llevó a cabo de acuerdo con la metodología de Velikova et al. (2000) con ligeras modificaciones. Se pesó 25 mg de tejido vegetal liofilizado y se colocaron en un tubo Eppendorf, luego se añadió 1 mL de ácido tricloroacético al 0.1 % frío. La mezcla se sometió a centrifugación a 12000 x g durante 15 min y se tomó 0.5 mL del sobrenadante. Se añadió 0.5 mL de tampón fosfato de potasio 10 mM (pH 7.0) y 1 mL de yoduro de potasio 1M, y se realizó la lectura a una absorbancia de 390 nm en un espectrofotómetro UV-Vis (Espectrofotómetro UNICO Modelo UV2150, Dayton, NJ, EE. UU.).
Análisis estadísticos
A todos los resultados obtenidos se les realizó un análisis de varianza (ANAVA), prueba de comparación múltiples de medias por el método Tukey (p ≤ 0.05) y correlación bivariada de Pearson usando el software estadístico SAS v.9.1 (SAS, 2005).
Resultados
Crecimiento y producción de L. hexandra
La aplicación de las concentraciones de hidrocarburos del petróleo en el suelo mostró efectos estadísticamente significativos sobre el crecimiento y producción de L. hexandra (Tabla 1). La altura disminuyó por la adición de HTP. Las aplicaciones de 30, 60 y 90 g kg-1 HTP redujeron la altura en un 19.8, 24.4 y 61.5 %, respectivamente. De la misma forma en la LRP la tendencia decreciente se observa en los mismos tratamientos con la reducción del 16.7, 29.6 y 34.5 %. En NRM la aplicación de HTP indujo un efecto positivo. Se observó un aumento del 92.6, 163 y 300 % cuando se aplicaron 30, 60 y 90 g kg-1 HTP respectivamente. NRP fue estimulado por la adición de las concentraciones de HTP, el mayor incremento se observó con 90 g kg-1 HTP (345.3 %), mientras que los tratamientos con 30 y 60 solo estimuló el NRP en un 96.9 y 264.8 % (Tabla I). La producción de MFA disminuyó por efecto de HTP. Las aplicaciones de 30, 60 y 90 g kg-1 HTP redujeron la MFA en un 20.4, 33 y 44.3 %, respectivamente. Sin embargo, la MFR se estimuló por efecto del petróleo. La MFR aumentó un 193.9 % cuando se expone al tratamiento con 90 g kg-1 HTP, además de incrementos de 126.4 y 172.7 % a exposición de 30 y 60 g kg-1 HTP (Tabla 1).
Tabla 1 Efecto de hidrocarburos del petróleo en suelo sobre la altura, número de retoños en el macollo (NRM), materia fresca aérea (MFA), materia fresca radical (MFR), longitud de raíz primaria (LRP) y número de raíz primaria (NRP) de L. hexandra después de 180 días de exposición.
| HTP (g kg-1) |
Altura (cm) |
NRM | MFA (g) | MFR (g) |
LRP (cm) | NRP |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 0 | 437.3+10.2a | 27+ 2.4d | 148.3+ 2.7a | 27.3 +1.1c | 38.8 + 1.2a | 128+6.2d |
| 30 | 350.9+ 6.5b | 52+ 5.1c | 118 +10.5b | 61.8 +4.4b | 32.4 + 0.6b | 252+13.5c |
| 60 | 330.4+16.3b | 71+12.1b | 99.4 +18.4bc | 74.5 +3.4 ab | 27.3 + 0.8c | 442+ 9.8b |
| 90 | 168.5+28.6c | 108+4.2a | 82.6 +13.9c | 80.3 +15.4a | 25.4+1.2c | 570+15.5a |
| HTP | ||||||
| Sin | 437.3a | 27b | 148.3a | 27.3b | 38.8a | 128b |
| Con | 283.3b | 77a | 100b | 72.2a | 28.4b | 430a |
| CV (%) | 5.4 | 10.9 | 11.4 | 13.5 | 3.2 | 6.9 |
HTP: Hidrocarburos totales del petróleo. Media + Error estándar (n=4). Dentro de columna letras diferentes indican que los valores son estadísticamente diferentes (Tukey, < 0.05).
