Preparación del extracto

Las plantas fueron obtenidas del Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Fitomejoramiento, Toluca, Estado de México. Se seleccionaron plantas de Agave tequilana (ATE), A. cupreata (ACU) y A. salmiana (ASA) de las cuales se recolectaron hojas de cada especie, se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 3% y se enjuagaron con agua destilada estéril. Posteriormente, las hojas se colocaron en un horno de secado a 45°C por tres meses para su deshidratación. Después de este periodo, se preparó el extracto acuoso de hoja para cada una de las especies de Agave: se mezcló 0.5 g de las hojas con 100 ml de agua destilada estéril y se calentó hasta punto de ebullición durante 1 minuto. Los extractos se filtraron diez veces y se realizó un segundo filtrado utilizando una unidad de ultrafiltración Amicon de 30 kDa para purificarlos.

Biosíntesis de AgNPs

Para la biosíntesis de nanopartículas se utilizó la metodología propuesta por ^{González-Pedroza et al (2021)}, se utilizó una solución acuosa 0.1 mM de nitrato de plata (Sigma-Aldrich) y extractos de ATE, ACU y ASA en relación 0.1g de biomasa/mL. La biosíntesis, consiste en una reacción redox en la cual el agente reductor son los extractos acuosos y el agente oxidante es la sal precursora, las cuales se hacen reaccionar a punto de ebullición y pH neutro, para estos experimentos se utilizaron seis concentraciones de relación volumen de Ag: volumen de extracto (5:5, 5:3, 3:4, 2:5, 1:5 y 3:5), para las tres especies.

Ensayo antibacteriano

Para evaluar la actividad antibacteriana se siguió la prueba de sensibilidad de Kirby-Bauer, se extendieron 2 mL de suspensión de Bacillus licheniformis que contenía 1.8 x 10⁵ UFC/mL sobre placas Petri con medio agar. Se colocaron discos con las seis concentraciones de extractos de AgNPs biosintetizadas a partir de ATE, ACU y ASA (Tabla 1), cada disco de 6 mm contenía 10 µl de AgNPs. Las placas petri que contenían los tratamientos del bioensayo se incubaron a 28°C durante 24 horas. Después de este periodo, se midió el halo de inhibición generado por las AgNPs sobre B. licheniformis.

Caracterización de AgNPs

Se realizó un análisis espectroscópico UV-Vis para monitorear la formación de AgNPs utilizando un espectrofotómetro UV-Vis (espectrofotómetro VE-5100UV, VELAB EE. UU.) Se analizó en un rango de 200 a 800 nm, en modo de absorción.

Las propiedades estructurales de las nanoestructuras formadas, tales como morfología, tamaño de partículas y distribución de estas; fueron caracterizadas mediante un microscopio electrónico de transmisión (TEM) JEM 2010. El análisis elemental de las nanopartículas se evaluó mediante espectroscopia de rayos X de dispersión de energía (EDS).

Análisis estadístico

Los experimentos incluyeron un diseño totalmente aleatorio, con tres repeticiones y se realizaron por triplicado. Los datos obtenidos del ensayo antibacteriano se sometieron a un análisis de varianza seguido de una prueba de Tukey (P≤0.05) utilizando el software Stathgraphics versión Centurion.

Actividad antibacteriana

La actividad antibacteriana de AgNPs biosintetizadas a partir de extractos de agave se evaluó frente a B. licheniformis, una bacteria grampositiva. Se encontró que las AgNPs biosintetizadas a partir de extracto de agave inhiben el crecimiento de B. licheniformis (Figura 1). Se sabe que el mecanismo antibacteriano general de la plata es mediante la degradación de la pared celular y la inhibición de la actividad enzimática intracelular (^{Morales-Luckie et al., 2016}). También se ha propuesto que los iones de plata liberados de las nanopartículas de plata pueden inactivar la replicación del ADN y provocar la inhibición de las funciones enzimáticas como resultado de su interacción con restos de fósforo en el ADN (^{Sánchez-Vieyra et al., 2023}).

Figura 1 Gráfica de comparación de medias del efecto antibacteriano de AgNPs biosintetizadas con tres especies de Agave (A. cupreata= ACU, A. tequilana=ATE, A. salmiana= ASA).  

Los análisis estadísticos (P≤0.05) mostraron que el mayor halo de inhibición hacia B. licheniformis con las AgNPs biosintetizadas fue con ATE cuyo halo fue de 2.9 mm, seguido de ACU con 1.9 mm; mientras que, con ASA, no se observó halo de inhibición. Esto evidencia una actividad antibacteriana diferente según el extracto de agave utilizado. La diferencia en la actividad antibacteriana del extracto de la planta depende de la variación de los componentes químicos presentes en el Agave (^{Ahumada-Santos et al., 2013}; ^{García-Morales et al. 2022}). Los principales compuestos bioactivos del género Agave son los polifenoles que engloban un gran grupo de compuestos, como flavonoides, quinonas, ácidos fenólicos, flavanoles, flavonas y taninos (^{Moreno-Luna et al., 2022}).