El efecto del petróleo en la estimulación de NRM, MFR y NRP (r = 0.970**, 0.882**, 0.995**) (Tabla 3) fue evidente respecto al suelo sin petróleo; NRM aumenta un 185 %, la producción de MFR un 164.4 % y un 235.9 % en NRP. Sin embargo, disminuye un 35.2, 32.6 y 26.8 % la altura, MFA y la LRP (-0.940**, -0.901**, -0.961**) (Tabla 3) respectivamente.
Tabla 2 Efecto de hidrocarburos del petróleo en suelo sobre los pigmentos fotosintéticos de L. hexandra después de 180 días de exposición.
| HTP (g kg-1) | Pigmentos fotosintéticos (mg 100 g-1 PS) | |||
|---|---|---|---|---|
| Clorofila a | Clorofila b | Clorofila total | β-caroteno | |
| 0 | 13.3 + 1.04b | 5.7 + 0.7b | 19.0 + 1.8b | 12.44 + 1.3b |
| 30 | 21.5 + 4a | 9 + 1.5a | 30.5 + 5.5a | 18.39 + 5.3ab |
| 60 | 20.3 + 2.8a | 8.4 + 1.1a | 28.7 + 3.9a | 22.12 + 1.5a |
| 90 | 19.1 + 2.8ab | 7.9 + 1.2ab | 27 + 4ab | 25.8 + 4.3a |
| HTP | ||||
| Sin | 13.3b | 5.7b | 19.0b | 12.4b |
| Con | 20.3a | 8.4a | 28.7a | 22.1a |
| CV (%) | 15.5 | 15.2 | 15.3 | 18.1 |
HTP: hidrocarburos totales del petróleo. Medias + Error estándar (n=4). Dentro de columna letras diferentes indican que los valores son estadísticamente diferentes (Tukey, < 0.05).
Tabla 3 Correlación de variables.
| Parámetro | Altura | NRM | MFA | MFR | LRP | NRP | β-caroteno | FT | FV | PrT | CAT | H2O2 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| HTP | -.0940** | 0.970*** | -0.901** | 0.882** | -0.961** | 0.995** | 0.843** | 0.812** | 0.678** | 0.716** | -0.530* | 0.507* |
| Altura | -0.968** | 0.885** | 0.799** | 0.841** | 0.914** | -0.772** | -0.893** | -0.765** | -0.826** | 0.548* | NS | |
| NRM | -0.863** | 0.831** | -0.899** | 0.958** | 0.810** | 0.845** | 0.706** | 0.729** | NS | 0.522* | ||
| MFA | -0.791** | 0.890** | -0.887** | -0.793** | -0.704** | -0.598* | -0.572* | NS | NS | |||
| MFR | -0.904** | 0.868** | 0.674** | 0.652** | 0.768** | 0.557* | NS | NS | ||||
| LRP | -0.959** | -0.850** | -0.688** | -0.618** | -0.614* | NS | NS | |||||
| NRP | 0.825** | 0.779** | 0.610* | 0.682** | -0.531* | 0.539* | ||||||
| β-caroteno | 0.587* | 0.567* | 0.514* | NS | NS | |||||||
| FT | 0.625** | 0.817** | -0.570* | 0.525* | ||||||||
| FV | 0.640* | NS | NS | |||||||||
| PrT | -0.683** | NS | ||||||||||
| CAT | NS |
* Significativo en los niveles p ≤ 0.05. ** Altamente significativo en los niveles de p ≤ 0.01. NS: no significativo.
Pigmentos fotosintéticos
Los resultados de contenido de pigmentos fotosintéticos en L. hexandra expuesta a hidrocarburos del petróleo presentaron variaciones significativas entre tratamientos (Tabla 2). La clorofila a aumentó 61.3 y 52.3% cuando se expone en suelos contaminados con 30 y 60 g kg-1 HTP respectivamente, además de un 43.5 % cuando se expone a 90 g kg-1 HTP, aunque este incremento estadísticamente no se diferenció del control. La clorofila b aumentó un 57.5 y 47.9 % con la exposición a 30 y 60 g kg-1 HTP, en dosis de 90 g kg-1 HTP la respuesta fue estadísticamente igual al control. En cuanto a clorofila total una tendencia creciente se observa en los mismos tratamientos que clorofila a y b, el tratamiento con 30 g kg-1 HTP indujo un aumento del 60.1 %, mientras que la concentración con 60 g kg-1 HTP mostró un aumento del 51 %, con respecto a 90 g kg-1 HTP la respuesta no fue estadísticamente diferente al control. Con relación al contenido de β-caroteno aumentó por efecto del petróleo (r = 0.843**) (Tabla 3) un 77.8 y 107.8 % en suelos con 60 y 90 g kg-1 HTP, respectivamente, además de un 47.8 % con la aplicación de 30 g kg-1 HTP (Tabla 2). Los pigmentos fotosintéticos fueron afectados positivamente por el suelo con petróleo fresco; con un aumento del 52.3, 47.9, 51 y 77.8 % en clorofila a, clorofila b, clorofila total y β-caroteno respectivamente.
Efecto de los hidrocarburos de petróleo sobre los compuestos antioxidantes no enzimáticos
El contenido de vitamina C en las hojas aumento en un 6.1% con la dosis más baja de HTP (30 g kg-1) respecto al suelo sin HTP, en concentraciones de 60 y 90 g kg-1 HTP la respuesta fue estadísticamente similar al control (Fig. 1a). En cuanto a los fenoles totales se incrementó por la aplicación de la dosis más alta de HTP (r=0.812**) (Tabla 3). Hubo una estimulación del 48.5% con el tratamiento más alto (90 g kg-1 HTP), mientras que las concentraciones de 30 y 60 g kg-1 HTP fueron estadísticamente igual al control (Fig. 1b). Los flavonoides en hojas se incrementaron significativamente por efecto de las concentraciones de los HTP (r=0.678**) (Tabla 3). Se indujo un aumento de 34.9% tras la exposición a 90 g kg-1 HTP con respecto al control, asimismo, de un incremento del 26.4% en 30 g kg-1 HTP (Fig. 1c), el tratamiento con 60 g kg-1 HTP no se diferenció significativamente del control.
Fig. 1 Compuestos antioxidantes no enzimáticos de VC (a). FT (b) y FV (c) de L. hexandra expuesta a hidrocarburos del petróleo. Barras con letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (Tukey, p ≤ 0.05, n = 4).
Efecto de los hidrocarburos del petróleo sobre la proteína total y actividad enzimática
Se observaron diferencias significativas por efecto de los hidrocarburos del petróleo en el contenido de proteína total (r=0.716**) (Tabla 3). El contenido aumentó 27.1% cuando se encontró expuesta a 90 g kg-1 HTP, las dosis de 30 y 60 g kg-1 HTP no fueron estadísticamente diferentes al suelo sin HTP (Fig. 2a). Se observaron diferencias significativas en la actividad enzimática en hojas por la exposición de hidrocarburos del petróleo (Fig. 2). Los valores de la catalasa en hojas disminuyeron con el incremento de la concentración de HTP (r= -0.530*) (Tabla 3). Cuando la planta fue expuesta a 90 g kg-1 HTP indujo una disminución del 30 % de la actividad de catalasa en comparación con el control, mientras que las concentraciones de 30 y 60 g kg-1 HTP estadísticamente fueron similar al control (Fig. 2b). Por otro lado, la actividad de fenilalanina amoníaco liasa, la mayor disminución (23.4%) se observó en suelo con 30 g kg-1 HTP respecto al control, los tratamientos 60 y 90 g kg-1 HTP no se diferenciaron significativamente del control (Fig. 2c).