No se observó diferencia estadística en la aplicación de las seis concentraciones usadas en la biosíntesis de AgNPs con ATE para el control de B. licheniformis. Para el caso de ACU, se observó que el menor halo de inhibición se obtuvo en las concentraciones: 1 (5:5), 2(5:3) y 3 (3:4), mientras que para la concentración 5 (1:5) que presenta un mayor contenido de extracto de hoja se observó un aumento significativo con un valor de 2.9 mm de halo de inhibición (Figura 2B).

Figura 2 Gráfica de comparación de medias del efecto antibacteriano de AgNPs biosintetizadas utilizando seis concentraciones de relación volumen Ag: volumen extracto. A) A. tequilana y B) A. cupreata. 1= 5:5, 2= 5:3, 3= 3:4, 4= 2:5, 5= 1:5 y 6= 3:5. 

Estos resultados concuerdan con lo reportado por ^{López-Naranjo et al. (2018)} quienes lograron mejorar la capacidad antibacteriana de AgNPs sobre Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa utilizando una concentración alta de extracto de agave, lo que genero la presencia de un mayor contenido de AgNPs.

Caracterización de AgNPs

Los espectros de absorción de nanopartículas de plata suelen mostrar una banda de absorción de resonancia de plasmón entre longitudes de onda de 392 y 492 nm (^{Chowdhury et al., 2016}), lo que corrobora la presencia de AgNPs biosintetizadas en el presente trabajo.

Los valores de absorbancia para ATE en las seis concentraciones oscilaron de 0.5- 1.2 (Figura 3A), para ACU de 0.2 - 0.3 (Figura 3B), y en ASA se obtuvieron los valores más altos (1.2-3.5) (Figura 3C) que pudieran estar relacionados con un mayor tamaño de partícula (5.6 nm). Se sabe que las ligeras variaciones en los valores de absorbancia están relacionadas con cambios en el tamaño y la concentración de las partículas (^{Tripathy et al., 2010}) causados ​​por variaciones en la cantidad de metabolitos presentes en las especies (^{Asimuddin et al., 2020}).

Figura 3 Espectros de rango UV-Vis de AgNPs biosintetizadas a partir de extractos de tres especies de Agave: A) A. tequilana, B) A. cupreata y C) A. salmiana, utilizando seis concentraciones de relación volumen Ag: volumen extracto. 1= 5:5, 2= 5:3, 3= 3:4, 4= 2:5, 5= 1:5 y 6= 3:5. 

Las imágenes TEM de las AgNPs se obtuvieron únicamente en la concentración 5 (1:5) de las tres especies de Agave. Se obtuvieron AgNPs cuasi esféricas con un tamaño de 3.5 nm, 2.1 y 5.6 para ATE (Figura 4A y B), ACU (Figura 4D y E) y ASA (Figura 4G. y H), respectivamente. Por otro lado, el histograma de distribución de tamaño de las AgNPs biosintetizadas a partir de ATE osciló entre ~1 y 20 nm (X = 3,5 nm, σ = 2 nm, Figura 4C), para ACU osciló entre ~0,5 y 11,5 nm (X = 2,1 nm, σ = 0,8 nm, Figura 4.F), y en ASA osciló entre ~1 y 50 nm (X = 5,6 nm, σ = 6 nm, Figura 4I).

La forma, el tamaño y la cantidad de nanopartículas tienen un efecto sobre el potencial antimicrobiano de las nanopartículas de plata (^{Iravani et al., 2014}). El tamaño de las nanopartículas metálicas garantiza que una superficie significativamente grande de las partículas esté en contacto con el efluente bacteriano.

Figura 4 Imágenes TEM de nanopartículas de plata biosintetizadas a partir de tres especies de Agave: A-B) A. tequilana, D-E) A. cupreata, G-H) A. salmiana y C, F, I) histograma de distribución de tamaño de AgNPs, respectivamente. 

La mayor aglomeración de AgNPs se obtuvo al utilizar el extracto de ASA como agente reductor. Sin embargo, cuando se utilizaron extractos ATE y ACU, no se observó aglomeración de partículas, lo que confirma la estabilidad de las soluciones de AgNPs (^{Chowdhury et al., 2016}). La estabilidad se considera una cuestión crucial con respecto a la aplicación de AgNPs, ya que la generación de agregados conduce a la pérdida de actividad antibacteriana (^{Kvítek et al. 2008}).

El análisis EDS proporciona el estado cualitativo y cuantitativo de los elementos que pueden estar involucrados en la formación de nanopartículas. Generalmente, los nanocristales de plata metálica muestran un pico típico de alrededor de 3 keV correspondiente al elemento Ag (^{Ibrahim, 2015}), como se muestra en la Figura 4, lo que confirma la existencia de este último.

Figura 5 Perfil EDS de AgNPs biosintetizadas a partir de tres especies de Agave: A) A. tequilana, B) A. cupreata y C) A. salmiana.