Concentración de H2O2
La concentración del H2O2 en las hojas se incrementó significativamente (p < 0.05) por la aplicación de los hidrocarburos del petróleo (r = 0.507*) (Tabla 3). En dosis de 60 y 90 g kg-1 HTP presentaron una estimulación del 13.7 y 15.3% más alto que suelo sin contaminación (0 g kg-1 HTP), aunque este incremento estadísticamente no se diferenció del control (Fig. 3).
Discusión
En las plantas, la contaminación con petróleo fresco en el suelo induce estrés oxidativo, reduce la altura, deformación foliar, inhibición del comportamiento radicular, densidad de tallos, tasa fotosintética y la biomasa, además produce necrosis vegetal por intoxicación de compuestos aromáticos de bajo peso molecular, cuando estos dañan las membranas celulares de las raíces (Cai et al., 2010; Nardeli et al., 2016; Sangeetha & Thangadurai, 2014). Los resultados obtenidos en esta investigación indicaron que el desarrollo de plantas de L. hexandra fue impactado negativamente en la altura, LRP y la producción de MFA por la aplicación del petróleo fresco en el suelo. Este efecto también fue reportado por Orocio-Carrillo et al. (2019), al evaluar a L. hexandra al día 180 la altura y LRP al exponerlo a 238 g kg-1 HTP, causando su inhibición. La reducción de la altura vegetal es una respuesta encontrada por Rivera-Cruz & Trujillo-Narcía (2004), Sangabriel et al. (2006) y Cartmill et al. (2014) en los pastos Echinochloa polystachya, Brachiaria mutica, Panicum maximum y Lolium multiflorum expuestos a altas concentraciones de HTP en condiciones controladas. La reducción observada en longitud radical de planta también está en conformidad con investigaciones realizadas en pastos forrajeros como Megathyrsus maximus, Urochloa brizantha y Brachiaria brizantha, expuestas a estrés por petróleo (Hernández-Valencia et al., 2017; Merkl et al., 2005). Este efecto negativo se atribuye a los altos contenidos de hidrocarburos que modifican la humedad, conductividad eléctrica, capacidad de intercambio catiónico, carbón orgánico y los poros del suelo, lo que limita el acceso nutrimental para el crecimiento de la raíz (Adams et al., 2008, 2015; Martínez & López, 2001; Zamora et al., 2012).
Si bien se ha observado un efecto negativo sobre la altura, MFA y LRP, se estimularon otras variables de crecimiento, como el NRM, NRP y la producción de MFR. Esta estimulación posiblemente se asocia a una reacción al estrés en L. hexandra inducido por el petróleo la cual probablemente induce la activación de la biosíntesis hormonal como las auxinas, que actúan para promover el desarrollo de los brotes y raíces laterales en las plantas y la biosíntesis de etileno que promueve el aumento del número de raíces (Escaso et al., 2010). Da Silva & Teresinha (2021) mencionan que algunas plantas cuando se encuentran expuestas en ambientes contaminados con aceite, estas pueden desarrollar respuestas a la escasez de agua y oxígeno a las que están sometidas, como cambios en las raíces, tallos y hojas. Estos cambios pueden interpretarse como estrategias desarrolladas por las plantas para tolerar los efectos tóxicos del petróleo.
Esta respuesta de las plantas a la exposición de hidrocarburos del petróleo ha sido reportada por diversos investigadores (Adams et al., 2015; Arias-Trinidad et al., 2017; Orocio-Carrillo et al., 2019) quienes indican que los efectos pueden ser negativos y/o positivos según la concentración de HTP en el suelo, además, debido a que es un suelo con alto contenido de materia orgánica, esta puede absorber toxinas, reduciendo así su biodisponibilidad, por lo tanto, la materia orgánica puede reducir los efectos de los hidrocarburos en las plantas (Pezeshki et al., 2000). Al respecto, este efecto estimulatorio conforme al incremento de la concentración del petróleo también fue reportada por González-Moscoso et al. (2017) al encontrar un aumento del 76.2 y 85.7 % en el NRM en L. hexandra al exponerlo durante 180 días a 60 y 90 g kg-1 HTP. La relación altamente significativa y positiva de MFR con HTP (r= 0.882**), NRP (r= 0.868**), β-caroteno (r= 0.674**), FT (r= 0.652**) y FV (r= 0.768**) indica que L. hexandra es una planta que, en condiciones de estrés por hidrocarburos de petróleo, mejora su sistema radical y estimula compuestos antioxidantes no enzimáticos para tolerar condiciones ambientales adversas. Da Silva & Teresinha (2021) reportaron que la biomasa de las raíces de E. polystachya se vio estimulada por la presencia de petróleo en el suelo a una concentración de 100 g kg-1 durante 60 días en invernadero. Hou et al. (2001) encontraron que la biomasa de raíz fresca de Lolium perenne L. al ser expuesto después de 120 días a 6.4 g kg-1 HTP solo se vio ligeramente afectada, aunque el crecimiento de los brotes se vio obstaculizado con una disminución del 70.1 % en su biomasa. Tadeo & Gómez-Cadenas (2008) mencionan que al momento de presentarse el estrés se disparan los mecanismos de adaptación necesarios para hacerle frente. De acuerdo con la intensidad y la duración a la situación de estrés, así como del momento en que desaparece, la planta alcanza un nuevo estado fisiológico óptimo para las condiciones expuestas.
Los resultados mostraron que los contenidos de pigmentos fotosintéticos en L. hexandra fueron estimulados por la presencia de HTP en el suelo. Experimentos realizados en condiciones controladas mostraron que la reducción del contenido de pigmentos de las hojas en las plantas es una respuesta clave para detectar el estrés producido por la presencia de los hidrocarburos (Noomen et al., 2006; Noomen & Skidmore, 2009). Esta reducción puede explicarse debido a que los hidrocarburos tienden a acumularse en los cloroplastos, ya que las moléculas del petróleo crudo pueden penetrar a través de las raíces viajando al espacio intracelular y posiblemente al sistema vascular dañándose las membranas celulares, provocando la fuga del contenido celular y la posible entrada del aceite en las células (Baker, 1970). Sin embargo, el estudio actual reveló que las concentraciones de 30 y 60 g kg-1 HTP incrementaron los contenidos de clorofila a, b y total, asimismo, de un aumento significativo en dosis de 90 g kg-1 HTP de β-caroteno. Estudios han encontrado que pastos plantados en suelos con HTP mostraron diferencias significativas en el contenido de pigmentos fotosintéticos con respecto al control, se mostró la capacidad de la planta para adaptarse al estrés por contaminación de HTP (Da Silva & Teresinha, 2021; González-Moscoso et al., 2017).
El estudio actual reveló que la contaminación de suelo con 90 g kg-1 de HTP condujo a un aumento de fenoles totales y flavonoides en hoja de L. hexandra, resultados similares son reportados por Noori et al. (2012) y Skrypnik et al. (2021) en Chrysanthemum leucanthemum y Secale cereale L., expuestas a petróleo en relación con el control. Otros resultados informan incremento de fenoles al estrés por metales pesados (Handa et al., 2018, 2019; Leng et al., 2015; Maslennikov et al., 2018). Este incremento de antioxidantes no enzimáticos, le permite a la planta resistir a factores de estrés (Dangles, 2012; Dehghanian et al., 2022; Naikoo et al., 2019; Sharma et al., 2019) y neutralizar a las ERO, al respecto en esta investigación se encontró relación positiva significativa entre fenoles totales y H2O2 (r= 0.525*) (Tabla 3), propiedad que le confiere la posibilidad de ser una planta con propiedades antioxidantes para neutralizar las ERO como ha sido reportado por Radyukina et al. (2019) en plantas resistentes al estrés.
El efecto positivo de 90 g kg-1 HTP en la acumulación de PrT en hojas de L. hexandra son similares a lo reportado por Orocio-Carrillo et al. (2019) al encontrar un aumento de proteína en suelo con 238 g kg-1 HTP, indica que la presencia de HTP estimula la síntesis de aminoácidos y proteínas en las células vegetales, similares resultados reportan Peretiemo-Clarke & Achuba (2007), Al-Hawas et al. (2012) y Achuba & Ja-anni (2018) en Arachis hipogea, Simmodsia chinensis y Vigna unguiculata L. en suelo con petróleo crudo. Achuba (2006) menciona que el aumento de esta macromolécula indica estrés metabólico.
La resistencia de las plantas para controlar el nivel y los efectos de las ERO al estrés, está asociada al aumento en la actividad de antioxidantes enzimáticos (Huang et al., 2019; Xie et al., 2019). El estudio reveló disminución de actividad de CAT y PAL en L. hexandra en la mayor dosis de HTP (90 g kg-1), similar efecto para CAT fue reportado por Achuba (2014) en Vigna unguiculata y Zea mays expuesta a queroseno, y Rusin et al. (2018) en Triticum aestivum L expuestas a aceite de motor y diésel. La respuesta en PAL fue similar a lo reportado por Chinmayee et al. (2014) en Jatropha curcas L. y Jańczak-Pieniążek et al. (2023) en Triticum aestivum L. expuestas a suelo contaminado con metales pesados. Esta disminución de las enzimas antioxidantes cuando la planta se expone a contenido altos de hidrocarburos del petróleo, aun no existen explicación científica, sin embargo, se informa que la baja síntesis de ella limita la protección de la planta a los daños oxidativos ocasionados por las ERO como el H2O2, que se incrementan en célula vegetal expuesta a factores ambientales desfavorables (Gill & Tuteja, 2010; Xie et al., 2019).
El estudio actual reveló que la contaminación del suelo a altas concentraciones de HTP no indujo estrés oxidativo debido a que el contenido de H2O2 en hojas de L. hexandra, no mostraron cambios significativos por altas concentraciones de HTP (60 y 90 g kg-1). Esto permite deducir que L. hexandra controla bajo condiciones de estrés la sobreproducción de H2O2 incluido en los ERO que causan daños oxidativos a las estructuras celulares cuando las plantas están expuestas a factores ambientales desfavorables (Gill & Tuteja, 2010; Xie et al., 2019). Resultados diferentes fueron reportados por Skrypnik et al. (2021), estos autores encontraron aumento en los contenidos de H2O2 en los brotes de dos variedades de centeno (Krona y Valdai) cultivadas en suelos contaminado con hidrocarburos del petróleo. Hernández-Ortega et al. (2021) reportaron que el estrés inducido por diésel resultó en una mayor producción de H2O2 en Melilotus albus. Así mismo, hay reportes que indican un aumento de H2O2 en plantas expuestas a metales pesados (Ivanishchev & Abramova, 2015; Liu et al., 2015; Martínez-Peñalver et al., 2012).
Conclusiones
Los resultados mostraron que la aplicación de HTP en el suelo natural indujo respuestas positivas en L. hexandra, estimulándose el número de retoños en el macollo, materia fresca radical, número de raíces primarias, pigmentos fotosintéticos y proteína total. Por el contrario, la elevada concentración de HTP al día 180 causó la disminución significativa de la altura, materia fresca aérea y la longitud de raíz primaria de L. hexandra. Esta investigación muestra que L. hexandra expuesta a dosis altas de HTP (60 y 90 g kg-1) no induce estrés oxidativo debido a que el contenido de peróxido de hidrógeno en estas concentraciones no fueron estadísticamente diferentes al control, esto pudiera estar relacionado a la relación positiva que tiene con los compuestos fenólicos totales por consecuencia de la contaminación del suelo por petróleo. La estimulación inducida por los HTP al día 180 en parámetros de crecimiento (número de retoños en el macollo y número de raíz primaría), producción (materia fresca radical), pigmentos fotosintéticos y la relación positiva que tiene el peróxido de hidrogeno con los fenoles totales en hojas L. hexandra, indican adaptación de L. hexandra a condiciones de estrés con 90 g kg-1 de HTP.
